一种用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料及其制备方法和应用，以及用于制备用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料的单克隆细胞株。

背景技术

乳腺癌是导致女性癌症类型死亡的重要原因，根据HER2状态的检测结果可将乳腺癌分为HER2阳性乳腺癌(免疫组化评分(IHC)为3+且荧光原位杂交(FISH)为阳性)和HER2阴性乳腺癌(IHC为0、1+或2+且FISH为阴性)，其中HER2阴性乳腺癌约占所有乳腺癌的70％-80％。

在HER2阴性乳腺癌中，还可进一步通过IHC将其细分为HER2-low乳腺癌和HER2zero乳腺癌，其中HER2-low定义为IHC为1+或2+且FISH为阴性的乳腺癌亚群，约占HER2阴性乳腺癌患者的50％。虽然HER2-low乳腺癌和HER2 zero乳腺癌同属于HER2阴性乳腺癌，然而相对于HER2 zero类型，HER2-low乳腺癌具有特异的生物学特性，对治疗和预后的反应也存在差异。因此，准确检测出HER2阴性乳腺癌中的HER2-low类型，对其临床治疗决策至关重要。

然而，HER2-low的准确检出一直是难点。一方面，是由于乳腺癌存在高遗传异质性，这本身就增加了HER2-low检出的难度；另一方面，是缺乏可用于验证HER2-low乳腺癌检出准确性的参考材料。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一方面提供一种单克隆细胞株，其保藏编为CCTCC NO:C2022227，保藏日期为2022年7月16，保藏地址为中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌区八一路。

上述的单克隆细胞株CCTCC NO:C2022227在制备用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料中的应用也属于本发明的内容。

本发明另一方面提供一种用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料的制备方法，其包括以下步骤：

S1)小鼠异种移植模型的建立：将上述的单克隆细胞株CCTCC NO:C2022227导入小鼠体内成瘤，获得小鼠肿瘤组织；

S2)将步骤S1获得的小鼠肿瘤组织以福尔马林固定，并使用石蜡包埋，得到所述用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料。

在一些实施方式中，步骤S2中所述福尔马林固定的时间为12-24h。

在一些实施方式中，步骤S2中在所述石蜡包埋后还对其进行切片处理，所述切片的厚度为3-20μm。

本发明再一方面还提供一种用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料，其由上述的制备方法得到。

在一些实施方式中，相对于CEP17基因的表达量，由dPCR方法检测的上述的用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料中的HER2基因的相对表达量为1.50-1.79，可选为1.632-1.775。

在一些实施方式中，在所述dPCR方法检测中，用于对HER2基因进行检测的引物和探针核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示，用于对CEP17基因进行检测的引物和探针核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示。

上述的用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料在制备用于检测HER2-low乳腺癌的试剂盒中的应用也属于本发明的内容。

本发明再一方面还提供一种检测HER2-low乳腺癌的试剂盒，其包括上述的用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料。

基于以上技术方案提供的单克隆细胞株CCTCC NO:C2022227具有较低的HER2基因扩增突变率(以CEP17基因作为内参基因，由dPCR方法检测的HER2基因的相对表达量为1.50-1.79，可选为1.632-1.775)，将其导入小鼠体内后可诱导小鼠产生HER2-low乳腺癌组织，利用该HER2-low乳腺癌组织经福尔马林固定和石蜡包埋后，进而获得本发明提供的用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料，因此本发明提供的用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料能够稳定大量获得，且经IHC和FISH验证后，表现出与HER2-low临床样本良好的一致性，因此该用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料能够有效用于准确检出HER2-low乳腺癌。

附图说明

图1为不同单克隆细胞株及其阳性质控和阴性质控中HER2/CEP17比值统计图。

图2为E1单克隆细胞株及其阳性质控和阴性质控中HER2/CEP17比值统计图。

图3为E1单克隆细胞株的HE、IHC和FISH染色结果照片。

图4为FFPE参考材料和临床乳腺癌样本的HE、IHC和FISH染色结果照片。

图5为FFPE参考材料的均一稳定性检测结果，其中A幅表示随机10个FFPE参考材料切片样品的HER2/CEP17比值统计结果，B幅表示FFPE参考材料在37℃、室温和4℃下储存1周、2周、1个月和2个月后HER2/CEP17比值统计结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应当理解的是，具体实施例仅用于进一步说明本发明，而不是用于限制本发明的内容。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用序列均可使用已有技术合成。

实施例1：可用于制备用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料的单克隆细胞株的筛选

1.1、细胞培养

将人胚肾(HEK)293T细胞、MDA-MB-231细胞、MDA-MB-453细胞和SK-BR-3细胞(高表达HER2的细胞)(均购自中国科学院细胞库)分别在Dulbecco改良的Eagle's培养基(DMEM)(Wisent，Montreal，Canada)中培养，各培养基中添加10％胎牛血清(FBS)(Wisent，Montreal，Canada)和1％青霉素/链霉素(Wisent，Montreal，Canada)。细胞在含有5％CO

1.2、重组慢病毒包装和滴定

在该实施例中使用的pLVX-IRES-ZsGreen1穿梭载体及辅助载体质粒(pLP2、pLP/VSVG、pLP1)均购自ATCC(Manassas，VA)。

将通过同源末端连接构建的含有目的基因(HER2表达基因，GenBank登录号：NM_004448.2)的穿梭载体质粒(命名为pLVX-IRES-ZsGreen1-HER2)、慢病毒辅助载体质粒、和转染试剂PEI(1mg/ml)(Sigma-Aldrich，USA)按以下量转染步骤1.1培养的HEK 293T细胞(直径100mm培养皿)：pLVX-IRES-ZsGreen1-HER2 20μg，pLP2、pLP/VSVG、pLP1分别10μg、10μg、15μg，转染试剂PEI 48μl。转染后6h更换新的完全培养基(DMEM)，转染48h后收集细胞上清并用PEG6000(TCI Shanghai，China)浓缩上清，分装于无菌EP管进行滴度检测，滴度至少1×10

1.3、慢病毒感染和单克隆细胞株的筛选

(1.3.1)采用预实验设定感染复数值分别为0，5，10，20，50，以确定慢病毒感染MDA-MB-231细胞的感染复数(MOI)值，确定最佳的MOI值为5。待MDA-MB-231细胞生长密度达30％，将浓缩病毒液(步骤1.2获得的慢病毒)与辅助转染试剂Polybrene(终浓度5-10ng/μl)(Sigma-Aldrich，USA)按照MOI为5感染MDA-MB-231细胞，感染48h后置于荧光显微镜下观察感染率，经流式分析仪(FACS Aria III，BD，USA)在无菌条件下进行分选，按照荧光表达强弱分选入96孔板，每孔1个细胞。两周后，于显微镜下观察细胞，挑选荧光均一的细胞进行扩大培养，共筛选得到13个单克隆细胞株，分别命名为A5、A11、B1、B5、D6、E1、E7、E9、F3、F4、F9、G3和G9。

(1.3.2)使用数字液滴PCR(dPCR)方法对上述步骤(1.3.1)筛选得到的13个单克隆细胞株中的HER2基因的状态进行检测，以从中筛选获得能够用于制备用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料的单克隆细胞株。其中在dPCR方法中，使用CEP17作为内参基因，用于对HER2基因和CEP17基因进行检测的引物探针序列如下表1所示，并使用强高表达HER2的SK-BR-3细胞作为第一阳性质控，使用HER2阳性的MDA-MB-453细胞作为第二阳性质控，使用HER2阴性的MDA-MB-231细胞作为第一阴性质控，并以健康人组织样本(商品化WI-38人胚胎肺细胞(购于ATCC，CCL-75))作为第二阴性质控。

表1：dPCR使用的引物和探针序列

具体的dPCR方法包括以下操作：

(1)提取DNA：使用Qiagen人类组织和细胞DNA提取试剂盒分别提取上述13个单克隆细胞株的DNA，以及第一阳性质控SK-BR-3细胞、第二阳性质控MDA-MB-453细胞、第一阴性质控MDA-MB-231细胞和第二阴性质控WI-38人胚胎肺细胞的DNA，作为模板备用，共17个DNA模板；

(2)配制反应体系：按照下表2配制20μl的dPCR反应体系(不添加DNA模板)。

表2：dPCR反应体系

(3)准备样品：分别把17个DNA模板转移至配制完成的反应体系中后，涡旋混匀后离心保证无气泡。将配制完成的反应体系20μl和70μl微滴生成油置于DG8板上，使用液滴发生器(QX200，BioRad，美国)在其中生成纳升级的油包水微滴。微滴转移至96孔PCR板，用铝箔热封膜(PX1，BioRad，美国)密封。

(4)PCR反应：将铝箔热封膜密封的96孔PCR板置于热循环仪(C1000，BioRad，美国)中，反应条件为第一步95℃10min；第二步94℃30s、60℃60s、并重复40个循环；第三步98℃10min。第一步和第二步的升降温幅度为2℃/s。

(5)扩增产物分析：PCR结束后，将PCR板转移到液滴阅读器(QX200，BioRad，美国)，并使用dPCR提供的软件包(QuantaSoft 1.7.4，BioRad，美国)收集和分析数据。

数据分析具体操作为：

打开QuantaSoft软件，导入检测数据，选择Analyze模块对数据进行分析：确认所有样本类型的微滴生成数在10000以上(只有在此范围内，检出的数据的CV值保持在1.6％以内)；选择1D Amplitude，确定靶基因(HER2基因)探针和内参基因探针的荧光阈值；QuantaSoft软件根据泊松分布计算每个样本20μL反应体系所含的模板拷贝数，利用FAM拷贝数/VIC拷贝数，计算出HER2的扩增突变率，结果如图1所示。

根据图1所示的结果，可见第二阴性质控(商品化WI-38人胚胎肺细胞)的dPCR检测值约为1(即HER2的扩增突变率约为1，HER2基因处于正常扩增状态)，这与实际情况相符(因为人正常组织样本中HER2基因拷贝数与作为内参基因的CEP17的拷贝数应相同)；第一阴性质控(MDA-MB-231细胞)的dPCR检测值约为1.164，这与其本身为人乳腺癌细胞但属于HER2阴性的实际情况相符；第一阳性质控(SK-BR-3细胞)的dPCR检测值高达7以上，表明HER2基因在SK-BR-3细胞中处于高的扩增突变状态，第二阳性质控(MDA-MB-453细胞)的dPCR检测值约为2.645，也表现为HER2阳性；而根据上述13个单克隆细胞株的dPCR检测值，可发现编号为A5(dPCR检测值约为1.149)、B1(dPCR检测值约为1.174)的单克隆细胞株中HER2基因的扩增突变率较低(即HER2基因的扩增突变不明显)，与第一阴性质控的情况大致相同，因此不宜作为HER2-low细胞株；而编号为A11、B5、D6、E7、E9、F3、F4、F9、G3、G9的单克隆细胞株的dPCR检测值均大于2，甚至大于3，因此这些单克隆细胞株可能均属于HER2阳性，因此这些细胞株也不宜作为HER2-low细胞株；编号为E1的单克隆细胞株的dPCR检测值约为1.667，比第一阴性质控的扩增突变率高，但又不超过2，因此编号为E1的单克隆细胞株有望作为HER2-low细胞株。

1.4、E1单克隆细胞株作为HER2-low细胞株的验证

(1.4.1)在该步骤中进一步采用dPCR方法对上述步骤1.3中筛选的有望作为HER2-low细胞株的E1单克隆细胞株中的HER2的扩增突变率再次检测，其中仍以SK-BR-3细胞作为阳性质控，以MDA-MB-231细胞作为第一阴性质控，以WI-38人胚胎肺细胞作为第二阴性质控，每个样本重复检测6次，具体检测方法如上述步骤1.3中(1.3.2)所示，检测结果如图2所示。

由图2可知，对E1单克隆细胞株的6次dPCR检测值均处于2以下(范围为1.632-1.775，平均约为1.693)，且均比第一阴性质控(MDA-MB-231细胞)的dPCR检测值(范围为1.033-1.254)高，再次表明该E1单克隆细胞株有望作为HER2-low细胞株，且其中的HER2基因扩增状态很稳定。

在该实验中还通过常规HE染色、免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)验证了E1单克隆细胞株中的HER2基因扩增状态，并以MDA-MB-231细胞作为阴性对照，以SK-BR-3细胞作为阳性对照，具体包括以下操作：

(1.4.2)HE染色

按照苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-Eosin staining)试剂盒(Solarbio)操作对E1单克隆细胞株进行HE染色，结果如图3所示，可见E1单克隆细胞株的细胞结构完整。

(1.4.3)免疫组化(IHC)

将E1单克隆细胞株细胞固定在用4％多聚甲醛(Solarbio，Beijing，China)固定的聚赖氨酸载玻片上20分钟。随后，将细胞载玻片用10％山羊血清封闭，与预稀释的兔抗HER2单克隆抗体4B5单克隆抗体(预稀释；Ventana，Tucson，AZ，USA)在37℃孵育1h，然后用Rabbit IHC Kit(北京4A生物技术有限公司，北京，中国)手动染色。细胞载玻片用苏木精复染，与蓝色试剂一起孵育，并用显微镜观察显色。结果如图3所示，可见MDA-MB-231细胞为HER2阴性，而SK-BR-3细胞为棕黄色，标记为+++。E1单克隆细胞株细胞中度染色，标记为++。

(1.4.4)荧光原位杂交(FISH)

(1)对爬片用多聚赖氨酸处理，例如将爬片放到0.1mg/ml的多聚赖氨酸溶液内浸泡5min，并将处理好的爬片置于培养板的孔内，备用；

(2)将E1单克隆细胞株细胞在完全培养基中消化成单个细胞悬液，随后将细胞悬液滴入步骤(1)的培养板的孔内的爬片上，使E1单克隆细胞株细胞在爬片上生长，备用；

(3)通过在65℃下烘烤步骤(2)制备的生长有E1单克隆细胞株细胞的爬片30分钟来制备细胞载玻片。同步使用Sk-BR-3细胞和MDA-MB-231细胞分别作为阳性对照和阴性对照，按照上述步骤(1)-(3)制备各自的细胞载破片。

分别向所有细胞载玻片上加入胃蛋白酶溶液，并使用双荧光试剂盒PathVysion(Abbott Vysis Probes，Chicago，IL)评估HER2扩增。所有程序均按照制造商的说明进行。将探针变性(73℃，3分钟)并在载玻片上杂交(37℃，17小时)。在用制造商提供的洗涤缓冲液杂交后，在黑暗中洗涤所有细胞载玻片。对载玻片靶区进行DAPI反染，荧光显微镜目测20个细胞的红绿荧光。根据制造商的说明，对细胞载玻片的结果进行定性评估。FISH的结果如图3所示，表明在MDA-MB-231细胞(HER/CEP17比为1.057)和E1单克隆细胞株(HER/CEP17比为1.375)中均没有通过FISH检测到HER2基因的扩增，判定为FISH阴性，而在SK-BR-3细胞中检测到HER2基因的扩增，判定为FISH阳性。

以上结果表明，步骤1.3筛选的E1单克隆细胞株的IHC检测结果为2+，且FISH结果为阴性，完全能够满足临床上对于HER2-low的定义(IHC为1+或2+且FISH为阴性)，且该E1单克隆细胞株中的HER2基因扩增状态非常稳定，因此该E1单克隆细胞株可以用于制备用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料。

将该实施例筛选获得的E1单克隆细胞株命名为“乳腺癌细胞株HER2-Low”，并已经于2022年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为：湖北省武汉市武昌区八一路)，保藏编号为CCTCC NO:C2022227。

实施例2：用于检测HER2-low乳腺癌的参考材料的制备

该实施例利用上述实施例1中筛选获得的单克隆细胞株CCTCC NO:C2022227的细胞悬液对小鼠进行腋下注射，以构建小鼠异种移植模型，并利用该小鼠异种移植模型制备福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)参考材料。在该实施例中使用的6-8周龄的雌性BALB/c Nude裸鼠购自Vital River(中华人民共和国北京)，裸鼠质量18-20g，饲养于无特殊病原(specific pathogens free，SPF)级动物室，所有动物实验均经清华大学动物饲养使用委员会批准，按照相关动物法规进行。具体包括以下操作：

2.1、小鼠异种移植模型的建立

将稀释的验证后的1×10

2.2、FFPE参考材料的制备

1)将步骤2.1获取的异种移植肿瘤在福尔马林溶液中过夜固定，固定后在梯度乙醇系列中洗涤脱水，并洗去残留的福尔马林溶液；

2)经步骤1)的脱水处理后，用二甲苯洗涤透明，随后使用石蜡包埋机(Leica，德国)进行自动组织嵌入包埋处理；

3)包埋以后，蜡块放置于4℃环境下冷藏8h，随后将包埋好的蜡块放置于徕卡RM2255石蜡切片机上，进行切片，FFPE切片厚度为5μm，即得到FFPE参考材料。

按照苏木精-伊红染色法试剂盒操作通过HE染色观察FFPE参考材料中每个FFPE肿瘤组织的组织学和细胞形态，同步以经IHC验证过典型HER2-low状态的浸润性乳腺癌手术标本(IHC为2+)作为参考。结果如图4所示，可见FFPE参考材料中的肿瘤细胞百分比在80％以上。

2.3、FFPE参考材料的临床标本一致性验证

(2.3.1)FFPE参考材料的免疫组化(IHC)

将步骤2.2制备的FFPE参考材料完成二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，用抗原修复液(ZSGB-BIO，Beijing，China，pH 8.0)高压热修复使得抗原暴露，胃蛋白酶消化室温10min。IHC染色的评分按照2018年ASCO/CAPHER2 update guideline做出。

结果如图4所示，可见FFPE参考材料被中度染色，标记为2+，与经IHC验证过典型HER2-low状态的浸润性乳腺癌手术标本的IHC结果一致。

(2.3.2)FFPE参考材料的荧光原位杂交(FISH)

将步骤2.2制备的FFPE参考材料完成前处理脱蜡、热预处理和蛋白酶处理后，使用双荧光试剂盒PathVysion(Abbott Vysis Probes，Abbott Laboratories，Chicago，IL)评估HER2基因扩增状态。所有程序均按照试剂盒制造商的说明进行。

结果如图4所示，在低倍镜下对FFPE参考材料进行检测，随机计数的20个肿瘤细胞的二向色信号显示HER2/CEP17比小于2.0(1.147)，判定为FISH阴性，与经IHC验证过典型HER2-low状态的浸润性乳腺癌手术标本的FISH结果一致。

2.4、FFPE参考材料的均一稳定性验证

该实验中使用dPCR方法对FFPE参考材料的均一稳定性进行验证，具体包括以下操作：

1)将FFPE参考材料蜡块切分为50个切片(10μm厚)，从中随机抽取10个切片用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen，Hilden，德国)提取基因组DNA用于dPCR定量检测HER2，具体检测方法参照实施例1中步骤(1.3.2)。

结果如图5中A幅所示，基于单因素方差分析，随机选取的10个切片样品的结果之间没有显著性差异。

2)将FFPE参考材料切片分别在37℃、室温和4℃下储存1周、2周、1个月和2个月后，从这些参考材料中提取基因组DNA，使用dPCR方法对参考材料中的HER2进行定量检测，具体检测方法参照实施例1中步骤(1.3.2)。

结果图5中B幅所示，可见分别在37℃、室温和4℃下储存1周、2周、1个月和2个月后的FFPE参考材料均没有观察到显著差异，表明本发明提供的FFPE参考材料是完全均质的，并且它们至少可以稳定保存2个月。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。