槐定碱三环衍生物及其在制备抗肝纤维化或抗原发性肝癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地说，涉及一种槐定碱三环衍生物及其在制备治疗肝纤维化或抗原发性肝癌的药物中的应用。

背景技术

全球每年有近200万人因肝脏疾病死亡，其中，100万人死于肝硬化并发症，另一部分则死于病毒性肝炎和肝细胞癌。肝纤维化是慢性肝损伤和肝脏自我修复导致的病理变化，是慢性肝病向肝硬化、甚至肝癌发展的必经阶段。肝纤维化的致病因素有很多，包括酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、乙型肝炎、丙型肝炎，药物引起的代谢中毒、胆汁淤积性肝病以及自身免疫疾病等。肝纤维化病理特征主要表现为细胞外基质在肝内的过度沉积，导致肝脏组织的结构和功能改变。目前研究认为肝星状细胞的激活是肝纤维化过程中的核心事件，与肝纤维化的发生发展密切相关。静息状态的肝星状细胞位于肝脏窦状隙的Disse腔内，富含维生素A脂滴，在维持肝脏正常功能和稳态中发挥重要作用。当肝脏损伤后，肝星状细胞在可溶性介质的作用下被启动激活，分化为具有增殖、纤维生成、胶原降解功能改变的肌成纤维细胞，大量表达细胞外基质，导致细胞外基质过度沉积，最终形成肝纤维化。肝纤维化是一个动态可逆过程，是慢性肝病逆转的重要时期，因此，在肝纤维化阶段积极采取干预措施，阻断肝纤维化进程对降低慢性肝脏疾病进展至肝硬化甚至肝癌具有重要意义。近几十年来，抗肝纤维化的药物研究虽然取得了一定的进展，但目前许多药物仍处于临床前或临床试验阶段，但目前尚无一种化学药物被批准用于人类肝纤维化的治疗。

肝癌的发病是多因素、多步骤的复杂过程，流行病学及实验研究资料表明，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、黄曲霉素、饮水污染、酒精、肝硬化、亚硝胺类物质、微量元素等都与肝癌发病相关。目前，肝癌的治疗除了手术治疗和化疗外，并无有效的防治药物。由于肝纤维化是肝癌发展的必经阶段，不加控制的肝纤维化会最终引起肝癌的发生，为此阻断肝纤维化进程有望为防治肝癌的药物研发提供思路。

肝纤维化发生发展机制十分复杂，涉及多种细胞因子如TGF-β、PDGF、VEGF、IL-6等和多条信号通路如TGF-β/Smads信号通路、MAPKs信号通路、PI3K/Akt信号通路、JAK/STAT3信号通路、NF-κB信号通路、Wnt/β-Catenin信号通路、Notch信号通路等。其中，转化生长因子-β(TGF-β)是引起肝星状细胞活化的最强刺激因子之一。TGF-β通过激活Smads通路上调纤维生成基因的转录，使肝星状细胞转分化为肌成纤维细胞，合成过量的细胞外基质，干扰基质金属蛋白酶的合成，上调基质金属蛋白酶抑制剂的表达，从而促进细胞外基质产生，并抑制其降解。此外，TGF-β还能依靠三级酶促级联反应激活MAPKs信号通路，促进肝星状细胞活化。TGF-β信号失调同样与肿瘤发生密切相关。在癌症后期，TGF-β具有促进肿瘤发展的作用，能够增加肿瘤的侵袭和迁移，同时，TGF-β信号通路还可以同其他信号通路相互作用以协同或拮抗的方式调节细胞功能。而TGF-β活性升高与肿瘤预后差密切相关，抑制TGF-β信号可以提高肝癌治疗的预后。基于TGF-β在肝纤维化及肝癌中的重要作用，发展TGF-β抑制剂对于肝纤维化及肝癌的治疗具有重要意义。

槐定碱是一种具有生物活性的生物碱，存在于许多中草药中，如苦豆子、苦参等。槐定碱具有广泛的药理活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗病毒、心肌保护和肝保护作用，涉及的作用机制包括调节NF-κB、TLR4/IRF3、JNK/ERK、Akt/mTOR等信号传导途径，下调HMG3B、bcl-2、MMP-2、MMP-9、TNF-α、IL-1β、IL-6和其他细胞因子或激酶的表达等。在肝病研究方面，槐定碱具有一定的肝保护作用，能够缓解急慢性肝损伤，除此之外，槐定碱还能够抑制多种肝癌细胞的增殖，促进肝癌细胞的凋亡，同时抑制异种移植瘤模型的肿瘤生长，但对于原发性肝癌的研究并没有文献报道。近些年，越来越多的研究表明，槐定碱具有严重的不良反应，包括神经毒性、急性毒性、肝毒性以及再生毒性，并且其药理活性并不强，因此，有必要对槐定碱进行结构改造，以期获得活性更好毒性更低的化合物分子。

发明内容

本发明的目的是提供一种槐定碱三环衍生物。

本发明的另一个目的是提供一种所述槐定碱三环衍生物在制备抗肝纤维化或原发性肝癌的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供了一种槐定碱三环衍生物或其药用盐，结构通式如下所示：

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较优选的，所述槐定碱三环衍生物中，

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最优选的，所述槐定碱三环衍生物选自以下结构的一种：

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本发明的第二方面，提供了一种所述槐定碱三环衍生物或其药用盐在制备抗肝纤维化的药物中的应用。

本发明的第三方面，提供了一种所述槐定碱三环衍生物或其药用盐在制备抗原发性肝癌的药物中的应用。

所述抗肝纤维化的药物为减少肝内羟脯氨酸含量、降低肝内炎性细胞浸润、抑制肝内胶原沉积、抑制肝星状细胞活化和α-SMA表达的药物；所述抗原发性肝癌的药物为抑制肝内肿瘤结节形成的药物。

此外，本发明的槐定碱三环衍生物还可抑制Smads转录活性或抑制体内TGF-β/Smads信号通路激活，在肝纤维化和原发性肝癌中均有一定的缓解效果。

本发明首先通过体外药效学实验证实，槐定碱三环衍生物可抑制TGF-β诱导的肝星状细胞的活化，改善CCl

本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，是以槐定碱三环衍生物或其药用盐作为唯一活性成分。

所述槐定碱三环衍生物的含量为0.1-99wt％。

本发明的第五方面，提供了一种药物制剂，是由槐定碱三环衍生物或其药用盐和药学上常用的辅料制成，所述药物制剂的剂型优选注射剂或口服制剂。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明通过体外实验验证，槐定碱三环衍生物可抑制TGF-β诱导的肝星状细胞的活化，改善CCl

附图说明

图1是槐定碱及其三环衍生物对TGF-β/Smads转录活性的影响结果的示意图。

图2是化合物ZM600对肝星状细胞活化的影响结果示意图。

图3是化合物ZM600改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化结果示意图。

图4是化合物ZM600改善BDL诱导的小鼠肝纤维化的结果示意图。

图5是化合物ZM600抑制TGF-β/Smads信号通路活化的结果示意图。

图6是化合物ZM600抑制二乙基亚硝胺诱导的小鼠原发性肝癌的结果示意图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，物质的百分比和份数均按重量计算。

实施例1

化合物4-((1R,3aR,3a

将KOH(6g，0.11mol)置于50mL单口烧瓶中，加入20mL水搅拌溶解，降温至室温，加入槐定碱即化合物1(2g，8mmol)，于120℃油浴中加热回流反应。反应结束后抽滤，滤液减压蒸去大部分溶剂，残液于-30℃冻干，获得槐定碱三环化合物钾盐即化合物2。

向100mL单口烧瓶中加入20mL无水甲醇，冰浴下加入10mL氯化亚砜(0.51mol)，反应1h。缓慢加入含有上一步合成得到的化合物2的甲醇溶液10mL，继续反应1h。于65℃油浴加热回流至反应结束，以碳酸氢钠溶液中和反应液，使其pH为5～6。抽滤，滤液减压蒸去溶剂，柱层析法纯化，获得1.99g淡黄色固体即化合物3，产率88.3％。

将萘普生(100mg，0.4mmol)置于25mL单口烧瓶中，加入5mL干燥DMF搅拌溶解，分别加入DIPEA(140mg，1.1mmol)、HATU(272mg，0.7mmol)和化合物3(100mg，0.36mmol)，氮气保护下室温反应过夜。反应结束后，加入100mL水，乙酸乙酯萃取(10mL×4)，有机相用饱和食盐水洗涤(10mL)，无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂。柱层析法纯化，获得92.4mg黄色固体即化合物ZM598，产率52.6％。

实施例2

化合物4-((1R,3aR,3a

参考实施例1化合物ZM598的制备方法，以2-(4-异丁基苯基)丙酸代替萘普生，得黄色固体即化合物ZM599，产率44.2％.

实施例3

化合物4-((1R,3aR,3a

参考实施例1化合物ZM598的制备方法，以2-(2-氟-[1,1'-联苯]-4-基)丙酸代替萘普生，得黄色固体即化合物ZM600，产率50.9％.

实施例4

化合物4-((1R,3aR,3a

参考实施例1化合物ZM598的制备方法，以2-(2-(2-((2,6-二氯苯基)氨基)苯基)乙酰氧基)乙酸代替萘普生，得黄色固体即化合物ZM601，产率67.37％.

实施例5

化合物4-((1R,3aR,3a

参考实施例1化合物ZM598的制备方法，以(Z)-2-(5-氟-2-甲基-1-(4-(甲基亚硫酰基)亚苄基)-1H-茚-3-基)乙酸代替萘普生，得淡黄色固体即化合物ZM602，产率44.2％.

实施例6

化合物4-((1R,3aR,3a

参考实施例1化合物ZM598的制备方法，以4-苯基苯乙酸代替萘普生，得淡黄色固体即化合物ZM720，产率13.6％.

实施例7

化合物4-((1R,3aR,3a

参考实施例1化合物ZM598的制备方法，以2-(4-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)苯基)乙酸代替萘普生，得淡黄色固体即化合物ZM721，产率14.8％.

实施例8

化合物4-((R,3aR,3a

参考实施例1化合物ZM598的制备方法，以2-氟-4-苯基苯乙酸代替萘普生，得淡黄色固体即化合物ZM721，产率13.9％.

实施例9

化合物4-((1R,3aR,3a

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参考实施例1化合物ZM598的制备方法，以2-联苯基丙酸代替萘普生，得淡黄色固体即化合物ZM723，产率20.5％.

实施例10

化合物4-((1R,3aR,3a

参考实施例1化合物ZM598的制备方法，以3’-氟代联苯乙酸代替萘普生，淡黄色固体即化合物ZM724，产率27.8％.

实施例11

槐定碱及其三环衍生物抑制TGF-β/Smads转录活性筛选

采用TGF-β/Smads报告基因法对槐定碱以及本发明实施例制备的槐定碱三环衍生物进行活性筛选及比较。HEK 293TGFβ/Smads报告基因细胞系购自上海吉满生物科技有限公司。细胞以2×10

结果如图1所示，图1是槐定碱及其三环衍生物对TGF-β/Smads转录活性的影响结果的示意图。从图中可以看出，化合物600、601、722、723和724对TGF-β/Smads转录活性均有一定的抑制效果，且效果优于槐定碱，其中尤其以ZM600抑制活性最好；本发明以化合物ZM600进行后续活性研究。

实施例12

化合物ZM600抑制TGF-β诱导的肝星状细胞活化

用TGF-β(2ng/mL)刺激人肝星状细胞LX-2活化，采用Real time PCR和Westernblot方法考察化合物ZM600对肝星状细胞活化的影响。LX-2细胞以5×10

结果如图2所示，图2是化合物ZM600对肝星状细胞活化的影响结果示意图。图中，A，B(Real time PCR结果)表示α-SMA和Col1α1的mRNA水平，结果显示化合物ZM600能显著抑制TGF-β诱导的α-SMA(P<0.01)和Col1α1(P<0.05)的mRNA表达；图中，C(Western blot结果)表示α-SMA和一型胶原的蛋白表达情况，结果显示TGF-β处理可显著增加α-SMA和一型胶原的蛋白表达，而不同浓度化合物ZM600能够显著抑制α-SMA和一型胶原的蛋白表达。以上结果表明，ZM600体外能够抑制TGF-β诱导的肝星状细胞活化，提示可能具有潜在的抗肝纤维化作用。

实施例13

化合物ZM600改善CCl

CCl

结果如图3所示，图3是化合物ZM600改善CCl

实施例14

化合物ZM600改善BDL诱导的小鼠肝纤维化

BDL肝纤维化小鼠模型的制备：雄性C57BL/6J(8周龄)小鼠，采用0.75％戊巴比妥钠溶液按10mL/kg剂量腹腔注射进行麻醉。用75％酒精棉球擦拭消毒腹部，沿腹中线开口，暴露肝脏下缘至十二指肠部位，小心分离胆总管，用缝合线穿过胆总管下方并打结，于近肝端双重结扎胆总管；用4-0带针缝合线缝合伤口，并使用碘伏消毒液消毒术部。假手术组(Sham组)小鼠开腹腔并分离胆总管，只穿线不结扎，其余操作同BDL组。待动物苏醒后放入饲养盒内，自由进食。手术72h后，将BDL组小鼠随机分为溶剂组(BDL模型组)、ZM600低剂量组(15mg/kg)、ZM600高剂量组(30mg/kg)，分组完成后各组均按10mL/kg灌胃给药，空白组与溶剂组灌服等量的0.5％CMC-Na溶液，每天1次，连续给药11天，末次给药后，自由进食24h，收集样品。

结果如图4所示，图4是化合物ZM600改善BDL诱导的小鼠肝纤维化的结果示意图。

图中，A表示各组小鼠肝脏外观情况，结果显示ZM600治疗后，小鼠肝脏得到恢复，颗粒感减轻，质地变软，肝脏损伤状况改善；B中，HE染色观察肝脏病理情况，结果显示，ZM600能够显著减少BDL模型小鼠肝内炎性细胞浸润，恢复肝脏正常组织结构；Masson染色和天狼星红染色观察肝脏胶原沉积情况，结果显示，ZM600能够显著抑制BDL模型小鼠肝内胶原沉积；α-SMA免疫组化染色观察肝内α-SMA表达情况，结果显示，ZM600能够显著减少BDL模型小鼠肝内α-SMA的蛋白表达，表明ZM600体内能够抑制肝星状细胞的活化；C表示各组小鼠肝脏α-SMA和Col1α1的mRNA水平，结果显示ZM600能够显著降低BDL模型小鼠肝内一型胶原和α-SMAmRNA水平；D表示各组小鼠肝脏α-SMA和一型胶原的蛋白表达情况，结果显示ZM600能够显著降低BDL模型小鼠肝内胶原和α-SMA的蛋白表达水平。综上，研究结果显示ZM600能够改善BDL引起的肝纤维化。

实施例15

化合物ZM600抑制TGF-β/Smads信号通路活化

LX-2细胞以5×10

结果如图5所示，图5是化合物ZM600抑制TGF-β/Smads信号通路活化的结果示意图。

图中，A表示ZM600对TGF-β刺激LX-2细胞Smad2/3活化的影响，结果显示在TGF-β的刺激下，LX-2细胞内Smad2、Smad3磷酸化水平显著升高，ZM600能显著抑制Smad2和Smad3的磷酸化；B、C表示ZM600对CCl

实施例16

化合物ZM600抑制二乙基亚硝胺诱导的小鼠原发性肝癌

C57雄性小鼠分为空白组、模型组以及ZM600(15mg/kg)治疗组，每组10只。原发性肝癌模型于小鼠2周龄腹腔注射DEN溶液(溶剂为生理盐水)25mg/kg，2周后开始腹腔注射35mg/kg DEN溶液，每周注射一次，连续注射25周，为了加快成瘤，同时给予小鼠高脂饮食。治疗组从第10周开始进行灌胃给药，每两天给药一次，连续给药15周。造模结束后处死小鼠，观察小鼠肝脏成瘤情况，评价化合物ZM600抗肝癌作用。

结果如图6所示，图6是化合物ZM600抑制二乙基亚硝胺诱导的小鼠原发性肝癌的结果示意图。图中，A表示各组小鼠肝内肿瘤结节的数量，结果显示，模型组小鼠肝内肿瘤结节数量显著增多，ZM600可显著抑制DEN模型小鼠肝内肿瘤结节的形成；B表示各组小鼠谷草转氨酶(AST)的水平，C表示各组小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)的水平，结果显示，模型组小鼠血清ALT和AST水平显著升高，ZM600可显著降低模型小鼠血清ALT和AST水平。综上，结果表明ZM600能够抑制二乙基亚硝胺诱导的小鼠原发性肝癌。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。