一组可降解聚乙烯塑料的祖先漆酶

技术领域

本发明涉及一组可降解聚乙烯塑料的祖先漆酶，属于生物技术领域。

背景技术

聚乙烯(Polyethylene，PE)是一种热塑性塑料，由乙烯分子聚合而成。依聚合方法、分子量和侧链结构差异，PE可分为高密度聚乙烯(HDPE)、低密度聚乙烯(LDPE)及线性低密度聚乙烯(LLDPE)。PE应用广泛，但同时也产生了大量的PE塑料废弃物。目前塑料废弃物的处理方法主要包括填埋、焚烧、机械回收和化学回收，但通常会导致环境污染，并存在成本高昂和回收塑料重复性差等问题。目前已报到多种可降解PE塑料的微生物，它们通过胞外酶将PE聚合物分解成能被细胞利用的低聚物，进入微生物体内后进一步代谢生成CO

PE材料有着致密的空间结构，现有技术中报道了经UV或者高温处理后，部分真菌漆酶和细菌漆酶BaLac和BsLac在添加介体条件下可以降解PE塑料，预处理及介体添加程序复杂，不利于应用。近来，也有研究发现PsLAC(Psychrobacter sp.NJ228)、Lysinibaccillus fusiformis(LfLAC3)、LMCO2 and LMCO3等细菌漆酶，对于未经预处理的PE塑料在无介体条件下也可以部分降解(Computer-aided discovery of a novelthermophilic laccase for low-density polyethylene degradation)。然而，上述报道的细菌漆酶总体PE塑料降低效率仍较低。挖掘具有高PE降解活性的漆酶仍十分迫切。

发明内容

为了解决现有技术存在的不足，本发明通过祖先序列重建，获得了高PE降解效率的突漆酶蛋白，本发明获得的蛋白并不来自自然界已有蛋白，而是源于祖先序列重建方法获得的，本发明获得的突变体在PE降解方面存在着良好的应用前景。

本发明提供了一种漆酶蛋白，所述漆酶蛋白为以下(a)-(d)任一所示：

(a)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的漆酶蛋白Anc44；

(b)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的漆酶蛋白Anc46；

(c)氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的漆酶蛋白Anc54；

(d)氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的漆酶蛋白Anc58。

本发明还提供了编码所述漆酶蛋白的基因。

本发明还提供了携带所述基因的重组质粒。

本发明还提供了表达所述漆酶蛋白的重组细胞。

在一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌为宿主。

在一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET系列质粒为表达载体。

本发明还提供了一种生产漆酶蛋白的方法，所述方法包括：

(1)将所述重组大肠杆菌接种至培养基中，加入Cu

(2)收集步骤(1)所得发酵液，分离获得细胞，破碎细胞，得到漆酶蛋白。

在一种实施方式中，所述步骤(1)的培养温度为于30～37℃。

在一种实施方式中，所述步骤(1)的诱导温度为15-30℃，优选为20℃。

在一种实施方式中，所述步骤(1)中诱导时间为10-30h，优选为24h。

在一种实施方式中，所述步骤(1)中的培养基包括但不限于LB培养基。

在一种实施方式中，所述步骤(1)中的Cu

在一种实施方式中，所述步骤(1)诱导条件优选为20℃诱导24h。

在一种实施方式中，所述步骤(2)中破碎优选为高压匀质破碎。

在一种实施方式中，还对上述方法所得漆酶蛋白进行了纯化，所述纯化为Ni

本发明还提供了一种PE降解方法，所述方法为将上述漆酶蛋白与聚乙烯接触，降解聚乙烯。

在一种实施方式中，所述聚乙烯经过了预处理，所述预处理包括将聚乙烯以乙醇浸泡。

在一种实施方式中，所述降解的反应pH为3.0-7.0。

本发明还提供了所述漆酶蛋白，或所述重组细胞，或所述方法在PE降解中的应用。

有益效果：

(1)本发明通过祖先序列重建，得到了Anc44,Anc46，Anc54，Anc58所示的全新的漆酶蛋白，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示。

(2)本发明构建得到的漆酶蛋白，可以高效降解PE，经本发明漆酶蛋白水解后，PE的羰基吸光度达到了1.18％以上，羟基吸光度达到了0.23％以上，PE膜表面原子比率％(C/O)达到了98.37/1.63以上，PE膜褶皱原子比率％(C/O)达到了97.91/2.09以上，具体降解效果如表1、表2所示。

(3)本发明得到的漆酶蛋白，显示出了良好的PE降解性能，并且可以处理不经高温处理的PE材料，且反应无需添加介体，更适于工业化应用。

附图说明

图1祖先漆酶(Anc44,Anc46,Anc54,Anc58)的SDS蛋白质电泳图。

图2为祖先漆酶的最适温度和pH值。(a)祖先漆酶的最适温度。(b)祖先漆酶的最适pH值。

图3为在pH3.0下，祖先漆酶降解PE塑料后的扫描电镜图像。每种祖先漆酶对应的扫描电镜图尺寸分别为10μm和2μm。Control1为没有经过漆酶处理的PE塑料,Control2没有经过漆酶处理但是划伤处理的PE塑料，其余分别对应于漆酶Anc44,Anc46,Anc54,Anc58。

图4为在pH3.0下，祖先漆酶处理LLDPE薄膜后的傅立叶变换红外光谱。(a).LLDPE薄膜的整体傅立叶变换红外光谱。(b).羰基的傅立叶变换红外光谱。(c).羧基的傅立叶变换红外光谱。

具体实施方式

红外检测方法：

采用傅里叶红外(Thermo Scientific Nicolet 6700，American)来检测PE膜的中间区域(大于2-3mm的圆)。在干燥的环境中，将PE膜表面紧贴于ATR附件的晶体面上，置于光谱仪的光路中。扫描空气背景，然后在以下参数下采集红外光谱：分辨率4cm

以含氧基团指数评估PE降解效果，含氧基团指数包括羰基指数和羟基指数，其中羰基指数定义为在1718cm

电镜检测方法：

采用扫描电子显微镜(TESCAN CLARASEM，German)来观察PE膜表面形貌。样品通过电胶布固定在样品台上，关上舱门后抽真空，找到对应编号的样品，寻找拍摄区域，在15keV的高电压和30pA的束流下获得SEM图像。在拍摄区域，对PE膜的平滑表面和氧化褶皱处选取位置进行SEM能谱点扫，分析C和O元素的原子占比。

酶活力测定方法(以ABTS为底物)：

漆酶酶活测量的总体系为0.5mL：1.5mL的PE管中依次加入0.40mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(50mmol·L

实施例1：祖先漆酶及其突变体表达菌株的构建、蛋白表达、纯化和表征

(1)祖先漆酶表达质粒构建

基于大肠杆菌密码子偏好性合成祖先漆酶序列(祖先漆酶Anc44、Anc46、Anc54、Anc58氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示)并克隆至pET-28(a)载体NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点上，得到相应表达质粒。

(2)分别将步骤1得到的表达质粒转化至E.coli BL21中进行蛋白表达，方法如下：

1)将重组菌接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃培养12h；2)按照2％接种量(v/v)，将步骤1)所得培养液转接至TB培养基(50μg·mL

离心收集上述方法得到的细胞，重新悬浮在4℃的PBS buffer(50mmol/L,pH 7.5)中并进行高压匀质破碎。菌体破碎后，在11,000×g下4℃进行离心30min收集上清液，通过Ni

以上述酶活力反应体系，在不同温度和pH条件下，检测Anc44、Anc46、Anc54、Anc58的最适反应温度和最适反应pH，结果如图2所示。图2(a)Anc44、Anc46、Anc54、Anc58的最适温度分别为70℃、70℃、60℃和80℃。最适反应pH结果如图2(b)所示，Anc46的最适pH都为4.0，其余的最适pH都为3.0。

实施例2：PE膜的降解效果检测

将线性低密度聚乙烯膜(LLDPE)films(Wanhua Chemical Group，YanTai，China)剪成1cm

(1)祖先漆酶PE降解效果检测

1)红外检测PE降解结果

结果如图3所示，未经过漆酶处理过的PE膜表面光滑，无褶皱存在，经过划伤处理的PE膜有明显的PE膜碎片出现，边缘分明，有明显的划痕效果，没有褶皱出现。结果显示经过漆酶处理过的PE膜有褶皱存在，褶皱形状不规则，往内部凹陷，且一连串出现。不同祖先漆酶的最大羰基峰和羟基峰透过比及碳基指数和羟基指数如表1所示，其中，Anc44在所有的祖先漆酶中对PE的降解效果最好，它的最大羰基峰和羟基峰吸光度分别为2.99％和1.31％，羰基指数和羟基指数分别为0.29和0.20(图4)。

表1不同祖先漆酶最大羰基峰和羟基峰透过比、碳基指数和羟基指数

2)扫描电镜能谱扫描检测PE降解结果

扫描电镜能谱扫描结果如表2所示，经过祖先漆酶处理后，PE膜表面氧原子数的占比大于未处理的PE膜表面氧原子占比。表面碳氧元素占比，氧元素含量越高，说明降解程度越高。这说明漆酶改变了PE膜表面的元素组成，将氧元素引入到PE膜中。经过漆酶处理过的PE膜褶皱处的氧原子占比高于膜表面。

表2SEM-EDS能谱检测在pH 3.0经祖先漆酶处理LLDPE塑料的碳和氧元素占比，注：表中Surface表示PE膜表面，Wrinkle表示PE膜褶皱

上述结果表明，本发明通过祖先序列重建得到的漆酶Anc44、Anc46、Anc54、Anc58可以高效降解PE，并且本发明构建得到的漆酶在PE降解中，不需要对PE进行高温预处理，也不需要添加介体。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。