检测唾液样本中人绒毛膜促性腺激素的检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及体生物检测技术领域，具体涉及检测唾液样本中人绒毛膜促性腺激素的检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

人绒毛膜促性腺激素(HCG)是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，它是由α和β二聚体的糖蛋白组成。分子量为36700的糖蛋白激素，α亚基与垂体分泌的FSH(卵泡刺激素)、LH(黄体生成素)和TSH(促甲状腺激素)等基本相似，故相互间能发生交叉反应，而β亚基的结构各不相似。成熟女性因受精的卵子移动到子宫腔内着床后，形成胚胎，在发育成长为胎儿过程中，胎盘合体滋养层细胞产生大量的HCG，可通过孕妇血液循环而排泄到尿、唾液中。当妊娠1～2.5周时，HCG水平即可迅速升高，第8周孕期达到高峰，至孕期第4个月始降至中等水平，并一直维持到妊娠末期。唾液是一种无色液体，密度在1.002～1.012g/L，pH约为6.642。唾液主要由低相对分子质量有机物质、激素和无机物组成。唾液中丰富的有机化合物主要由蛋白质、脂质等组成。唾液中的激素种类繁多，血液中的大多数激素能在唾液中进行测定，包括皮质醇、睾酮、脱氢表雄酮、雌激素以及醛固酮等。多数物质在唾液中的含量是血液中的1/10～1/1000。与传统的尿检或血检方式相同，唾液孕检试剂盒的检测目标也是人绒毛膜促性腺激素，唾液检测技术具有较高的准确性，可在错过月经的第一天之后判断是否怀孕。当下血检需要在医疗机构进行，尿检条则面临卫生和隐私问题，唾液检测在便利性等“用户体验”上有一定的优势。

现有技术方法在HCG现有检测方法中，胶乳凝集抑制试验(AIT)该方法试剂易得、简便，5分钟可以完成检测，但一般早孕检查，敏感性低且不能定量，临床已经很少应用。红细胞凝集抑制试验(HAIT)试剂条件要求高2小时完成，敏感性低，临床已经少用。放射免疫试验(RIA)要求一定设备，条件要求高2小时完成，试剂可定量，最灵敏，但因辐射已逐渐淡出市场应用。目前临床比较常用的测量方法有以下2种：化学发光法和免疫层析胶体金法，这些方法，灵敏度好、费用低、检测快，被临床广泛应用。

目前化学发光法主要检测血清或血浆样本中的人绒毛膜促性腺激素，因其检测灵敏度高、特异性好，需要专业的人员操作大型的检测设备和抽血操作，主要应用在医院等医疗机构，是医疗机构检测HCG的金标准方法。免疫层析胶体金法主要是检测尿液样本中的人绒毛膜促性腺激素，胶体金法因为操作方便、快捷、不需要专业设备和人员，被广泛应用在家庭自测和医疗单位。但针对唾液检测HCG，国内尚没有同类产品。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供检测唾液样本中人绒毛膜促性腺激素的检测试剂盒及其制备方法，本发明提供的检测试剂盒灵敏度高，在家用自测应用场景中，给使用者提供比尿液样本早孕试纸更加方便、快捷的检测方法。

本发明提供了检测人绒毛膜促性腺激素的免疫层析试纸，包括样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫和底板；

所述结合垫上设置有标记了第一HCG单克隆抗体的纳米显色颗粒；

所述NC膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上包被有第二HCG单克隆抗体，所述质控线上包被有与所述第一HCG单克隆抗体结合的非人源IgG抗体；

所述纳米显色颗粒包括纳米胶体金颗粒或纳米铂金颗粒；

所述第一HCG单克隆抗体和所述第二HCG单克隆抗体独立地选自α-HCG单克隆抗体或β-HCG单克隆抗体。

与现有技术相比，本发明采用的检测试纸条，采用灵敏度高的纳米显色颗粒，同时搭配各抗体之间的特异性结合，能够进一步有效的检测人唾液样本中的人绒毛膜促性腺激素，从而获得更准确的技术效果。

在一些实施例中，所述纳米显色颗粒为粒径180～300nm的纳米铂金颗粒。在一些具体实施例中，所述纳米显色颗粒为粒径250nm的纳米铂金颗粒

实验表明，在上述粒径范围的纳米铂金颗粒用于检测时灵敏度最高，且无非特异性反应，从而获得更准确的技术效果。

在一些实施例中，所述第一HCG单克隆抗体为鼠抗人β-HCG单克隆抗体，所述第二HCG单克隆抗体为人源β-HCG单克隆抗体，所述非人源IgG抗体为羊抗鼠IgG抗体。

实验表明，采用上述抗体用于检测时灵敏度最高，从而获得更准确的技术效果。

在一些实施例中，所述检测线上的第一HCG单克隆抗体浓度为0.5～3.0mg/mL，所述质控线上的羊抗鼠IgG抗体浓度为1.0～3.0mg/mL。

在一些实施例中，所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次粘贴在所述底板上，所述结合垫的一端夹设在所述样品垫和所述底板之间，所述NC膜的一端夹设在所述结合垫和所述底板之间，所述NC膜的另一端夹设在所述吸水垫和所述底板之间。

本发明提供了所述的免疫层析试纸的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、取氯金酸溶液与水煮沸后，加入柠檬酸钠溶液混合、加热并冷却后获得含纳米胶体金颗粒的溶液；

步骤2、取所述纳米胶体金颗粒的溶液加入水、维生素C溶液和氯铂酸溶液混合、加热并冷却后获得含纳米铂金颗粒的溶液；

步骤3、取所述纳米铂金颗粒的溶液经缓冲液调节PH值至7.0～9.0，加入所述第一HCG单克隆抗体搅拌反应，并经封闭液封闭、离心并去除上清后获得标记了第一HCG单克隆抗体的纳米铂金颗粒的溶液；

步骤4、取玻璃纤维纸在所述标记了第一HCG单克隆抗体的纳米铂金颗粒的溶液浸泡后，经烘干获得所述结合垫；

步骤5、取所述第二HCG单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体分别包被在所述检测线和质控线，经烘干获得所述NC膜；

步骤6、取所述样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次粘贴在所述底板上，制得所述免疫层析试纸。

在一些实施例中，所述步骤1中，所述氯金酸溶液和所述柠檬酸钠溶液的浓度为1wt％，所述氯金酸溶液的体积为1mL，所述柠檬酸钠溶液的体积为3～4mL，所述煮沸的时间为5min，所述加热的时间为10min，所述纳米胶体金颗粒的粒径为30～40nm；

在一些实施例中，所述步骤2中，所述纳米胶体金颗粒的溶液和水的体积比为1：(0.5～10)，所述维生素C溶液和所述氯铂酸溶液的浓度为5wt％～10wt％，所述维生素C溶液的体积为10mL，所述氯铂酸溶液的体积为5mL，所述加热的时间为10～20min；

在一些实施例中，所述步骤3中，所述缓冲液包括碳酸钾缓冲液、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液中的至少一种，所述封闭液包括牛血清蛋白、酪蛋白和PEG20000中的至少一种，所述搅拌反应的时间为1h，所述离心包括3500-5000r/min的条件下离心10min所述封闭液包括牛血清蛋白、酪蛋白和PEG20000中的至少一种，所述搅拌反应的时间为1h，所述离心包括3500-5000r/min的条件下离心10min；

在一些实施例中，所述步骤4中，所述烘干的温度为37～42℃；

在一些实施例中，所述步骤5中，所述烘干的温度为35～45℃。

本发明提供了所述的免疫层析试纸或所述的制备方法制得的免疫层析试纸在制备人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒中的应用。

本发明提供了人绒毛膜促性腺激素的检测试剂盒，包括所述的免疫层析试纸或所述的制备方法制得的免疫层析试纸。

在一些实施例中，还包括采样拭子。

本发明提供了人绒毛膜促性腺激素检测方法，包括：采用所述的免疫层析试纸、所述的制备方法制得的免疫层析试纸或所述的检测试剂盒对样本进行检测。

在一些实施例中，所述样本包括唾液样本。

本发明提供了检测人绒毛膜促性腺激素的免疫层析试纸及其制备方法，包括所述免疫层析试纸的检测试剂盒以及人绒毛膜促性腺激素检测方法。本发明采用独特的灵敏度更高的纳米铂金颗粒作为显色系统，将一株鼠抗人绒毛膜促性腺激素β单克隆抗体标记到纳米胶体铂金上形成标记复合物，将另一株鼠抗人绒毛膜促性腺激素β单克隆抗体包被到硝酸纤维素膜检测区，通过双抗体夹心法原理，检测人唾液样本中的人绒毛膜促性腺激素。与现有技术相比，本发明具备如下优点：

1、通过唾液样本检测早孕，取样更加方便、快捷，同时填补了目前市面上针对唾液样本检测产品的空白；

2、采用大颗粒纳米颗粒作为显色系统，检测灵敏度更高；

3、采用双β高灵敏、特异性好的鼠抗人绒毛膜促性腺激素抗体对，检测灵敏度更高，可以高达到0.25mIU/ml。

附图说明

图1示实施例1中人绒毛膜促性腺激素唾液检测免疫层析试纸的结构示意图；

图2示实施例2中人绒毛膜促性腺激素唾液检测卡结构示意图；

图3示实施例2中检测结果判定示意图；

图4对比例4中组1的粒径结果图；

图5示对比例4中组1的检测灵敏度结果图；

图6示对比例4中组2的粒径结果图；

图7示对比例4中组2的检测灵敏度结果图；

图8示对比例4中组3的粒径结果图；

图9示对比例4中组3的检测灵敏度结果图；

图10示对比例4中组4的粒径结果图；

图11示对比例4中组5的检测灵敏度结果图。

具体实施方式

本发明提供了检测唾液样本中人绒毛膜促性腺激素的检测试剂盒及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

人绒毛膜促性腺激素唾液检测免疫层析试纸的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：制备胶体金溶液：以氯金酸和柠檬酸钠为原料制备胶体金溶液，搅拌加热的洁净玻璃中加入99mL蒸馏水和1mL质量浓度为1％的氯金酸，煮沸5分钟，加入3-4mL质量浓度为1％的柠檬酸钠继续搅拌加热10min，直至溶液由紫变红，冷却搅拌至室温，制得含有粒径为30-40nm的胶体金颗粒的胶体金溶液。

步骤2：制备纳米铂金溶液：量取500ml胶体金溶液倒入洁净的容器瓶中；加入0.5-1倍纯化水倒入上述洁净容器瓶中，搅拌均匀；再加入5％-10％的VC溶液10ml，搅拌均匀；再加入5％-10％的氯铂酸溶液5ml，搅拌均匀；加热搅拌计时10-20min；冷却至室温备用。

步骤3：制备纳米铂金标记鼠抗人绒毛膜促性腺激素β单克隆抗体溶液：

取碳酸钾溶液调节步骤2所制纳米铂金的PH值至7.0-9.0，鼠抗人绒毛膜促性腺激素β单克隆抗体1按量加入至纳米铂金溶液中搅拌1h，加入封闭液(牛血清蛋白或酪蛋白或PEG20000)搅拌1h，制得体积浓度为1.0-1.5％的标记后的金溶液，标记后的金溶液在转速3500-5000r/min的条件下离心10min，弃去上清液，沉淀用金稀释液复溶，制得人绒毛膜促性腺激素β单克隆抗体金标记溶液，置于2-8℃下保存备用；

步骤4：制备金标垫：25ml金标记溶液浸满1张玻璃纤维纸，37-42℃烘干后分割为5-7mm每条，备用。

步骤5：硝酸纤维素膜上包被T检测线和C质控线：将人绒毛膜促性腺激素β单克隆抗体2、和羊抗鼠IgG分别包被在T检测线、和C质控线区域；烘干备用。人绒毛膜促性腺激素β单克隆抗体2的浓度为0.5-3.0mg/mL，羊抗鼠抗体的浓度为1.0-3.0mg/mL，包被后的硝酸纤维素膜在35-45℃下烘干备用。

步骤6：组装人绒毛膜促性腺激素唾液检测免疫层析试纸。将样品垫、金标垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘接在PCV底板上，切割成条，制得人绒毛膜促性腺激素唾液检测免疫层析试纸。具体结构如图1所示。

实施例2

人绒毛膜促性腺激素唾液检测的方法，包括如下步骤：

让唾液在口中停留汇集至少30秒；

打开采样拭子包装，将拭子含在口中90秒左右。收集唾液时，可以将拭子头在口中左右滚动几下，以增加唾液的吸收。

撕开铝箔袋，取出检测卡平放；

将吸满唾液的拭子头插入检测卡的样本孔中，握住采样拭子的手柄端并顺时针旋转挤压拭子头，将拭子头里的唾液挤出；

10-15分钟观察结果，15分钟后显示的结果无效。检测卡的结构如图2所示。

结果判断示例如图3所示：T检测线的显色程度与唾液中的人绒毛膜促性腺激素的浓度呈正相关：

1)阴性(-)：仅质控区(C)出现一条黑色或灰色条带，在检测区(T)无条带出现，表示未怀孕。

2)阳性(+)：出现两条黑色或灰色条带，一条位于检测区(T)，另一条位于质控区(C)。检测区(T)条带颜色可深可浅，3)结果均为阳性，表示已经怀孕。如果检测区(T)显色很弱时，可第二天再进行复测或去医院进一步确认。

3)无效：质控区(C)未出现黑色或灰色条带，无论检测区(T)是否出现条带，均表明结果无效，需重新检测。

对比例1

探究不同显色金颗粒标记人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的检出限研究

1.试验目的

比较用不同显色金颗粒标记人绒毛膜促性腺激素(HCG)单克隆抗体，用不同浓度的HCG唾液参考品进行检测，以验证产品的检出限差异。

2.试验材料

1)胶体金溶液：粒径30-40mm(自制)；

2)纳米铂金溶液：粒径200-250mm(自制)；

3)α-HCG单克隆抗体、β-HCG单克隆抗体(购自南京松天盛科生物科技有限公司)；

4)羊抗鼠抗体(购自洛阳佰奥通实验材料中心)；

5)不同浓度的HCG参考品：0、0.1、0.25、0.5、1、5、10、25mIU/mL(用阴性唾液基质稀释的国家标准品)；

6)PVC大板、无纺布样品垫、玻璃纤维、NC膜等其他试验材料。

3.试验方法

3.1制备印模

1)用20mM pH8.0 PB缓冲液将重组蛋白G和α-HCG单克隆抗体分别稀释为1.5mg/mL、2.0mg/mL的浓度，分别作为质控线(C线)划膜液和检测线(T线)划膜液。

2)用划膜仪将C线和T线划膜液分别包被在粘贴在PVC板上的NC膜上，放入干燥箱烘干。

3.2制备金标结合垫

3.2.1胶体金溶液标记β-HCG单克隆抗体

先用一定浓度的K

3.2.2纳米铂金溶液标记β-HCG单克隆抗体

先用0.2M碳酸钾溶液调整纳米铂金溶液的pH，然后加入β-HCG单克隆抗体，混匀，与纳米铂金进行耦合，得到金标复合物溶液，将金标复合物溶液均匀包被在玻璃纤维上，用干燥箱烘干后密封备用。

3.3制备样品垫

配制缓冲液为50mM pH8.0 Tris的样品垫溶液，均匀包被在无纺布上，用干燥箱烘干后密封备用。

3.4组装大板并制备试纸条，用HCG唾液参考品进行检测，10-15分钟记录检测结果，如表1所示。

4.试验结果

试验结果(表1)表明用α-HCG单克隆抗体包被，分别用胶体金和纳米铂金标记的HCG单克隆抗体，胶体金标记检出限为25mIU/mL，纳米铂金标记检出限为1mIU/mL。

表1不同显色颗粒用于标记人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的检测结果

对比例2

不同活性原材料对唾液中人绒毛膜促性腺激素(HCG)检出限影响的研究

1.试验目的

比较用传统α+β活性原材料和双β活性原材料包被和标记，评价HCG唾液检测检出限的差异。

2.试验材料

2.1纳米铂金溶液：粒径250mm自制)；

2.2传统α+β原料：α-HCG单克隆抗体、β-HCG单克隆抗体(购自南京松天盛科生物科技有限公司)；

2.3β+β原料：β-HCG mAb2 coating、β-HCG mAb2 labeling(购自郑州星原生物科技有限公司)

2.4重组蛋白G(购自杭州钮龙生物科技有限公司)；

2.5不同浓度的HCG参考品：0、0.1、0.25、0.5、1、5、10、25mIU/mL(用阴性唾液基质稀释的国家标准品)；

2.6PVC大板、无纺布样品垫、玻璃纤维、NC膜等其他试验材料。

3.试验方法

3.1制备印模

3.1.1制备松天盛科厂家原料的印模

1)用20mM pH8.0 PB缓冲液将重组蛋白G和α-HCG单克隆抗体分别稀释为1.5mg/mL、2.0mg/mL的浓度，分别作为质控线(C线)划膜液和检测线(T线)划膜液。

2)用划膜仪将C线和T线划膜液分别包被在粘贴在PVC板上的NC膜上，放入干燥箱烘干。

3.1.2制备郑州星原厂家原料的印模

1)用20mM pH8.0 PB缓冲液将重组蛋白G和β-HCG mAb2 coating分别稀释为1.5mg/mL、2.0mg/mL的浓度，分别作为质控线(C线)划膜液和检测线(T线)划膜液。

2)用划膜仪将C线和T线划膜液分别包被在粘贴在PVC板上的NC膜上，放入干燥箱烘干。

3.2制备金标结合垫

3.2.1制备松天盛科厂家原料的金标结合垫

先用0.2M的碳酸钾溶液调整纳米铂金溶液的pH为8.0-9.0，然后加入β-HCG单克隆抗体，混匀，与纳米铂金进行耦合，得到金标复合物溶液以1：0.5的比例用金稀释液(50mMpH8.0 Tris，5％蔗糖，1％BSA，0.5％吐温-20)复溶，将复溶的金标复合物溶液25ml/张均匀包被在玻璃纤维(28cm*30cm)上，用干燥箱烘干后密封备用。

3.2.2制备郑州星原厂家原料的金标结合垫

先用0.1M pH7.0的PB溶液调整纳米铂金溶液的pH，然后加入β-HCG mAb2labeling，混匀，与纳米铂金进行耦合，得到金标复合物溶液以1：1.5的比例用金稀释液(50mM pH8.0 Tris，5％蔗糖，1％BSA，0.5％吐温-20)复溶，将复溶的金标复合物溶液25ml/张均匀包被在玻璃纤维(28cm*30cm)上，用干燥箱烘干后密封备用。

3.3制备样品垫

配制缓冲液为50mM pH8.0 Tris，0.5％吐温-20的样品垫溶液，均匀包被在无纺布上，用干燥箱烘干后密封备用。

3.4分别组装大板并制备试纸条，用HCG唾液参考品进行检测，10-15分钟记录检测结果。

4.试验结果

试验结果(表2)表明，传统α+β原料制备的产品检出限为1mIU/mL，β+β原料制备的产品检出限为0.25mIU/mL。

表2不同活性原料制备的产品用于检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)检出限

对比例3

人绒毛膜促性腺激素(HCG)不同检测样本类型检出限研究

1.试验目的

比较HCG尿液检测产品对HCG尿液参考品的检测以及HCG唾液检测产品对唾液HCG参考品检测结果的差异。

2.试验材料

2.1HCG尿液检测试纸：人绒毛膜促性腺激素(HCG)检测试纸(胶体金法)(润和生物医药科技(汕头)有限公司)；

2.2人绒毛膜促性腺激素(HCG)唾液检测试纸(免疫层析法)(自制，β+β原料)；

2.3不同浓度的HCG尿液参考品：0、0.1、0.25、0.5、1、5、10、25、50、100mIU/mL(用阴性尿液基质稀释的国家标准品)；

2.4不同浓度的HCG唾液参考品：0、0.1、0.25、0.5、1、5、10、25、50、100mIU/mL(用阴性唾液基质稀释的国家标准品)

3.试验方法

用HCG尿液检测试纸对尿液基质的HCG参考品进行检测，同时用HCG唾液检测试纸对HCG唾液参考品进行检测，10-15分钟记录检测结果。

4.试验结果

试验结果(表3)表明，HCG尿液样本检测试纸的检出限为25mIU/mL，β+β原料制备的HCG唾液样本检测产品检出限为0.25mIU/mL。

表3不同样本人绒毛膜促性腺激素检出限

对比例4

探究不同纳米铂金颗粒粒径对检测结果及灵敏度的影响，其中不同纳米铂金颗粒分组如下表4所示，其中组1的粒径及检测灵敏度结果如图4和图5所示，组2的粒径及检测灵敏度结果如图6和图7所示，组3的粒径及检测灵敏度结果如图8和图9所示，组4的粒径及检测灵敏度结果如图10和图11所示。

表4不同纳米铂金颗粒粒径用于检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)检出限

结果表明，纳米铂金颗粒粒径小于200nm的情况下，检测灵敏度较低，而高于300nm时，检测灵敏度高，但会出现非特异性反应，因此挑选粒径在250nm左右时，检测灵敏度较高，且无非特异反应。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。