一种生物样本中多司马酯定量检测的方法

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种生物样本中多司马酯定量检测的方法。

背景技术

多司马酯(Dosmalfate)是香叶木苷七硫酸酯的碱式铝盐(化学结构式如下)，属于含铝的黄酮类化合物，是天然植物成分地奥司明经过结构改造合成的胃粘膜保护剂。

多司马酯片为淡黄色，在水、甲醇或氯仿中几乎不溶，在稀盐酸溶液中易溶，在1mol/L的氢氧化钠溶液中溶解，分子量为2349.96，化学结构中含铝、硫以及香叶木苷七硫酸酯3个官能团，结构较复杂。多司马酯为治疗消化道溃疡(胃溃疡和十二指肠溃疡)的良药，少数病人可能出现呕吐，腹痛，腹泻，胃满胀，反酸，烧心，嗳气，皮疹，便秘等不良反应。并且因其难溶于水，普通片剂存在崩解性能较差、起效缓慢、需大剂量使用等缺点，导致临床使用受限。

目前，新药研发开发新靶点越来越难、仿制药竞争越来越大，改良型新药正在成为一个较优选择，逐渐成为研发主力。已有不少研究机构投入到多司马酯的改良型新药研发中，以期通过改制剂、增加适应症等方式扩大多司马酯的临床应用。药代动力学研究是改良型新药临床前研究必须开展的内容。因多司马酯分子量较大，在水和有机溶剂中的溶解性差，且结构复杂，离子化时带多电荷。多电荷的存在给生物样本中的定量检测带来诸多挑战。现有的定量检测多司马酯的方法主要为HPLC法，其检出限为100ng/mL，得到的药代动力学结果为大鼠口服多司马酯后实际上不吸收，在给药动物的血浆或尿液中没有检测到多司马酯；口服12h后，实际上在粪便中可完全回收，排泄半衰期为5～6h。人体研究也显示口服多司马酯后采用HPLC法，在任何一份血浆样本中没有检测到有意义水平的多司马酯结构的酸性有机部分。显然，因现有定量检测血浆、尿液等生物样本中的检测方法灵敏度不足导致多司马酯的药代动力学特征不够明确，无法解释出现不良反应的机制，难以为改良型新药药代动力学研究服务。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种生物样本中多司马酯定量检测的方法。本发明提供的检测方法特异性好，灵敏度高，具有较高的精密度和准确度，其检测结果能够满足药代动力学研究的要求。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种生物样本中多司马酯定量检测的方法，包括以下步骤：

将待测生物样本前处理后和内标物混合，得到待测样品液；所述前处理包括以下步骤：将待测生物样本和蛋白沉淀剂混合进行蛋白沉淀后进行固相萃取；将所述固相萃取后的洗脱液和水混合后进行控温离心；

将所述待测样品液进行超高效液相色谱串联质谱检测，得到多司马酯定量检测结果；

所述超高效液相色谱串联质谱检测包括超高效液相色谱检测和质谱检测；

所述超高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系为流动相A和流动相B，所述流动相A为乙酸铵和甲酸的混合溶液，所述流动相B为氨水和甲醇的混合液；

所述流动相体系的流速为0.4～1.5mL/min；

洗脱方式为梯度洗脱；

所述梯度洗脱的程序为：

0～0.5min：所述流动相A的体积百分含量为95％，所述流动相B的体积百分含量为5％；

0.5～2.5min：所述流动相A的体积百分含量由95％匀速减少到5％，所述流动相B的体积百分含量由5％匀速增加到95％；

2.5～4min：所述流动相A的体积百分含量为5％，所述流动相B的体积百分含量为95％；

4～5min：所述流动相A的体积百分含量由5％匀速增加到98％，所述流动相B的体积百分含量由95％匀速减少到2％；

5～5.6min：所述流动相A的体积百分含量由98％匀速减少到50％，所述流动相B的体积百分含量由2％匀速增加到50％；

5.6～7min：所述流动相A的体积百分含量为50％，所述流动相B的体积百分含量为50％；

7～8min：所述流动相A的体积百分含量为由50％匀速增加到95％，所述流动相B的体积百分含量由50％匀速减少到5％；

所述质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；扫描方式为负离子模式；检测方式为多重反应监测；毛细管电压为2.50kv；锥孔电压为60V；脱溶剂气温度为400℃；脱溶剂气流速为800L/h；锥孔气流速为150L/h；多司马酯的检测离子对为383.20→233.00，锥孔电压为50V，碰撞能量为32V。

优选的，所述流动相A中乙酸铵的摩尔浓度为0.5～5mM，所述流动相A中甲酸的质量百分含量为0.01～0.1％。

优选的，所述流动相B中甲醇为色谱级甲醇，所述流动相B中氨水的质量百分含量为0.1～2.0％。

优选的，所述超高效液相色谱检测的条件：色谱柱为ACQUITY PREMIER PeptideCSH C

优选的，所述内标物为氯沙坦；质谱检测过程中所述氯沙坦的检测离子对为421.13→127.05，锥孔电压为49V，碰撞能量为26V。

优选的，所述蛋白沉淀剂包括色谱级乙腈或色谱级甲醇。

优选的，所述待测生物样本和蛋白沉淀剂的体积比为1:2.8～3.2。

优选的，所述洗脱液和水的体积比为1:0.8～1.2。

优选的，所述控温离心的转速为13000～15000r/min，温度为44℃，时间为9～11min。

优选的，所述待测生物样本包括血清、血浆、组织、尿液、胆汁或粪样。

本发明提供了一种生物样本中多司马酯定量检测的方法，包括以下步骤：将待测生物样本前处理后和内标物混合，得到待测样品液；所述前处理包括以下步骤：将待测生物样本和蛋白沉淀剂混合进行蛋白沉淀后进行固相萃取；将所述固相萃取后的洗脱液和水混合后进行控温离心；将所述待测样品液进行超高效液相色谱串联质谱检测，得到多司马酯定量检测结果；所述超高效液相色谱串联质谱检测包括超高效液相色谱检测和质谱检测；所述超高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系为流动相A和流动相B，所述流动相A为乙酸铵和甲酸的混合溶液，所述流动相B为氨水和甲醇的混合液；所述流动相体系的流速为0.4mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0～0.5min：所述流动相A的体积百分含量为95％，所述流动相B的体积百分含量为5％；0.5～2.5min：所述流动相A的体积百分含量由95％匀速减少到5％，所述流动相B的体积百分含量由5％匀速增加到95％；2.5～4min：所述流动相A的体积百分含量为5％，所述流动相B的体积百分含量为95％；4～5min：所述流动相A的体积百分含量由5％匀速增加到98％，所述流动相B的体积百分含量由95％匀速减少到2％；5～5.6min：所述流动相A的体积百分含量由98％匀速减少到50％，所述流动相B的体积百分含量由2％匀速增加到50％；5.6～7min：所述流动相A的体积百分含量为50％，所述流动相B的体积百分含量为50％；7～8min：所述流动相A的体积百分含量为由50％匀速增加到95％，所述流动相B的体积百分含量由50％匀速减少到5％；所述质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源；扫描方式为负离子模式；检测方式为多重反应监测；毛细管电压为2.50kv；锥孔电压为60V；脱溶剂气温度为400℃；脱溶剂气流速为800L/h；锥孔气流速为150L/h；多司马酯的检测离子对为383.20→233.00，锥孔电压为50V，碰撞能量为32V。本发明限定了特异性定量离子对和前处理方法相结合，建立定量下限为10ng/mL利用超高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)定量测定多司马酯的方法，克服了HPLC法灵敏度不足的问题。本发明提供的检测方法特异性好，灵敏度高，精密度和准确度好，满足生物样本中多司马酯检测的药代动力学研究的需求。

附图说明

图1为UPLC-MS/MS检测大鼠血浆中多司马酯浓度线性代表图(线性范围为10～5000ng/mL)；

图2为UPCC-MS/MS检测空白血浆中多司马酯浓度MRM图；

图3为UPCC-MS/MS检测血浆中LLOQ多司马酯浓度MRM图；

图4为各组大鼠血浆中多司马酯平均血药浓度-时间曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种生物样本中多司马酯定量检测的方法，包括以下步骤：

将待测生物样本前处理后和内标物混合，得到待测样品液；所述前处理包括以下步骤：将待测生物样本和蛋白沉淀剂混合进行蛋白沉淀后进行固相萃取；将所述固相萃取后的洗脱液和水混合后进行控温离心；

将所述待测样品液进行超高效液相色谱串联质谱检测，得到多司马酯定量检测结果。

在本发明中，若没有特殊说明，所采用的试剂均为本领域技术人员所熟知的市售商品。

本发明将待测生物样本前处理后和内标物混合，得到待测样品液。在本发明中，所述前处理优选包括以下步骤：将待测生物样本和蛋白沉淀剂混合进行蛋白沉淀后进行固相萃取；将所述固相萃取后的洗脱液和水混合后进行控温离心。

在本发明中，所述待测生物样本优选包括血清、血浆、组织、尿液、胆汁或粪样，更优选为血浆。在本发明中，所述蛋白沉淀剂优选包括色谱级乙腈或色谱级甲醇，更优选为色谱级乙腈。在本发明中，所述待测生物样本和蛋白沉淀剂的体积比优选为1:2～4，更优选为1:3。在本发明中，所述蛋白沉淀后优选还包括：将蛋白沉淀后体系进行固液分离，取上清液。在本发明中，所述固液分离优选为离心；所述离心的转速优选为13000～15000rpm，更优选为14000rpm；所述离心的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。本发明对所述离心的时间无特殊要求，只要能够实现固液分离即可。

在本发明中，所述固相萃取用试剂盒优选为Waters oasis MAXμElution。在本发明中，所述固相萃取(SPE)用洗脱剂优选为质量浓度为10％的盐酸溶液。

在本发明中，所述水优选为超纯水；所述洗脱液和水的体积比优选为1:0.8～1.2，更优选为1:1。本发明将所述固相萃取后的洗脱液和水混合后还优选包括：将混合后体系进行涡旋；所述涡旋的时间优选为28～32s，更优选为30s。在本发明中，所述控温离心的转速优选为13000～15000r/min，更优选为14000rpm；所述控温离心的温度优选为44℃；所述控温离心的时间优选为9～11min，更优选为10min。

本发明经过前处理将待测生物样本中多司马酯进行富集，利于提高检测的灵敏度和检测结果的精确度。

在本发明中，所述内标物优选为氯沙坦。

本发明对将待测生物样本前处理后和内标物的混合无特殊限定，只要能够混合均匀即可。

得到待测样品液后，本发明将所述待测样品液进行超高效液相色谱串联质谱检测，得到多司马酯定量检测结果。在本发明中，所述超高效液相色谱串联质谱法包括超高效液相色谱检测和质谱检测；所述超高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系为流动相A和流动相B。在本发明中，所述流动相A为乙酸铵和甲酸的混合溶液，所述流动相A中乙酸铵的摩尔浓度优选为0.5～5mM，更优选为2mM，所述流动相A中甲酸的质量百分含量优选为0.01～0.1％，更优选为0.05％，所述流动相A中甲酸优选为色谱级甲酸。在本发明中，所述流动相B为氨水和甲醇的混合液；所述流动相B中甲醇优选为色谱级甲醇；所述流动相B中氨水的质量百分含量优选为0.1～2.0％，更优选为0.5％，所述流动相B中氨水优选为色谱级氨水。

在本发明中，所述流动相体系的流速为0.4～1.5mL/min，优选为0.4～0.8mL/min。

在本发明中，洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：

0～0.5min：所述流动相A的体积百分含量为95％，所述流动相B的体积百分含量为5％；

0.5～2.5min：所述流动相A的体积百分含量由95％匀速减少到5％，所述流动相B的体积百分含量由5％匀速增加到95％；

2.5～4min：所述流动相A的体积百分含量为5％，所述流动相B的体积百分含量为95％；

4～5min：所述流动相A的体积百分含量由5％匀速增加到98％，所述流动相B的体积百分含量由95％匀速减少到2％；

5～5.6min：所述流动相A的体积百分含量由98％匀速减少到50％，所述流动相B的体积百分含量由2％匀速增加到50％；

5.6～7min：所述流动相A的体积百分含量为50％，所述流动相B的体积百分含量为50％；

7～8min：所述流动相A的体积百分含量为由50％匀速增加到95％，所述流动相B的体积百分含量由50％匀速减少到5％。

在本发明中，所述超高效液相色谱检测的条件优选包括：色谱柱优选为ACQUITYPREMIER Peptide CSH C

在本发明中，所述质谱检测的条件包括：离子源为电喷雾离子源(ESI)；扫描方式为负离子模式；检测方式为多重反应监测；毛细管电压(Capillary)为2.50kv；锥孔电压(cone)为60V；脱溶剂气温度(Desolvationtemperature)为400℃；脱溶剂气流速(Desolvation gas flow)为800L/h；锥孔气流速(Cone gas flow)为150L/h；多司马酯的检测离子对为383.20→233.00，锥孔电压为50V，碰撞能量为32V。

在本发明中，质谱检测过程中所述氯沙坦的检测离子对为421.13→127.05，锥孔电压为49V，碰撞能量为26V。

在本发明中，所述质谱检测用质谱仪优选为XEVO TQ Absolute或XEVO TQ-XS；所述超高效液相色谱串联质谱检测用超高效液相色谱质谱联用仪(UPLC-MS/MS)型号优选为UPLC-XEVO TQAbsolute。

在本发明中，所述检测方法的检测线性范围优选为10～5000ng/mL。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一、样品和工作液的配制

1、标准曲线样品的配制

(1)储备液的配制：

多司马酯对照品储备液配制：将10mg多司马酯溶解于质量浓度为10％的盐酸水溶液后，利用盐酸水溶液稀释定容至10mL于棕色容量瓶，得到质量浓度为1mg/mL的多司马酯对照品储备液，冷藏保存。

内标氯沙坦对照品储备液的配制：将10mg氯沙坦溶解于甲醇后，用体积浓度为50％的甲醇水溶液稀释定容至10mL棕色容量瓶，得到质量浓度为1mg/mL的氯沙坦对照品储备液，冷藏保存。

(2)线性样品的配制

用移液器移取适量多司马酯对照品储备液用空白血浆配制为系列浓度为10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mL的多司马酯线性样品。

(3)内标工作液配制：用移液器移取适量氯沙坦对照品储备液用50％甲醇配制为浓度为1000ng/mL的内标工作液。

2、质控样品和质控工作液的配制

(1)质控样品的配制：用移液器移取适量多司马酯对照品储备液对照品储备液用空白血浆配制为系列浓度为10ng/mL、30ng/mL、300ng/mL、3750ng/mL的多司马酯质控样品。

(2)质控工作液配制：用移液器移取适量多司马酯对照品储备液用体积浓度为50％的甲醇水溶液配制为系列浓度为300、37500ng/mL的多司马酯质控工作液。

二、待测样品液的获取

(1)已知血浆样品前处理：精密移取线性样品50μL，加入5μL内标工作液(1000ng/mL)，加入乙腈150μL，涡旋30s，14000r/min离心10min，4℃控温，取上清液，再次14000r/min离心10min，4℃控温，取上清液。

(2)未知血浆样品前处理：精密移取未知血浆样品50μL，加入5μL内标工作液(1000ng/mL)，加入乙腈150μL，涡旋30s，14000r/min离心10min，4℃控温，取上清，再次14000r/min离心10min，4℃控温，取上清液。

三、标准曲线

移取多司马酯线性样品(10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mL)各50μL，按照“二、(1)已知血浆样品前处理”操作步骤进行操作，然后按照超高效液相色谱串联质谱检测的条件进样分析。以多司马酯线性样品的浓度为横坐标，多司马酯线的峰面积与氯沙坦峰面积的比值Y为纵坐标，做线性回归，得到标准曲线，结果为Y＝0.00069133X-0.00134621(r＝0.996213)，如图1所示。用加权最小二乘法计算回归方程，相关系数R

四、方法学验证试验

1、选择性检测

(1)选取6份不同来源的空白血浆样品各50μL，加入乙腈150μL，涡旋30s，14000r/min离心10min，4℃控温，取上清液，再次14000r/min离心10min，4℃控温，取上清液，然后按照超高效液相色谱串联质谱检测的条件进样分析，获得空白血浆样品色谱图，如图2所示。

(2)将最低定量浓度(LLOQ，10ng/mL)的多司马酯和内标工作液5μL加入空白血浆，然后加入乙腈150μL，涡旋30s，14000r/min离心10min，4℃控温，取上清液，再次14000r/min离心10min，4℃控温，取上清液，然后按照超高效液相色谱串联质谱检测的条件进样分析，获得相应色谱图，如图3。

要求目标化合物在空白样品中的峰面积不得超过LLOQ(10ng/mL)样品峰面积的20％，并低于内标响应的5％，即可以接受，由图2～3可知目标化合物在空白样品中的峰面积并未超过LLOQ样品峰面积的20％，且低于内标响应的5％，因此符合标准。

2、定量下限精密度和准确度验证

将30ng/mL、300ng/mL、3750ng/mL三个浓度的质控样品(每个批次每个浓度6个样品)按照超高效液相色谱串联质谱的检测条件进行检测，由三个分析批的数据获得批间精密度和准确度，检测结果见表1～2。其中表1为精密度和准确度的方法学验证结果，表2为定量下限的精密度和准确度方法学验证结果。

定量下限精密度和准确度验证，要求准确度(相对误差：RE％)不超过±20％，精密度(变异系数：CV％)≤20％)；其中CV％＝(标准偏差SD/测得浓度平均值)×100％，RE％＝(测得浓度平均值-标示浓度)/标示浓度×100％；QC样品的浓度由该批次的标准曲线确定。

表1LC-MS/MS测定血浆中多司马酯的精密度和准确度验证结果表

由表1可以看出：UPLC-MS/MS测定血浆中多司马酯的低、中、高浓度QC样品批间精密度CV％分别为2.53％、1.58％、2.29％；批间准确度RE％分别-0.07％、3.88％、-0.48％。

表2LC-MS/MS测定血浆中多司马酯浓度LLOQ的精密度和准确度验证结果表

由表2可以看出：UPLC-MS/MS测定血浆中多司马酯定量下限的批间CV％为4.23％，批间RE％为-2.07％。

3、残留验证

在定量上限(500ng/mL)进样后，设置2个空白样品来考察残留。定量上限后在空白样品中的残留不超过定量下限的20％，并不超过内标响应的5％。残留符合接受标准。

4、基质效应验证

分别取6只动物空白血浆45μL，加入乙腈150μL，涡旋30s，14000r/min离心10min，4℃控温，取上清液，再次14000r/min离心10min，4℃控温，取上清液，然后向所得的上清液中加入低(30ng/mL)、高浓度(3750ng/mL)质控工作液5μL和内标工作液5μL，涡旋混匀后，进样分析。

用体积浓度为50％甲醇代替空白血浆按照空白血浆的操作步骤进行处理后进样分析。通过检测所得目标化合物和内标峰面积比值，计算多司马酯和内标的基质因子；通过分析物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子，计算值的总体变异系数不得大于15％，即符合标准。

基质效应的验证结果见表3，从表3可知：低、高浓度下的目标化合物多司马酯的峰面积比值平均值分别为100.33％、101.13％，内标氯沙坦的峰面积比值平均值分别为101.05％、99.43％，内标归一化的基质因子平均值分别为0.99和1.02，总体变异系数分别为5.96％和2.28％，符合接受标准。

表3LC-MS/MS测定血浆中多司马酯浓度基质效应验证结果表

5、提取回收率验证

取30ng/mL和3750ng/mL的质控样品50μL，加入5μL内标工作液(1000ng/mL)，然后加入乙腈150μL，涡旋30s，14000r/min离心10min，4℃控温，取上清液，再次14000r/min离心10min，4℃控温，取上清液，然后按照超高效液相色谱串联质谱检测的条件进样分析，每个浓度6个样品。另取空白血浆45μL，按“二、(1)已知血浆样品前处理”的操作进行处理，得到上清液，然后向上清液加入30ng/mL和3750ng/mL的0质控工作液5μL和内标工作液5μL，涡旋混匀后，进样分析。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算回收率，回收率数据见表4～5。

表4LC-MS/MS测定血浆中多司马酯浓度提取回收率验证结果表

表5LC-MS/MS测定血浆中内标氯沙坦浓度提取回收率验证结果表

由表4～5可以看出：多司马酯在低、高浓度下平均回收率分别为92.30％、94.02％；内标氯沙坦在低、高浓度下平均回收率分别为91.20％、91.44％。

7、稳定性验证

自动进样器温度下放置24h稳定性：取30ng/mL和3750ng/mL质控样品(QC)50μL，加入5μL内标工作液(1000ng/mL)，然后加入乙腈150μL，涡旋30s，14000r/min离心10min，4℃控温，取上清液，再次14000r/min离心10min，4℃控温，取上清液，每个浓度配制6个样品，置自动进样器温度下放置24h后，测定样品浓度，由测定样品浓度与标示浓度的相对误差(RE％)评价样品置自动进样器温度下放置稳定性，稳定性的测试结果见表6。将测得浓度与标示浓度相比较，每一浓度的均值与标示浓度的偏差应在±15％范围内。

表6LC-MS/MS测定血浆中多司马酯浓度进样器温度下放置24h稳定性验证结果表

从表6可知：UPLC-MS/MS测定大鼠血浆中多司马酯低、高浓度质控样品在进样器温度下放置24h后的检测浓度与标示浓度的相对误差(RE％)分别为1.85％、-0.92％。方法学验证结果该方法符合血浆中多司马酯方法的定量检测分析

实施例2：

多司马酯对SD大鼠单次灌胃给药药代动力学试验研究

18只SD大鼠，雌雄各半，均衡随机分为3组，分别为受试物低、中、高剂量组，每组6只动物，雌雄各半，给药剂量分别为25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg，单次灌胃给药，采血点给药前0h和给药后0.25h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h采血，前腔静脉采血，采血容积约0.3mL，加入肝素钠抗凝，将采血管用2000g相对离心力，20℃离心15min后取上层血浆。样本放于-80℃的冰箱中保存，按照“二、(2)未知血浆样品前处理”操作步骤进行操作，然后按照超高效液相色谱串联质谱检测的条件进样分析，检测大鼠血浆中多司马酯的浓度。

对SD大鼠单次灌胃给予多司马酯混悬液，各受试物组大鼠血浆中多司马酯平均血药浓度-时间曲线图见附图4。由图4可以看出对大鼠单次经口给予剂量为低(25mg/kg)、中(50mg/kg)、高(100mg/kg)剂量的多司马酯，各剂量水平下大鼠血浆中均能检测到一定量的多司马酯，最高平均浓度不超过110ng/mL。

本发明首次建立UPLC-MS/MS定量检测生物样本中多司马酯的方法，较HPLC法灵敏度提高了10倍，克服了HPLC法灵敏度不足的问题，满足多司马酯药代动力学研究生物样本检测要求。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。