一种基于偏振成像的无标记多层级结构样本检测方法

技术领域

本发明属于生物医学光学、食品药品及化工检测系统开发领域，涉及基于分振幅偏振测量的无标记多层级结构样本多模态检测系统。

背景技术

生物医学、药品生产、食品科学、化工等领域涉及到多层级样本的检测，例如活细胞、微纳米包裹液滴等，尽管标记检测技术已在这些领域应用，然而其光毒性、光漂白性、颜色通道有限以及环境污染等问题，制约其广泛应用于各种样本和场景的检测。因此研究一种无标记的多层级样本检测系统及方法具有重要意义。

多层级结构样本，以生物医学领域重要检测对象-细胞为例，目前对细胞进行无标记检测的方法主要是通过光散射信号反演细胞整体尺寸、细胞悬浮液整体折射率以及耦合折射率和高度信息的相位等信息，然而对多层级结构样本内部结构成分的无标记检测却是尚未解决的难题。对此本发明提出一种基于偏振成像的多层级结构样本检测方法，利用分光棱镜将成像光路分为两路，反射光路采用一部光强型CMOS和一部偏振CMOS分别记录光强图和偏振图像，透射光路采用一部偏振CMOS记录偏振图像，对两路进行信息提取和计算得到圆偏振度图像和定量相位图像，进一步计算和图像配准后进行信息融合得到细胞内部折射率分布及精准高度信息，其中高度信息反映样本内部结构，折射率信息反映样本内部成分，因此可以实现多层级结构样本内部结构与成分的检测与反演。

发明内容

本发明目的在于克服上述现有技术不足，为无标记多层级结构样本内部结构成分的检测提供新方法，提出一种基于偏振成像的无标记多层级结构样本检测方法。无需对样本进行标记处理，通过三部相机分振幅同时成像及像素级图像配准，实现无标记状态下静态或动态微米、纳米多层级结构样本的多模态检测，获取样本折射率与精准高度信息，进一步实现多层级结构样本内部结构成分的检测与反演。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明公开的一种基于偏振成像的无标记多层级结构样本检测方法，其检测系统中光路结构主要包括：圆偏振照明、显微放大、偏振度成像以及定量相位成像部分，两路成像均采用偏振相机。

在上述的基于偏振成像的无标记多层级结构样本多模态检测系统中，LED发散光源由透镜准直后被调制成圆偏振光束对样本进行照明，后经过显微放大通过非偏振分光棱镜分光，反射光路进行明场和偏振成像获取样本折射率信息，透射光路进行偏振定量相位成像获取样本相位信息，将折射率n信息和相位

本发明公开的一种基于偏振成像的无标记多层级结构样本检测方法，主要包括以下操作步骤：

S1、样本经圆偏振光照明、显微放大后进行分光，反射光路基于光强型CMOS11和第一偏振CMOS13位置标定后获取样本圆偏振度DOCP信息，透射光路基于第二偏振CMOS18偏振成像获取样本在焦与离焦图像；

S2、依据数学模型σ＝-τ·[ln(DOCP)]

S3、对两成像光路的偏振CMOS进行标定，提取样本及其内部区域位置，将折射率n和相位

S4、相位

在步骤S2中，基于理论数学模型σ＝-τ·[ln(DOCP)]

在步骤S3中，首先对两偏振相机位置进行标定处理，获取两相机图像变换矩阵，两偏振成像光路采集偏振图像，经过去噪处理后提取样本及其内部区域位置，将折射率n和相位

在步骤S4中，相位

在上述的基于偏振成像的无标记多层级结构样本检测方法中，三部CMOS对同一多层级结构样本进行分振幅同时成像，所述样本可以是静态或悬浮液中的动态微米、纳米多层级结构样本，例如活细胞、包裹液滴等。针对本方法可以实现多层级结构内部结构及成分的无标记多模态信息检测的优势，该方法主要应用于生物医学临床检验中的活细胞的病变检测，药品生产、食品科学、化妆品领域中双乳核-壳结构以及多乳包裹液滴包裹率的检测。

本发明利用现有的偏振成像技术和基于偏振的定量相位成像技术，将偏振成像获取的圆偏振度信息与折射率相联系，提出折射率反演方法，并将折射率信息与相位信息相融合，进一步提出样本精准高度信息反演方法，其中高度可以反映样本结构，折射率与样本内部成分相关，因此与现有的无标记检测方法相比，本发明可以实现多层级结构样本内部结构及成分的无标记多模态检测与反演。本发明的优势在于：无需对样本标记任何荧光物质或染料，基于双相机图像配准能够保证同一时刻下对同一静态或动态样本的检测，即对样本无任何损伤的前提下就能够获取样本的折射率和精确高度信息。因此，该方法适用于生物医学临床检验中的无标记活细胞的内部病变检测，以及药品加工、食品科学和化工领域中微米、纳米级的包裹液滴包裹率的检测，因此该方法具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明的检测方法流程图。

图2为本发明检测系统的光路结构图。

图3为本发明检测系统的整体示意图。

其中：1.LED光源；2.第一透镜；3.线偏振片；4.真零级1/4波片；5.待测样品；6.物镜；7.第二透镜；8.反射镜；9.第一非偏振分光棱镜；10.第二非偏振分光棱镜；11.光强型CMOS；12.1/4波片；13.第一偏振CMOS；14.第三透镜；15.空间光调制器SLM；16.第三非偏振分光棱镜；17.第四透镜；18.第二偏振CMOS；19.电源；20.计算机。

具体实施方式

本发明的目的在于为多层级结构样本内部结构成分的无标记检测提供新方法，提出一种基于偏振成像的无标记多层级结构样本检测方法。

本发明公开的多层级结构样本检测方法，其检测系统中光路结构主要包括：圆偏振照明、显微放大、偏振度成像以及偏振定量相位成像部分，偏振度成像部分采用光强型CMOS11和第一偏振CMOS13，偏振定量相位成像部分采用第二偏振CMOS18。其中圆偏振照明以及显微放大部分竖直搭建于面包板上，显微物镜倒置，倒置的目的在于测量悬浮液中的动态样本。基于该系统可以实现静态或动态多层级结构样本的折射率和精准高度信息的多模态测量，从而实现无标记多层级结构样本内部结构与成分的反演。

为实现上述目标，本发明提供如下技术方案：

本发明公开的一种基于偏振成像的无标记多层级结构样本检测方法，包括以下步骤：

S1、基于偏振度成像部分获取样本圆偏振度图像，基于偏振定量相位成像部分获取样本在焦和离焦图像。在步骤S1中涉及以下光路结构与操作：

(1)电源17为LED光源1供电，LED光源1为发散点光源，将LED光源1放置于第一透镜2的焦点处，准直成平行光束。平行光束经过线偏振片3调制成水平偏振光，再经真零级1/4波片4调制成右旋圆偏振光后，对待测样本5进行照明；

(2)入射光经过待测样本后，经倒置的显微物镜6和第二透镜7组成的4f成像系统进行显微放大，放大光束与反射镜8的法线夹角呈45°角入射后沿水平反射，再由第一非偏振分光棱镜9分光，分光后的反射光束再经过第二非偏振分光棱镜10分光，反射光束由光强型CMOS11靶面接收，得到的是光Stokes矢量中第一分量S

(3)经第一非偏振分光棱镜9分光的透射光束，经第三透镜14和第四透镜17组成的第二个4f系统进行成像，第二透镜7和第三透镜14之间的距离为两透镜焦距之和，其中光束在通过第三透镜14后又经过第三非偏振分光棱镜16进行分光，经第三非偏振分光棱镜16分光后的反射光束由位于第二4f系统的傅里叶平面上的空间光调制器SLM15调制后反射，空间光调制器SLM15的工作方向为水平0°偏振方向，而对垂直90°偏振分量无调制作用，空间光调制器SLM15上加载菲涅尔透镜图案，对水平分量(0°)进行相位延迟调制以实现水平分量的离焦，菲涅尔透镜图案可以根据不同离焦距离进行设定。

(4)经过空间光调制器SLM15调制后的光束经反射透射通过第三非偏振分光棱镜16和第四透镜17后，由第二偏振相机18靶面接收，第二偏振相机18拍摄单帧图像，提取0°和90°通道图像，即样本离焦与在焦图像。

(5)第一偏振相机13和第二偏振相机18与计算机20相连，将采集图像实时传输进计算机进行处理。

S2、利用圆偏振度图像恢复样本折射率分布图像，利用在焦与离焦图像恢复样本相位分布图像。在步骤S2中涉及以下光路结构与操作：

(1)圆偏振度图像包含了样本对圆偏振的保偏程度信息，基于数学模型σ＝-τ·[ln(DOCP)]

(2)第二偏振相机16采集单帧图像可以提取在焦和离焦图像，光强与相位关系的数学模型-光强传输方程为

S3、以第一偏振CMOS13位置为准，对两偏振CMOS位置进行标定，获取图像转换矩阵，对折射率图像和相位图像进行像素级配准，提取样本及其内部区域位置，将折射率n和相位

S4、相位

在上述的一种基于偏振成像的无标记多层级结构样本检测方法中，三部CMOS对同一多层级结构样本进行分振幅同时成像，所述样本可以是静态或悬浮液中的动态微米、纳米多层级结构样本，例如活细胞、包裹液滴等。针对本方法的多层级结构样本无标记多模态信息检测以实现内部结构及成分反演的优势，该方法主要应用于生物医学临床检验中的活细胞的病变检测，药品生产、食品科学、化妆品领域中双乳核-壳结构以及多乳包裹液滴包裹率的检测。

本发明利用现有的偏振成像技术和基于偏振的定量相位成像技术，首次提出将偏振成像获取的圆偏振度信息与折射率相联系，建立所述样本精准折射率分布反演方法，并首次提出将精准折射率信息与相位信息相融合，建立样本精准高度信息反演方法。其中高度可以反映样本结构，折射率与样本内部成分相关，因此与现有的无标记检测方法相比，本发明可以实现多层级结构样本内部结构及成分的无标记多模态检测与反演。本发明的优势在于：无需对样本标记任何荧光物质或染料，基于图像配准能够保证同一时刻下对同一静态或动态多层级结构样本的检测，即对样本无任何损伤的前提下就能够获取样本的折射率和精确高度信息，进一步实现样本内部结构及成分的反演。因此，该方法适用于生物医学临床检验中的无标记活细胞的内部病变检测，以及药品加工、食品科学和化工领域中微米、纳米级的包裹液滴包裹率的检测，因此该方法具有广泛的临床、食品药品与化工应用前景。