一种基于氧化铝膜纳米孔门控的双模传感器及其应用

技术领域

本发明涉及光电检测与比色检测相结合在生物传感技术领域的应用，特别涉及一种基于氧化铝膜纳米孔门控的双模传感器及其应用，具体地，涉及一种基于氧化铝膜纳米孔门控的光电化学与目视比色双模式传感器及其构建方法和在检测T-2毒素上的应用。

背景技术

光电化学(PEC)传感分析是一种基于光电化学原理，在光源存在下将被检测物的信息以电信号形式输出的分析方法。因为输入能量与输出信号的不同，具有背景信号低、灵敏度高、仪器简单、易于操作等诸多优点。光电活性材料作为 PEC 过程中光能与电能和化学能之间转化的媒介一直以来都受到大量关注。CdS作为一种具有合适带隙的半导体光电材料。此外，核酸分子或一些小分子与人体疾病密切相关或者关乎食品安全，开发相应灵敏且方便的光电传感平台具有重要意义。目视比色法是种常见的化学分析方法，它利用物质溶液的颜色深浅来判断其浓度大小。这种方法简单易行，不需要复杂的仪器设备。目视比色法的原理是基于比色法的基本原理，即物质溶液的颜色深浅与其浓度大小成正比。在进行目视比色法实验时首先需要准备一组标准溶液，然后将待测溶液与标准溶液进行比色，通过比较两者的颜色深浅来判断待测溶液的浓度大小。目视比色法的优点是简单易行，不需要复杂的仪器设备，可以快速得到结果。但是存在一些缺点，比如受到光线色差等因素的影响，容易产生误差。

纳米孔材料是指孔径在1～100nm具有显著表面效应的含有孔洞结构且具有一定孔隙率的材料，因其在原子、分子和纳米尺度上存在可控尺寸的空隙，能够区分分子和团簇，并与之相互作用，且具有较好的稳定性、良好的耐用性、良吸附动力、高选择性及高吸附量等优点而广泛应用于生物传感器、药物传递、气体分离、能源存储和燃料电池技术、纳米催化和光子学等方面。多孔氧化铝(AAO)膜作为一种纳米孔材料，结构稳定、孔径易于控制、生物相容性好、制备成本低及可重复使用，可以应用在生物传感、DNA传感器、药物传递和电化学传感器等领域。

迄今为止已经分离和鉴定出来的霉菌毒素有100多种。T-2毒素作为拟枝孢镰刀菌代谢产生的有毒性的代谢产物，广泛分布在谷类产品及动物饲料当中，并且性质稳定，难以清除。人畜长期接触，会对身体组织造成严重损害，紊乱以及生长缓慢甚至死亡。目前对于T-2毒素的检测方法有：薄层色谱法、高效液相色谱-质谱联用，酶联免疫吸附法、电化学分析法等。虽然这些方法精确，但存在时间长、成本高、操作复杂等缺点，在实际应用方面存在局限性。所以，针对这种情况，开发一种简单、快速、低成本的分析方法是非常有必要的。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于氧化铝膜纳米孔门控的双模传感器及其应用。本发明提供的双模传感器集操作简单、灵敏度高、选择性好、低成本化，双重检测等优点为一体，应用在对T-2毒素的检测，极大提高了结果的准确性，可大大减小单传感模式下可能出现的检测假阳性。

技术方案：本发明提供了一种基于氧化铝膜纳米孔门控的双模传感器，包括电化学工作站、光电检测区域和比色检测区域，所述电化学工作站与所述光电检测区域工作连接，所述光电检测区域与所述比色检测区域通过孔道内修饰了纳米金和适配体且处于关闭状态的氧化铝膜纳米孔门控分隔；待检测物与所述适配体结合后，所述氧化铝膜纳米孔门控打开，其打开程度及范围与所述待检测物的量相关，进而通过所述光电检测区域和所述比色检测区域分别对检测区域内光电流的大小和比色强度的强弱进行检测，得到所述待检测物的浓度。

进一步地，所述电化学工作站通过工作电极、参比电极和对电极与所述光电检测区域工作连接：若所述工作电极上的修饰材料为阳极光电半导体材料，则光电检测区域内具有还原性试剂，比色检测区域内具有与氧化性试剂发生颜色变化的体系；

若所述工作电极上的修饰材料为阴极光电半导体材料，则光电检测区域内具有氧化性试剂，比色检测区域内具有与还原性试剂发生颜色变化的体系。

进一步地，所述工作电极为CdS/ITO修饰电极；所述CdS/ITO修饰电极的具体制备方法为：

将CdS量子点滴涂在洗涤并烘干后的ITO表面，再滴加萘酚溶液，形成均匀的薄膜固定材料，自然风干，得CdS/ITO修饰电极。

优选地，所述参比电极为Ag/AgCl参比电极；所述对电极为Pt对电极。

进一步地，所述光电检测区域内具有含抗坏血酸的PBS溶液；所述比色检测区域具有含TMB，H

进一步地，所述PBS溶液的pH＝7.4，浓度为0.1mol/L；所述PBS溶液中，抗坏血酸的浓度为1-10 mmol/L；

所述NaAc-HAc溶液的pH＝3.5，浓度为0.1mol/L；所述NaAc-HAc溶液中，H

进一步地，所述氧化铝膜纳米孔门控的具体制备方法为：

将Au NPs溶液与正己烷混合均匀，滴入无水乙醇，待分层后，Au NPs在液-液界面聚集，形成Au NPs膜；将AAO膜置于所述Au NPs膜上，使所述Au NPs膜自动吸附至所述AAO膜的表面，加热烘干，形成Au-AAO纳米膜；用PBS溶液为溶剂配制T-2毒素适配体溶液并滴加至Au-AAO纳米膜上，反应，接着用PBS溶液淋洗去除未吸附的适配体，再滴加MCH溶液以封闭非特异性活性位点，得氧化铝膜纳米孔门控apt/Au-AAO。

进一步地，所述Au NPs溶液、正己烷与无水乙醇的体积比为10∶5∶8；

所述PBS溶液的6.0-8.0，浓度为0.1-1 mol/L；

所述MCH溶液的体积为10-50 μL，浓度为0.5-10 mmol/L。

进一步地，所述T-2毒素适配体溶液的体积为20μL，浓度为0-10

进一步地，所述反应的具体条件为：反应温度4-6℃，反应时间12h。

本发明还提供了一种如上述任一项所述双模传感器在检测T-2毒素上的应用。

理论解释：本发明构建的双模传感器，氧化铝膜纳米孔门控中，通过在氧化铝膜的纳米孔道内修饰纳米金和适配体，纳米金自身体积以及适配体的伸展会堵塞掉部分氧化铝膜上的纳米通道；氧化铝膜纳米通道的传质能力受到抑制，传感器处于“关闭”状态；当待检测物存在，待检测物与适配体结合后，适配体会发生卷曲折叠并会打开部分纳米通道，将传感器门控系统从“关闭”状态切换到“打开”状态；氧化铝膜的纳米通道的打开程度及范围与待检测物的量相关：待检测物的量越多，氧化铝膜的纳米通道打开范围越大，光电检测区域内的反应物和比色检测区域内的反应物通过纳米通道的通量越多，光电流变化越大、比色强度变化越明显；待检测物的量越少，氧化铝膜的纳米通道的打开范围越小，光电检测区域内的反应物和比色检测区域内的反应物通过纳米通道的通量越少，光电流变化越小、比色强度变化越弱。光电检测区域内的反应物和比色检测区域内的反应物可以自发地发生氧化还原反应并且它们的浓度分别决定了光电流的大小和比色强度的强弱。通过测定光电流的大小和比色强度的强弱，从而可以测定毒素的浓度。

有益效果：与现有技术相比，本发明设计的基于氧化铝膜纳米孔门控的双模传感器将检测信号与待检测物进行了空间分离，减少了传感器组装的步骤，可有效提高检测的准确度；检测信号更多地受纳米孔控制，而非检测信号本身，有助于提高检测的灵敏度；对同一待检测物可以做到双重信号的同时检测，两种检测信号互相验证，相比单信号检测，可减小单信号模式下可能出现的检测假阳性、假阴性。本发明集操作简单、灵敏度高、选择性好、低成本化，双重检测等优点为一体，有助于开发成低廉的功能性检测试剂盒。

附图说明

图1为本发明基于氧化铝膜纳米孔门控的双模传感器的装置图；其中，1、双模传感器；2、光电检测区域；3、比色检测区域；4、CdS；5、TMB；6、AA；7、纳米酶催化剂；8、工作电极；9、对电极；10、参比电极；11、氧化铝膜纳米孔门控；12、待检测物；13、导线；14、电化学工作站；

图2为本发明构建的基于氧化铝膜纳米孔门控的双模传感器的检测机理图；

图3为本发明构建的基于氧化铝膜纳米孔门控的双模传感器中Au-AAO膜纳米通道门控图；

图4为实施方式1中Au NPs的X射线衍射图；

图5为实施方式1中Au NPs的紫外可见吸收光谱图；

图6为实施方式1中AAO膜的扫描电子显微镜图；

图7为实施方式1中Au-AAO纳米膜的扫描电子显微镜图；

图8为不同T-2毒素浓度的lg值与CdS光电传感电流值的线性关系图；

图9为不同T-2毒素浓度与TMB的颜色变化；

图10为TMB的紫外吸图；

图11为不同T-2毒素浓度的lg值与CdS光电响应电流值的线性关系；

图12为不同T-2毒素浓度的lg值与TMB紫外吸收峰的线性关系。

具体实施方式

下面结合实施方式对本发明进行详细的介绍。

实施方式1：

本实施方式提供了一种基于氧化铝膜纳米孔门控的双模传感器（如图1），包括电化学工作站14、光电检测区域2和比色检测区域3，电化学工作站14与光电检测区域2工作连接，光电检测区域2与比色检测区域4通过孔道内修饰了纳米金和适配体且处于关闭状态的氧化铝膜纳米孔门控11分隔；待检测物与适配体结合后，氧化铝膜纳米孔门控11打开，其打开程度及范围与所述待检测物的量相关，进而通过光电检测区域2和比色检测区域3分别对检测区域内光电流的大小和比色强度的强弱进行检测，得到所述待检测物的浓度。

电化学工作站14通过CdS/ITO修饰电极、Ag/AgCl参比电极和Pt对电极与光电检测区域2工作连接。

光电检测区域2内具有含抗坏血酸的PBS溶液；PBS溶液的pH＝7.4，浓度为0.1mol/L；PBS溶液中，抗坏血酸的浓度为5.17mmol/L。

比色检测区域3具有含TMB，H

上述CdS/ITO修饰电极的具体制备方法为：

（1）量取50mL 0.01M CdCl

（2）将ITO玻璃在无水乙醇和去离子水中交替超声洗涤20分钟3次并烘干，用打孔器打孔绝缘胶带，再粘附在ITO玻璃导电面；将CdS量子点滴涂在ITO表面，再滴加萘酚溶液，形成均匀的薄膜固定材料，自然风干，得到CdS/ITO修饰电极。

上述Fe

（1）采用水热法合成水中分散的Fe

（2）取合成的Fe

（3）Fe

上述氧化铝膜纳米孔门控的具体制备方法为：

（1）在烧杯中放入10mL Au NPs溶液，再加入5mL正己烷，混合均匀。之后再向其中滴加8mL无水乙醇，待分层后，可看到Au NPs在液-液界面聚集。之后去除正己烷，Au NPs在气液界面自组装稳定成紧致薄膜。将AAO膜小心放入烧杯内溶液表层，Au NPs膜会自动吸附至AAO膜表面，加热烘干后，形成Au-AAO纳米膜如图3，即Au-AAO纳米孔门控；

（2）用pH＝7.4，0.1mol/L的PBS为溶剂配制浓度为2μmol/L的T-2毒素适配体溶液。T-2适配体序列为：5’-GTAT ATCA AGCA TCGC GTGT TTAC ACAT GCGA GAGG TGAA-SH-3’。将体积为20μL的T-2毒素适配体溶液滴加至Au-AAO上，置于4℃冰箱中反应12h，用pH＝7.4的PBS缓冲溶液淋洗多次以去除未吸附的适配体。然后再滴加20μL 1mmol/L的MCH溶液以封闭非特异性活性位点，得到氧化铝膜纳米孔门控apt/Au-AAO。

本实施方式还提供了一种上述基于氧化铝膜纳米孔门控的双模传感器的构建方法：

将20μL不同浓度的T-2毒素溶液滴加至氧化铝膜纳米孔门控apt/Au-AAO上，并在37℃下孵育45min，得T-2/apt/Au-AAO；将光电检测区域和比色检测区域通过T-2/apt/Au-AAO分隔，光电检测区域内具有含抗坏血酸（AA）的PBS溶液；比色检测区域具有含TMB，H

实施方式2：

本实施方式提供了一种基于氧化铝膜纳米孔门控的双模传感器在在检测T-2毒素上的应用，具体步骤为：

S1. 按照实施方式1构建出基于氧化铝膜纳米孔门控的双模传感器，其中，取20μL不同浓度的T-2毒素溶液滴加至氧化铝膜纳米孔门控apt/Au-AAO上，并在37℃下孵育45min，制备T-2/apt/Au-AAO；apt/Au-AAO膜上负载的T-2毒素的浓度不同（导致膜通道打开的范围不一样），相同时间内通过apt/Au-AAO膜的AA和H

S2. 将待检测T-2毒素溶液采用实施方式1相同方法构建出基于氧化铝膜纳米孔门控的双模传感器，并检测出CdS/ITO修饰电极的光响应强度电流值和TMB的紫外吸收峰，将结果代入标准曲线A和标准曲线B中，即可得出待检测T-2毒素溶液的浓度。如图11-12所示，T-2病毒在1 ng/mL-106 ng/mL 之间具有非常好的线性范围。

上述实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。