一种海参烷型皂苷单体的制备方法

技术领域

本发明属于天然药物化学研究领域，提供了一种从仿刺参中提取分离海参烷型皂苷单体CladolosidesB的制备方法。

背景技术

仿刺参(Apostichopus japonicus Selenka)属棘皮动物门(Echinopermata)、海参纲(Holothuroidea)、楯手目(Aspidochirotida)、刺参科(Stichopodidae)、仿刺参属(Apostichopus)海洋生物，主要分布于中国、日本、朝鲜和俄罗斯等地。仿刺参为名贵的海参品种，是我国传统的食材与中药材，被誉为“参中之冠”。传统医学认为仿刺参具有滋补功效，可以治疗经血亏损、虚弱劳祛、阳痿梦遗、小便频数和肠燥便艰等多种症状。仿刺参中含有皂苷、脑苷脂、神经节苷脂、酸性粘多糖及凝集素等次生代谢产物，其中皂苷类化合物大多属于羊毛甾醇型三萜类寡糖苷，是由苷元和糖链通过β-糖苷键结合而成。

仿刺参中皂苷的苷元分为四环三萜和五环三萜，按照苷元的结构可以将其分为海参烷型(Holostane-type)和非海参烷型(Non-holostane-type)两种。海参烷型苷元一般含有18(20)-内酯环，而非海参烷型苷元有18(16)-内酯环或无内酯环结构。CladolosidesB是仿刺参中海参烷型皂苷的一种，对白色念球菌、热带念珠菌、红色毛藓菌石膏状小孢子菌都有很强的抑制作用，(王增蕾.仿刺参和一种肉芝软珊瑚化学成分及生物活性研究[D].上海:第二军医大学,2009.)。有两篇文献报道从海参中分离得到CladolosidesB(文献1：S.A.AVILOV,V.A.STONIK.New triterpene glycosides from the holothurianCladolabes sp.[J].Chemistry of Natural Compounds,1988,24(5):656.文献2：王增蕾.仿刺参和一种肉芝软珊瑚化学成分及生物活性研究[D].上海:第二军医大学,2009.)，但均未给出CladolosidesB的具体制备方法。

发明内容

本发明提供了一种利用仿刺参提取分离海参烷型皂苷单体化合物CladolosidesB制备方法。本发明所述CladolosidesB的结构式如下。

鉴于CladolosidesB可以作为评价仿刺参质量的指标之一，也可以用于仿刺参总皂苷的一种含测指标，同时又因为CladolosidesB具有良好的抗菌生物活性，有望在保健食品、抗菌药物以及其他医药领域得到广泛应用。因此本发明对其制备方法进行了深入研究，完成了本发明。

本发明的具体技术内容如下：

以仿刺参或其内脏为原料，用乙醇-水混合溶剂提取，提取液利用大孔吸附树脂进行吸附，先用低浓度乙醇洗脱杂质，再用高浓度乙醇洗脱海参皂苷，洗脱液TLC检测，收集含海参烷型皂苷部分，此部分洗脱液减压回收溶剂，干燥，得到海参总皂苷。取海参总皂苷进行硅胶柱层析，ODS柱层析，制备型高效液相色谱分离纯化，得到3β-O-{(3-O-甲基-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃木糖-(1→4)-β-D-吡喃喹诺糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-β-D-吡喃木糖}-海参烷-9，25-二烯-16酮(CladolosidesB)。

所述仿刺参的提取方法为：取新鲜的仿刺参或其内脏洗净，利用破壁机搅碎，用30％-85％乙醇水溶液回流提取。

所述的大孔吸附树脂为D101、AB-8、D4020、HP20或D301型大孔吸附树脂。

所述的仿刺参提取液经大孔吸附树脂吸附后，先用15％-95％的乙醇溶液洗脱杂质，再用浓度为95％-100％的乙醇溶液洗脱海参皂苷，洗脱液中含有3β-O-{(3-O-甲基-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃木糖-(1→4)-β-D-吡喃喹诺糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-β-D-吡喃木糖}-海参烷-9，25-二烯-16酮，此洗脱液减压回收乙醇后干燥，得到海参总皂苷。

取海参总皂苷以体积比为6:1:0.1～4:1:0.1的二氯甲烷-甲醇-水混合溶液为洗脱液进行硅胶柱层析梯度洗脱，TLC检验，合并含有CladolosidesB的组分，减压回收溶剂。将所得含CladolosidesB的组分，以体积比为1.5:1～3:1丙酮-水的混合溶液为洗脱液进行ODS柱层析梯度洗脱，TLC检验，合并含CladolosidesB组分，减压回收溶剂。将所得的含CladolosidesB组分，利用制备型高效液相色谱以乙腈-水(43:57)为流动相等度洗脱，收集CladolosidesB色谱峰，减压回收溶剂，干燥，得到CladolosidesB单体。

所述的仿刺参可以是新鲜的仿刺参，也可以是冷冻仿刺参或仿刺参干燥品。所述的仿刺参内脏是指仿刺参加工过程中产生的其胃肠等废弃物。本发明主要采用仿刺参内脏提取分离CladolosidesB单体，能大大降低CladolosidesB的制备成本。

本发明利用NMR等手段对分得的CladolosidesB单体的化学结构进行了鉴定，鉴定过程及具体数据如下。

CladolosidesB为白色粉末。Liebermann-Burchard反应和Molish反应阳性，推测其可能为皂苷类成分。

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将CladolosidesB单体的

检测CladolosidesB纯度的HPLC色谱条件如下：Agilent ZORBAX SB-C18(9.4×250mm，5μm)，流动相：乙腈-水(35：65)，流速：1L/min，柱温：30℃，进样量：20μL

本发明获得的海参烷型皂苷单体可用于仿刺参的质量控制，也可用于含有海参的保健食品或药物组合物的开发，并可用于产品的质量控制。

附图说明

图1.CladolosidesB的

图2.CladolosidesB的

图3.CladolosidesB的DEPT图

具体实施方式

以下对本发明的优选实施实施例进行说明。应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

取新鲜的仿刺参20kg，洗净，去除内脏，切段，经破壁机搅碎，用80％乙醇水溶液回流提取3次，每次乙醇水溶液用量为40升，将提取液离心过滤，减压回收溶剂至无醇味，加8倍水稀释后用大孔吸附树脂D101进行吸附，先用70％乙醇洗脱杂质，再用100％的乙醇进行洗脱，洗脱液减压回收溶剂得到海参总皂苷35g。取海参总皂苷以体积比为6:1:0.1～4:1:0.1的二氯甲烷-甲醇-水混合溶液为洗脱液进行硅胶柱层析梯度洗脱，TLC检验，合并含有CladolosidesB的组分，减压回收溶剂。将所得含CladolosidesB的组分，再次以体积比为1.5:1～3:1丙酮-水的混合溶液为洗脱液进行ODS柱层析梯度洗脱，TLC检验，合并含CladolosidesB组分，减压回收溶剂。将所得的含CladolosidesB组分，利用制备型高效液相色谱以乙腈-水(43:57)为流动相等度洗脱，收集CladolosidesB色谱峰，减压回收溶剂，干燥，得到3β-O-{(3-O-甲基-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃木糖-(1→4)-β-D-吡喃喹诺糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-β-D-吡喃木糖}-海参烷-9，25-二烯-16酮单体即CladolosidesB单体246mg。用HPLC法检测，其纯度为97.0％。

实施例2

取仿刺参内脏5kg，经破壁机搅碎，用70％乙醇水溶液回流提取3次，每次乙醇水溶液用量为10升，将提取液离心过滤，减压回收溶剂至无醇味，加8倍水稀释后用大孔吸附树脂AB-8进行吸附，先用50％乙醇洗脱杂质，再用95％的乙醇进行洗脱，洗脱液减压回收溶剂得到海参内脏总皂苷15g。取海参内脏总皂苷以体积比为8:1:0.1～4:1:0.1的二氯甲烷-甲醇-水混合溶液为洗脱液进行硅胶柱层析梯度洗脱，TLC检验，合并含有CladolosidesB的组分，减压回收溶剂。将所得含CladolosidesB的组分，再次以体积比为1:1～3:1丙酮-水的混合溶液为洗脱液进行ODS柱层析梯度洗脱，TLC检验，合并含CladolosidesB组分，减压回收溶剂。将所得的含CladolosidesB组分，利用制备型高效液相色谱以乙腈-水(40:60)为流动相等度洗脱，收集CladolosidesB色谱峰，减压回收溶剂，干燥，得到3β-O-{(3-O-甲基-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃木糖-(1→4)-β-D-吡喃喹诺糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-β-D-吡喃木糖}-海参烷-9，25-二烯-16酮单体即CladolosidesB单体135mg。用HPLC法检测，其纯度为97.6％。

实施例3

取新鲜的仿刺参10kg，洗净，不去除内脏，切段，经破壁机搅碎，将其放入锥形瓶中，同时加入60％乙醇水混合溶剂，直至没过海参，超声3次，每次两小时。将得到的海参提取液用1:1比例正丁醇萃取6次，萃取液减压回收溶剂，得到提取物30g。取超声提取物以体积比为6:1:0.1～4:1:0.1的二氯甲烷-甲醇-水混合溶液为洗脱液进行硅胶柱层析梯度洗脱，TLC检验，合并含有CladolosidesB的组分，减压回收溶剂。将所得含CladolosidesB的组分，再次以体积比为2:1～3:1丙酮-水的混合溶液为洗脱液进行ODS柱层析梯度洗脱，TLC检验，合并含CladolosidesB组分，减压回收溶剂。将所得的含CladolosidesB组分，利用制备型高效液相色谱以乙腈-水(45:55)为流动相等度洗脱，收集CladolosidesB色谱峰，减压回收溶剂，干燥，得到3β-O-{(3-O-甲基-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃木糖-(1→4)-β-D-吡喃喹诺糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-β-D-吡喃木糖}-海参烷-9，25-二烯-16酮单体即CladolosidesB单体130mg。用HPLC法检测，其纯度为98.3％。

前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。