一种血清中前列腺素A2的检测方法

技术领域

本发明涉及一种血清中前列腺素A2的检测方法，属于分析检测技术领域。

背景技术

液相色谱和质谱联用技术的研究开始于20世纪70年代。之后，随着接口技术和电离技术的不断进步，液相色谱串联质谱技术已广泛应用于药物分析、毒物筛查、临床检验等领域。液相色谱串联质谱技术具有灵敏度高、特异性强、同时准确定量多种化合物的优势，大大弥补了常规生化和免疫检测方法学上存在的不足，可更好地助力临床精准诊断和治疗。随着现代医学的发展，传统的疾病诊断标志物已无法满足临床需求，越来越多新的疾病诊断标志物被探索出来。液相色谱串联质谱技术可用于检测激素、氨基酸、长链脂肪酸、有机酸、维生素、神经酰胺及其体内代谢产物等多种小分子物质，具有极其重要的临床应用价值。

前列腺素A2(Prostaglandin A2，PGA2)是前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)的内源性代谢产物，在体内是通过PGE2脱水而形成。PGA2能够诱导p53依赖性细胞凋亡，进而发挥抗肿瘤活性。此外，PGA2也具有抗病毒活性，在无毒性剂量下能够抑制病毒复制。目前，可供用于临床诊疗的肿瘤标志物数量较少，且现有的肿瘤标志物往往存在敏感性和特异性低的缺点，不能满足临床精准诊疗的需要。而对于病毒感染来说，除了核酸检测之外，临床也缺乏有效监测病毒感染的特异性指标。因此，肿瘤和感染患者中血清PGA2水平的精准定量具有极其重要的潜在临床意义。

PGA2在体内含量极低(pg级)，且稳定性较差，因此其检测难度较大。之前，人们已经开发出基于气相色谱质谱联用技术的PGA2检测方法，但气相色谱质谱联用技术仅限于应用于300℃左右及以下可以汽化、并且能离子化的待测物或样本，而在加热过程中易分解的、极性太强的化合物，如有机酸类等，则需进行衍生化处理之后才可进行气相色谱质谱分析。因此，气相色谱质谱联用技术难度大、要求高，且PGA2易降解的特性，使其在高温加热过程中不稳定，进而可能导致检测结果不准确。而随着分析技术的发展，液相色谱串联质谱技术则提供了另一种精准检测PGA2的可能。

发明内容

本发明的目的是提供一种血清中前列腺素A2的检测方法，可以快速、准确地检测出血清中PGA2的含量。

本发明提供的血清中前列腺素A2的检测方法，包括如下步骤：

S1、待测样本经前处理，得到上清液；

所述待测样本为血清；

S2、将所述上清液进行液相色谱串联质谱检测；

所述液相色谱串联质谱检测的液相条件如下：

0～6min，流动相A的体积含量由70％调节至50％，流动相B的体积含量由30％调节至50％；

6～6.5min，流动相A的体积含量由50％调节至3％，流动相B的体积含量由50％调节至97％；

6.5～7.9min，流动相A的体积含量保持为3％，流动相B的体积含量保持为97％；

7.9～8min，流动相A的体积含量由3％调节至70％，流动相B的体积含量由97％调节至30％；

8～10min，流动相A的体积含量保持为70％，流动相B的体积含量保持为30％；

所述流动相A为体积含量为0.05％的甲酸溶液，所述流动相B为体积含量为0.05％的甲酸乙腈溶液；

所述液相色谱串联质谱检测的质谱条件如下：

喷雾电压为-4500V，温度为550℃，雾化气为55psi，辅助加热气为55psi，气帘气为35psi。

本发明检测方法中，所述前处理的步骤如下：

将所述待测样本与水混合后涡旋(加入PGA2-D4内标)，所得上清液转移至SPE板中，依次采用水和正己烷进行淋洗，最后采用洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，经氮气吹干、复溶后离心；

所述洗脱剂为甲醇与乙腈体积比为1：1的混合液；

所述SPE板为Cleanert 2mg PEP((Agela&Phenomenex)微孔板。

本发明检测方法中，所述液相色谱串联质谱检测的液相条件如下：

色谱柱为C18色谱柱；

柱温为40℃；

进样体积为25uL；

进样器温度为2～8℃；

流速为0.3ml/min。

本发明检测方法中，在检测之前，所述检测方法还包括如下步骤：

采用甲醇冲洗色谱柱以进行活化。

本发明检测方法中，在所述淋洗之前，依次采用甲醇和水活化和平衡所述SPE板。

本发明利用液相色谱的高分离性能，以及质谱的高选择性和高灵敏度，能够精准地检测血清中PGA2的水平，为临床肿瘤和感染的诊断提供指导和帮助。

附图说明

图1为PGA2的校准曲线。

图2为PGA2的线性最低点的物质峰。

图3为内标PGA2-D4的色谱峰。

图4-图7分别为校准曲线最高点C12待测物PGA2的色谱图、校准曲线最高点C12内标色谱图、携带污染空白管待测物的色谱图、携带污染空白管内标色谱图。

图8-图9为采用不同微孔板处理后的色谱图。

图10-图11为不同分离时间时的色谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一、流动相的配制

1、流动相A的配制(以配制1L流动相A为例)

在1000mL超纯水中加入0.5mL甲酸(减量配制时按比例缩小各组分添加量)，采用超声震荡10分钟排出气体后即可使用，在20～25℃保存，有效期为一周。

2、流动相B的配制(以配制1L流动相B为例)

在1000mL乙腈中加入0.5mL甲酸(减量配制时按比例缩小各组分添加量)，采用超声震荡10分钟排出气体后即可使用，在20～25℃保存，有效期为一个月。

3、新色谱柱活化方法：甲醇以0.2ml/min冲洗8小时以上即达到活化效果，可以使用，将启用日期作为色谱柱编号标记在色谱柱上。色谱柱参数：C18，2.6um，2.1×100mm。

二、检测样本处理

1、预处理

SPE板的活化与平衡：取96孔SPE板加入200μL甲醇活化，静置流干；加入200μL水平衡，静置流干。SPE板型号：Cleanert 2mg PEP微孔板。

2、样本前处理

1)取2mL 96孔板，依次加入200μL标曲/质控/待测样本、200μL含PGA2-D4的沉淀剂(甲醇：0.1M硫酸锌＝7:3)，400μL水，涡旋混匀，4000rpm离心10min；

2)取650μL上述离心后上清转移到预处理后的SPE板中，静置2min，正压仪控制流速(2～3秒/滴)压干；

3)加入200μL水淋洗，静置5min，正压仪控制流速(2～3秒/滴)逐步压干；

4)加入200μL正己烷淋洗，静置5min，正压仪控制流速(2～3秒/滴)逐步压干，完全压干并保持2min；

5)加入200μL洗脱液(甲醇：乙腈＝1:1)洗脱，收集洗脱液至1.2mL 96孔板中，静置5min，正压仪压干；

6)将收集的洗脱液用氮气(如氮吹仪有加热功能，温度设为40℃)吹干，残渣中加入100μL复溶液(100mM氨水30％乙腈水)复溶，4000rpm离心5min后，取上清转移至350μL 96孔板后待测。

在表1和表2所示条件下进行液相色谱串联质谱检测，得到的色谱图如图8-图9所示，其中，图8是采用Oasis HLB(Waters)微孔板处理后的色谱图，图9图是采用Cleanert2mg PEP(Agela&Phenomenex)微孔板处理后的色谱图，对比两个图可以看出，采用OasisHLB微孔板时的基线较高，会导致定量不准确，而采用Cleanert2mg PEP微孔板时的基线较低，更加符合检测需求。

Cleanert PEP是吡咯烷酮化聚苯乙烯/二乙烯基苯固相萃取柱，极性极强；WatersOasis HLB吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，其保留机理为反相，通过一个“特殊的极性捕获基团”来增加对极性物质的保留提供很好的水浸润性。在大部分情况下，两者的萃取效果相当，但是在本发明中发现Qasis HLB基线较高，而Cleanert PEP基线较低，更适宜PGA2的检测。

三、色谱条件

色谱条件如表1所示。

表1色谱条件

流动相及梯度是反复摸索之后确定的，请见图10和图11，初始的液相时间设置为7min/样本，发现有些样本中特征峰附近会存在干扰峰，而且位置接近，影响定量，后来便把液相时间设置为10min/样本。

表2原7min流动相梯度(分离效果不好)

四、质谱条件

色谱条件如表3所示。

表3质谱条件

离子对参数(可适当做优化调整)如表4所示：

表4离子对参数

*离子对-1为定量离子对，-2为定性离子对

五、仪器分析

1、实验前检查仪器状态是否良好，然后打开计算机电源，进入Windows操作系统后登录Analyst软件，进入工作站主界面。

2、双击Hardware configuration，单击选LC-MS后再单击右侧Activate profile激活液相色谱质谱联用仪，LC-MS模块联机后会变显示为绿色对号，表示联机正常。

3、点击菜单栏Equilibrate，选中要运行的液质联用方法，设置5～10min的平衡时间。

4、双击Acquire，在序列编辑菜栏中，新建或另存为方式，编好相应的样品序列表(样品编号，样品盘位置，仪器采集方法等内容)，然后选中要分析的样品序列并点击Submit按钮提交。

5、待平衡时间结束后，主界面右下角的仪器状态转变为Ready，点击菜单栏的Start sample，开始进行样品分析和数据采集。

6、样品分析采集完毕后在Quantitate模块或者使用Multiquant建立定量列表，进行定量分析。

六、待机

1、双击Acquire，在菜单栏中点击Standby按钮，缓慢降低流速至零，待系统压力降为0后，双击Hardware configuration，单击选LC-MS后再单击右侧Deactivate profile去激活液相色谱质谱联用仪，断开联机。

2、退出Analyst软件，关闭计算机。

七、方法的性能验证结果

1、线性

将已知浓度的标准品做一系列倍比稀释(50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.7813、0.3906、0.1953、0.0977、0.0488、0.0244ng/mL)加入等量的内标品，采用最小二乘法对校准点进行拟合形成校准曲线，其线性要求r>0.99，各浓度点的值与理论值的偏差小于15％，将检测值与理论值偏差小于20％的最低值作为定量限Limit of Quantification(LOQ)，试验得到线性范围为0.024～50ng/mL，如图1、图2所示，标准曲线r＝0.99916，线性良好，LOQ＝0.024ng/mL，足以表明本发明检测方法灵敏度高，能满足临床检测和科学研究的需要。

2、精密度和携带污染

将制备好的高、中、低质控每天检测3次，连续3天，计算得到日内精密度变异系数分别为2.01％、0.57％、0.08％，日间精密度分别为5.65％、6.53％、5.38％，均小于10％，证明精密度良好(表5)。在校准曲线最高点后紧接着测定空白样本，未见明显信号响应，见图4-图7，证明本发明检测方法无携带污染。

表5PGA2的检测精密度

3、准确度和基质效应

(1)提取回收率

制备基质加入内标和低、中、高值标准品后进行前处理流程，然后上机进样检测，得到样本峰面积A；基质进行前处理后加入内标和低、中、高值标准品，上机进样检测，得到样本峰面积B，按照前处理标准操作流程操作，分别配置高低两个浓度的样本，每个浓度平行制备3份，得到表5中的数据，提取回收率分别为95.85％、92.97％和97.00％，满足临床检验需要。

Extraction Recovery(％)＝A/B×100％

(2)加标回收率：取6份不同来源基质，在其中3份中分别入已知浓度的低、中、高值标准品，进行相同的前处理和进样分析流程，平行测定三次，利用公式加标回收率％＝(实测加标后的样本浓度-实测基质样本浓度)/理论加标浓度×100％计算，得到表6数据，加标回收率为98.07％～103.60％，说明本发明检测方法的准确度良好。

表6PGA2的回收率和基质效应

(3)基质效应

取3份不同来源的血清样本，分别配制成以下三种溶液：A：血清样本+内标和标准品；B：血清样本+内标；C：纯溶液标准品，上机检测，通过计算公式基质效应＝(A-B)/C×100％得到基质效应为85％、89.9％、95.43％，见表6，在80％～120％范围内，满足实验要求。