一种猫过敏原Fel d1融合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程的技术领域，具体涉及一种猫过敏原Fel d1融合蛋白及其应用。

背景技术

猫毛皮屑中的致敏蛋白是导致猫毛过敏的主要原因之一，目前已经鉴定出猫毛皮屑致敏蛋白共有8种成分，包括Fel d1～8蛋白，其中，Fel d1蛋白是最早发现，也是主要的致敏蛋白，约90％对猫过敏者血清中可检测到针对Fel d1的IgE特异性抗体。这些致敏蛋白非常微小，可随着猫咪活动，附着在沙发、地毯或衣物上，也可能在猫咪舔舐毛发时，过敏原附着在空气颗粒中，于是当患者吸入或皮肤接触过敏原时就会发生过敏反应。

大部分猫毛过敏患者，会出现皮肤过敏症状：皮肤过敏最常见的荨麻疹，常有皮肤瘙痒、红斑、风团，呈鲜红色或苍白色；其他过敏患者，可能会有过敏性鼻炎、过敏性哮喘、消化道过敏、过敏性休克等症状，这些过敏反应给人们的生活带来了极大的不便。

在过敏机制方面，研究表明，Fel d1蛋白可以通过诱导TH2和IgE反应来引发过敏反应。此外，Fel d1蛋白还可能影响多种细胞类型，如树突状细胞、B细胞和T细胞等，从而参与过敏反应的启动和调节。

通过影响Fel d1蛋白的作用来预防或治疗猫毛过敏是当下的一种主要途径，如制备蛋白疫苗或特殊的含抗体的功能性猫粮等进而针对人或猫采取干预措施。而无论是蛋白疫苗还是含抗体的功能性猫粮的制备都需要Fel d1蛋白，常规的蛋白表达方法之一是将相关基因克隆至原核表达系统中，为提高免疫原性，相关基因也可以与T细胞表位基因连接，但是该蛋白表达方法表达量有限，大幅提高蛋白表达量能够极大提高生产效率从而节约资源；为了获取较高免疫原性的蛋白，在融合蛋白中增加T细胞表位以加强免疫原性。具有高表达的蛋白未必能够维持较强免疫原性，而具有较强免疫原性的融合蛋白往往不能保证具有较高表达量。因此选择一种T细胞表位，能够实现高效表达制备Fel d1蛋白显得尤为重要。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种猫过敏原Fel d1融合蛋白及其应用。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种猫过敏原Fel d1融合蛋白，所述Fel d1融合蛋白包括采用Feld1(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)或Fel d1与不同抗原的T细胞表位串联的基因，与标签蛋白构建于表达载体得到重组质粒，转至表达菌株，经表达得到融合蛋白；

对Fel d1蛋白结构分析、等电点、疏水性分析，选择合适的抗原表位，所述不同抗原的T细胞表位包括粉尘螨1类变应原Der f 1上的T细胞表位、黄瓜花叶病毒TGBp3蛋白的T细胞表位；

所述粉尘螨1类变应原Der f 1上的T细胞表位包括Der f 1氨基酸206-223位的QM表位(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)、Der f1氨基酸75-94位的DS表位(氨基酸序列如SEQID NO.3所示)；

所述黄瓜花叶病毒TGBp3蛋白的T细胞表位包括CuMVTT(CM)表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述Fel d1、不同抗原的T细胞表位分别先经过大肠杆菌密码子优化后合成构建于表达载体；

所述表达载体包括大肠杆菌表达载体BL21、cBL21、BL21(DE3)、BL21codonplus(DE3)、BL21 Star(DE3)、B834(DE3)、Tuner(DE3)、Rosetta(DE3)、Rosetta2(DE3)、ArcticExpress(DE3)、Origami(DE3)、Origami2(DE3)、OrigamiB(DE3)、SHuffle T7、ER2566、OverExpress C43(DE3)、BLR(DE3)、HMS174(DE3)、GT115、MG1655、NovaBlue(DE3)的一种；

所述表达菌株包括BL21、cBL21、BL21(DE3)、BL21codonplus(DE3)、BL21 Star(DE3)、B834(DE3)、Tuner(DE3)、Rosetta(DE3)、Rosetta2(DE3)、Arctic Express(DE3)、Origami(DE3)、Origami2(DE3)、OrigamiB(DE3)、SHuffle T7、ER2566、OverExpress C43(DE3)、BLR(DE3)、HMS174(DE3)、GT115、MG1655、NovaBlue(DE3)的一种；

所述猫过敏原Fel d1融合蛋白包括Fel d1-H、QM-Feld1-H、DS-Feld1-H、CM-2Feld1-CM-H、CM-Fel d1-CM-Fel d1-H、2CM-2Fel d1，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5～10所示，经密码子优化后的核酸序列分别如SEQ ID NO.11～16所示。

本发明还提供了上述猫过敏原Fel d1融合蛋白用于制备抗猫过敏原Fel d1过敏的药物及功能性猫粮；

所述功能性猫粮的制备方法包括：将上述猫过敏原Fel d1融合蛋白对产蛋鸡进行免疫，收集卵黄，卵黄抗体效价达5×10

本发明的有益效果如下：

本发明的猫过敏原Fel d1融合蛋白，采用Fel d1与不同抗原T细胞表位串联得到融合蛋白，所选择的抗原表位以及融合表达产生较高表达量的融合蛋白，同时还能够提高蛋白的免疫原性，从而获得足够高的抗体效价。本发明在构建不同的表达载体后，筛选出合适的表达方案，并且所表达蛋白具有较高的免疫原性，能够高效免疫动物并获取相应抗体，QM-Fel d1、DS-Fel d1、CM-2Fel d1-CM具有较高的免疫原性，免疫母鸡，均能够产生高效价的卵黄抗体，显著优于Fel d1、CM-Fel d1-CM-Fel d1，QM-Fel d1、DS-Fel d1、CM-2Fel d1-CM融合蛋白可用于高效价卵黄抗体的制备，所制备的卵黄抗体可用于制备降低猫Fel d1含量的功能性猫粮，降低接触人员过敏的发生率；因此本发明解决了现有技术中Fel d1及其融合蛋白表达量受限和免疫原性低的问题。

附图说明

图1为Fel d1及融合蛋白载体构建示意图；

图2为本发明重组原核菌株的PCR检测结果；

图3为本发明重组原核菌株的诱导表达的SDS-PAGE结果；

图4为本发明重组原核菌株诱导表达后的Western blot结果。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例

一种猫过敏原Fel d1融合蛋白及其构建方法

1.全基因片段的合成及重组质粒的构建

将Fel d1、QM-Fel d1、DS-Fel d1、CM-2Fel d1-CM、CM-Fel d1-CM-Fel d1、2CM-2Fel d1氨基酸序列与组氨酸融合后(融合后的蛋白氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5～10所示)进行大肠杆菌密码子优化后(核酸序列分别如SEQ ID NO.11～16所示)，由南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成于大肠杆菌表达载体pET30a，克隆位点为NdeI，BamHI，构建示意图如图1所示，重组质粒为pET30a-Fel d1-H、pET30a-QM-Fel d1-H、pET30a-DS-Feld1-H、pET30a-CM-2Fel d1-CM-H、pET30a-CM-Fel d1-CM-Fel d1-H、pET30a-2CM-2Fel d1-H；

所述大肠杆菌表达载体还可以为pET-3a、pET-11a、pET-12a、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b、pET-19b、pET-20b、pET-21a、pET-22b、pET-23a、pET-24a、pET-25b、pET-26b、pET-27b、pET-28a、pET-29a、pET-31b、pET-32a、pET-33b、pET-34b、pET-35b、pET-37b、pET-39b、pET-40b、pET-41a、pET-42a、pET-43.1a、pET-44a、pET-45b、pET-47b、pET-48b、pET-49b、pET-50b、pET-51b、pET-52b、pETDuet-1、pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pRSFDuet-1、pColaDuet-1。

2.重组大肠杆菌表达菌株的构建

将以上全基因合成的质粒pET30a-Fel d1-H、pET30a-QM-Fel d1-H、pET30a-DS-Fel d1-H、pET30a-CM-2Fel d1-CM-H、pET30a-CM-Fel d1-CM-Fel d1-H转化至感受态细胞BL21(DE3)；

所述感受态细胞还可以为BL21、cBL21、BL21(DE3)、BL21codonplus(DE3)、BL21Star(DE3)、B834(DE3)、Tuner(DE3)、Rosetta(DE3)、Rosetta2(DE3)、Arctic Express(DE3)、Origami(DE3)、Origami2(DE3)、OrigamiB(DE3)、SHuffle T7、ER2566、OverExpressC43(DE3)、BLR(DE3)、HMS174(DE3)、GT115、MG1655、NovaBlue(DE3)；

2.1从-80℃冰箱中取出表达感受态细胞(BL21(DE3))，冰浴融化，按照1:10的体积比向新的无菌1.5mL EP管中加入1μL构建后的质粒和10μL的感受态，轻轻吹打混匀，冰浴30min；

2.2然后42℃热应激90s，再冰浴5min；

2.3向离心管中加入200μL的无抗LB液体培养基，37℃温和振荡培养60min；

2.4将重悬菌液均匀涂布于含50μg/mL Kana的LB固体培养基上,放入37℃培养箱中正面放置培养约15min，至液体全部吸收后将平板倒置培养12-16h。

3.3.重组原核菌株的PCR鉴定

用灭菌枪头细挑上述LB平板上生长的具有Kana抗性的单菌落，每个平板挑取3个菌落，菌落挑入2mL含50μg/mL Kana的LB液体培养基中，37℃，200r/min激活培养4h；

培养好的菌液按照下表体系和程序进行菌液PCR鉴定。

表1PCR鉴定体系

所述上游引物F的核酸序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物R的核酸序列如SEQ IDNO.17所示。

表2重组菌液PCR鉴定程序

结果如图2所示，各组均筛选到重组大肠杆菌阳性菌株；图2中M：5000bpDNAMarker；N：阴性对照；1～3：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-Fel d1-H的菌液；4～6：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-QM-Fel d1-H的菌液；7～9：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-DS-Fel d1-H的菌液；10～12：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-CM-2Fel d1-CM-H的菌液；13：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-CM-Fel d1-CM-Fel d1-H的菌液；14-15：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-2CM-2Fel d1-H的菌液。

4.重组原核菌株的诱导表达

4.1将上述鉴定阳性且核酸条带较亮的菌株按照1％体积比例接菌至100mL含50μg/mL Kana的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养4h至OD600＝0.6～0.8；

4.2向上述菌液中添加相应浓度的IPTG，于37℃，200r/min过夜振荡培养诱导；

4.3取过夜表达菌液进行超声破碎(超声条件为：5s超声，5s间歇，10min，30％功率)，破碎样品离心(12,000rpm，4℃，离心10min)收集上清和沉淀；

取适量沉淀用于SDS-PAGE，检验蛋白的表达情况，进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示，重组大肠杆菌诱导表达破碎菌体中目的蛋白的含量情况：QM-Fel d1组、CM-2Fel d1-CM组的表达量显著优于Fel d1组、DS-Fel d1组、CM-Fel d1-CM-Fel d1组、2CM-2Fel d1组。图中M：低分子量蛋白Marker；N：阴性对照；1～3：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-Fel d1-H的诱导菌体；4～6：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-QM-Fel d1-H的诱导菌体；7～9：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-DS-Fel d1-H的诱导菌体；10～12：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-CM-2Fel d1-CM-H的诱导菌体；13：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-CM-Fel d1-CM-Fel d1-H的诱导菌体；14-15：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30a-2CM-2Fel d1-H的诱导菌体

5.Western blot分析

重组菌诱导表达后超声破碎收集的菌体稀释1-20倍后进行Western blot检测。一抗:Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody；二抗:HRP Goat Anti-Mouse IgG。

结果如图4所示，诱导沉淀中蛋白大小正常，实现重组Fel d1的表达。

6.6.表达产物的粗提、复性以及纯化

6.1 1g湿菌体加入10g裂解液(40mM Tris，0.1～0.2M NaCl，pH7.0～9.0)，磁力搅拌30～60min；

6.2重悬后菌体混悬液在冰浴中，然后进行超声破碎，破碎条件为65％功率，超声5s，停5s，总共破碎20min；

6.3 10000g，4℃，离心20min，弃上清，沉淀加入裂解液相同体积的包涵体洗涤液(40mM Tris，0.1M NaCl，2～4M Urea，0.5～1％ Triton X-100，pH7.0～9.0)，磁力搅拌30～60min；

6.4 10000g，4℃，离心20min，弃上清，沉淀加入裂解液相同体积的包涵体溶解液(40mM Tris，0.1M NaCl，6～8M Urea，pH7.0～9.0)，室温磁力搅拌4～16h；

6.5 10000g，4℃，离心20min，上清经0.45um过滤后进行复性，复性方法为稀释复性，将复性液边搅拌边缓慢加入蛋白中，复性液为40mM Tris，0.1～0.3M NaCl，0.3～0.5MArg，1～5mM GSH，0.1～0.5mM GSSH，pH7.0～9.0)，复性温度4～8℃，稀释倍数10～30倍，复性时间12～48h；

6.6稀释复性后样品经0.45um过滤后进行耐还原剂Ni柱亲和层析获得高纯度的复性后活性目标产物；

6.7层析后样品经5KD超滤膜包进行浓缩透析，最终浓度为1～2mg/mL，最终溶液为0.1～0.3M山梨醇，0.05～0.1M乙酸钠缓冲液，pH4.0～5.0。

7.原核菌株的培养及产量比较

将6株重组原核菌株(BL21(DE3)/pET30a-Fel d1-H、BL21(DE3)/pET30a-QM-Feld1-H、BL21(DE3)/pET30a-DS-Fel d1-H、BL21(DE3)/pET30a-CM-2Fel d1-CM-H、BL21(DE3)/pET30a-CM-Fel d1-CM-Fel d1-H、BL21(DE3)/pET30a-2CM-2Fel d1-H)进行发酵罐发酵进行表达量的比较。

7.1种子液培养基制备

液体LB培养基：在精密天平上称量蛋白胨4g，酵母提取物2g，氯化钠4g，置于1L三角瓶中。加入300mL超纯水溶解，置于搅拌器上搅拌，使其充分溶解，用1mM NaOH调节pH至7.2，将溶液倒入量筒中，加水定容至400mL，121℃高压湿热灭菌20min后，室温保存。

7.2发酵培养基制备

发酵培养基：在精密天平上称量安琪酵母蛋白胨36.0g，安琪酵母浸粉72.0g，丙三醇12g，磷酸二氢钾11.49g，磷酸氢二钾37.62g,置于5L塑料量桶中。加入2800mL超纯水溶解，置于搅拌器上搅拌，使其充分溶解，加水定容至3000mL，将溶液倒入10L自动发酵罐中，121℃高压湿热灭菌20min。

初始补料培养基：在精密天平上称量安琪酵母蛋白胨60.0g，安琪酵母浸粉120.0g，丙三醇35g，置于1L烧杯中。加入900mL超纯水溶解，置于搅拌器上搅拌，使其充分溶解，加水定容至1000mL，将溶液倒入1L蓝盖瓶中，121℃高压湿热灭菌20min。

诱导补料培养基：在精密天平上称量安琪酵母蛋白胨180.0g，安琪酵母浸粉360.0g，丙三醇105g，置于3L烧杯中。加入2800mL超纯水溶解，置于搅拌器上搅拌，使其充分溶解，加水定容至3000mL，将溶液倒入3L蓝盖瓶中，121℃高压湿热灭菌20min。

其他试剂配置：

氨水溶液配置：取150mL超纯水置于500mL蓝盖瓶中，121℃高压湿热灭菌20min，灭菌完成后，降至室温，在洁净工作台往蓝盖瓶加入150mL 28％氨水,配制成50％氨水溶液

磷酸溶液配置：取150mL超纯水置于500mL蓝盖瓶，加入在150mL85％磷酸，摇匀，121℃高压湿热灭菌20min

消泡剂配置：取10mL消泡剂置于100mL蓝盖瓶，加入在90mL超纯水，摇匀，121℃高压湿热灭菌20min；

IPTG诱导剂配置：在精密天平上称量IPTG 11.9g，置于250mL烧杯中。加入80mL超纯水溶解，置于搅拌器上搅拌，使其充分溶解，加水定容至100mL，过滤除菌。

试验过程中除了上述关键原材料外，其他相关试剂、溶液均按相关要求配制。

7.3种子液接种培养

种子液接种培养：将保存于-80℃的种子甘油菌室温解冻，取400ul菌接入400mL液体LB培养基，再加入相对应的筛选抗性，37℃培养16h；

发酵罐培养

(1)准备：将灭菌好的装有发酵初始培养基发酵罐从150L立式高压蒸汽灭菌器取出，连接空气、冷却循环水管道、溶氧、pH探头、补料管道等，做好上罐接种前的准备工作。

(2)培养：将上步1.3制备好的种子400mL接入3L发酵培养基中，设定温度，空气流量，压力值，监控DO与pH值；

(3)补料：当菌种培养0D600达到7-9，开始加入初始补料培养基进行补料

(4)诱导：当菌种培养0D600到15-20，开始加入乳糖诱导剂进行诱导，使外源基因开始表达。

(5)收获：发酵结束后，收集菌液，4000rpm离心30min，倾倒掉上清，收集菌体。

蛋白产率计算，参考前述6.1-6.6方法，收集纯化蛋白，并计算每升发酵液蛋白产量，结果如下表：

表3重组菌株蛋白表达量

由表3可见，QM-Fel d1组、CM-2Fel d1-CM组的表达量均达到1.7g以上，显著优于Fel d1组、DS-Fel d1组、CM-Fel d1-CM-Fel d1组和2CM-2Fel d1组。

8.产蛋鸡的免疫

用上述纯化蛋白Fel d1、QM-Fel d1、DS-Fel d1、CM-2Fel d1-CM、CM-Fel d1-CM-Fel d1分别对6组20周产蛋鸡进行免疫，每组5只。纯化蛋白与氢氧化铝胶混合至mL1mL，混合后氢氧化铝胶20％。混合后的免疫试剂对鸡翅下皮肤多点注射。

蛋白免疫剂量见表4：

表4蛋白免疫程序

首免后1-8周，分别取鸡蛋的卵黄，提取卵黄抗体，对抗体效价进行检测，结果如表5所示，可见3周后，Fel d1组及其融合蛋白组的抗体效价开始大幅升高，4周后的卵黄抗体QM-Fel d1组、DS-Fel d1组、CM-2Fel d1-CM组融合蛋白组的抗体效价明显高于Fel d1组、CM-Fel d1-CM-Fel d1组和2CM-2Fel d1组。

表5卵黄抗体效价检测(Log

9.功能性猫粮制备及效果检测

以QM-Fel d1、CM-2Fel d1-CM、CM-Fel d1-CM-Fel d1、2CM-2Fel d1融合蛋白对产蛋鸡免疫，收集卵黄，当检测卵黄抗体效价达到5×10

将成年雄性猫(体重1.5-2kg/只)50只随机分为实验组和空白对照组，各组10只，实验组喂食喷涂含Fel d1抗体卵黄的功能性猫粮，空白对照组喂食喷涂普通卵黄的基础猫粮，分别于0w、2w、4w、6w、8w，收集各组猫毛，采用Elisa法对猫毛上Fel d1进行检测。

结果如表6所示，QM-Fel d1组和CM-2Fel d1-CM组卵黄抗体制备的猫粮饲喂猫4周后，相比其它融合蛋白以及空白对照组具有显著降低猫毛上致敏蛋白Fel d1的含量。本技术中Fel d1及其融合蛋白制备的卵黄抗体可用于制备防过敏的功能性猫粮。

表6猫毛上Fel d1蛋白检测(μg/g毛发)