一种利用高效液相色谱法检测2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯中有关物质含量的方法

技术领域

本发明属于医药分析技术领域，具体涉及一种利用高效液相色谱法检测2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯中有关物质含量的方法。

背景技术

2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯，英文名为Methyl 2,2-dithienylglycolate，分子式：C

2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯是噻格溴铵、阿地溴铵、噻托溴铵等化学原料药的的主要原料之一，在目前国家药品监管力度形势下，药品质量的源头控制需引起更广泛的关注。目前2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯的合成工艺如下：

该合成工艺制备2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯以草酸二甲酯为原料，在无水四氢呋喃中，金属镁催化下，与2-溴噻吩发生格式反应生成，并通过盐酸淬灭、后处理等步骤得到。工艺中可能涉及的工艺杂质及样品贮存过程中可能产生的杂质有杂质J(2-羟基-2,2-二(噻吩-2-基)乙酸)、杂质P(2-溴噻吩)、杂质Q(噻吩)、杂质R(2-羟基-2-(噻吩-2-基)-2-(噻吩-3-基)乙酸甲酯)、杂质S(草酸二甲酯)，可知，合成2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯的过程中会产生较多的杂质，而目前尚未有对2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯中的有关物质的分析检测方法。

因此，提供一种检测2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯中有关物质含量的方法，用于检测合成2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯的各杂质，提高以2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯为原料生产的原料药的安全性和质量可控性迫在眉睫。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用高效液相色谱法检测2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯中有关物质含量的方法，用于检测合成2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯的各杂质，提高以2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯为原料生产的原料药的安全性和质量可控性。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种利用高效液相色谱法检测2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯中有关物质含量的方法，具体步骤如下：

1)配制供试品溶液和对照品溶液；

2)设置高效液相检测条件；采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈-水-磷酸的混合溶液为流动相；

3)分别取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录并分析色谱图，计算有关物质的含量。

进一步的，步骤1)中，供试品溶液的制备方法为：精密称取2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯样品，用乙腈定量稀释成每1mL中含1mg的2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯的溶液；对照品溶液的制备方法为：精密量取供试品溶液，用乙腈定量稀释成每1mL中含1μg的2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯的溶液。

进一步的，步骤2)中，色谱柱为Waters XTERRA RP18，250×4.6mm，5μm。

进一步的，步骤2)中，乙腈、水和磷酸的体积比为30:70:0.1。

进一步的，步骤2)中，色谱柱的柱温为30℃。

进一步的，步骤3)中，供试品溶液和对照品溶液的进样体积均为10μL。

进一步的，步骤3)中，液相色谱仪的检测波长为235nm。

进一步的，步骤3)中，液相色谱仪检测时流动相的流速为1.0mL/min。

进一步的，步骤3)中，有关物质含量的计算公式为：单个杂质含量＝Ru/(Rs×L)×F×100；其中，Ru为供试品溶液中杂质的峰面积，Rs为对照溶液中主峰的峰面积，L为对照溶液稀释倍数，F为杂质的校正因子。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

(1)本发明利用高效液相色谱法检测2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯中的各杂质，在系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序依次为杂质J、杂质Q、杂质R、2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯和杂质P，杂质R与2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯之间的分离度大于1.5，其他各成分之间的分离度均大于1.5，理论板数按2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯计算不低于5000。

(2)本发明的在检测过程中，空白溶剂不影响样品有关物质的检测，在供试品溶液中，检出的杂质峰理论板数均较高，具有较好的分离度，本发明的专属性较好。

(3)本发明检测分析的各杂质在一定浓度范围内，线性相关系数均大于0.990，浓度与峰面积之间线性关系良好。

(4)利用本发明的检测方法进行重复性试验，结果表明，每组供试品溶液杂质个数一致，各已知杂质和总杂含量无明显差异，本发明的检测方法重复性良好。

附图说明

图1为本发明供试品溶液色谱图；

图2为本发明对照品溶液色谱图；

图3为本发明系统适用性溶液色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

以下实施例所采用的高效液相检测条件如下：

色谱柱：Waters XTERRA RP18，250×4.6mm，5μm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

流速：1mL/min；

柱温：30℃；

流动相：乙腈-水-磷酸；体积比为30:70:0.1；

检测波长：235nm；

进样量：供试品溶液和对照品溶液进样量均为10μL。

实施例1

一种利用高效液相色谱法检测2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯中有关物质含量的方法

1)配制供试品溶液和对照品溶液；精密称取2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯样品，用乙腈定量稀释成每1mL中含1mg的2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液，用乙腈定量稀释成每1mL中含1μg的2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯的溶液，作为对照品溶液。

2)设置高效液相检测条件；色谱柱为Waters XTERRA RP18，250×4.6mm，5μm，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱的柱温为30℃，以乙腈-水-磷酸(体积比为30:70:0.1)的混合溶液为流动相；流速为1mL/min；液相色谱仪的检测波长为235nm。

3)分别精密量取供试品溶液和对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，记录并分析色谱图，计算有关物质的含量。结果如图1和图2所示。有关物质含量的计算公式为：

单个杂质含量＝Ru/(Rs×L)×F×100

其中，Ru为供试品溶液中杂质的峰面积；

Rs为对照溶液中主峰的峰面积；

L为对照溶液稀释倍数；

F为杂质的校正因子。

图1为本发明供试品溶液色谱图；由图可知，供试品溶液中，2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯及各工艺杂质、降解杂质峰与相邻杂质峰之间均能达到基线分离，且峰型良好。

图2为本发明对照品溶液色谱图；由图可知，本发明能有效地检测出2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯中的有关物质含量，为药品质量的控制提供了有力的依据。

实施例2

对实施例1检测方法进行方法验证，分别从系统适用性、专属性试验、破坏性试验、溶液稳定性、定量限和检测限、线性与范围、进样精密度、重复性、中间精密度、准确度试验和耐用性试验等几个方面进行验证。

1、系统适用性测定：

系统适用性溶液的配制：取2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯以及杂质J、杂质P、杂质Q、杂质R对照品各适量，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中约含2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯1mg、杂质R 3μg、杂质J、杂质P和杂质Q各1μg的混合溶液。结果如图3所示。

系统适用性的要求：系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序依次为杂质J、杂质Q、杂质R、2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯和杂质P，杂质R峰与2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯峰之间的分离度应大于1.5，理论板数按2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯峰计算不低于5000。

图3为本发明系统适用性溶液色谱图。由图可知，系统适用性溶液色谱图中，出峰顺序依次为杂质J、杂质Q、杂质R、2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯和杂质P，杂质R峰与2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯峰之间的分离度大于1.5，其他各成分之间的分离度均大于1.5，理论板数按2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯峰计算不低于5000。该色谱条件适用。

2、专属性试验

系统适用性溶液：取2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯以及杂质J、杂质P、杂质Q、杂质R对照品各适量，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中约含2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯1mg、杂质R 3μg、杂质J、杂质P和杂质Q各1μg的混合溶液。

2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯定位溶液：取2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中约含1mg的溶液。

杂质J定位溶液：精密称定杂质J对照品，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中约含1μg的溶液。

杂质P定位溶液：精密称定杂质P对照品，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中约含1μg的溶液。

杂质Q定位溶液：精密称定杂质Q对照品，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中约含1μg的溶液。

杂质R定位溶液：精密称定杂质R对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中约含3μg的溶液。

供试品溶液：精密称定本品，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中约含1mg的溶液，即得。

对照溶液：精密量取供试品溶液适量，用乙腈稀释制成每1mL中约含1μg的溶液。

分别精密量取上述溶剂(乙腈)、定位溶液、系统适用性溶液、供试品溶液和对照溶液各10μL，按上述色谱条件进行试验，结果如下表1所示。

表1杂质定位与分离试验结果

表1为杂质定位与分离结果，由表1可知，采用本发明专利方法进行样品检测分析，各成分按出峰顺序依次为杂质J、杂质Q、杂质R、2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯和杂质P；系统适用性溶液中，杂质R与主峰之间的分离度大于1.5，其他各成分之间的分离度均大于1.5，符合要求；空白溶剂不影响样品有关物质检测；在供试品溶液中，检出的杂质峰理论板数均较高，并具有较好的分离度，说明本法的专属性较好。

3、破坏性试验

未破坏：取本品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。

酸破坏：取本品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入1mL盐酸溶液(1mol/L)，摇匀，于80℃水浴加热1h后，放冷至室温，用1mol/L的氢氧化钠溶液1mL中和后，加乙腈稀释至刻度，摇匀。

酸破坏空白：不加样，其余操作同酸破坏。

碱破坏：取本品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入0.1mL氢氧化钠(0.1mol/L)摇匀，于室温放置10min，用0.1mol/L盐酸溶液0.1mL中和后，加乙腈稀释至刻度，摇匀。

碱破坏空白：不加样，其余操作同碱破坏。

氧化破坏：取本品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入30％的过氧化氢1mL，于80℃水浴加热1h后，放冷至室温，加乙腈稀释至刻度，摇匀。

氧化破坏空白：不加样，其余操作同氧化破坏。

高温破坏：取在80℃恒温烘箱下放置24h的本品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。

光照破坏：取本品约10mg，精密称定，置10mL透明量瓶中，加适量乙腈溶解，在强光(4500±500lx)照度下放置8天后取出，用乙腈稀释至刻度，摇匀。

高湿破坏：取本品约10mg，精密称定，置10mL透明量瓶中，置92.5％RH下放置8天，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。

分别取上述各破坏的供试品溶液及空白溶剂，照上述色谱条件操作。同时采用PDA检测器，进行峰纯度检查：降解试验图谱中，当光谱匹配值大于990时，即判断色谱峰峰纯良好。结果见表2。

表2破坏性试验考察结果

表2为破坏性试验考察结果，由表可知，本品在极为剧烈的降解条件下，经有关物质分析方法检测，发生不同程度的降解；在高温、高湿、光照条件下较稳定，在氧化破坏条件下略有降解，主要降解为RRT1.25的未知杂质，在酸性和碱性条件下降解明显，生成降解产物杂质J；本品在不同破坏条件下，未产生干扰本品有关物质检测的降解杂质，主峰及各已知杂质峰与相邻杂质峰之间分离度均良好，物料守恒率在90％～110％之间，符合物料守恒要求，主峰峰纯较高(光谱匹配值大于990)。说明本方法对杂质的检出能力较好，专属性较好。

4、溶液稳定性试验

系统适用性溶液：取起始物料1对照品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加适量乙腈溶解，加入杂质J、杂质P、杂质Q母液各20μL、杂质R母液60μL，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：取本品适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中约含1.0mg的溶液。

对照溶液：精密量取供试品溶液100μL，置100mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀。

取上述系统适用性溶液、供试品溶液及对照溶液，按照上述色谱条件，分别于不同时间点进样检测，记录色谱图。结果见表3、表4。

表3系统适用性溶液稳定性结果

表3为系统适用性溶液稳定性结果，由表可知，4℃控温条件下，11天时间内，系统适用性溶液中各杂质峰的峰面积RSD值均小于10％，溶液稳定性良好。

表4供试品溶液稳定性结果

表4为供试品溶液稳定性结果，由表可知，4℃控温条件下，57小时内，供试品溶液中杂质个数一致，杂质含量无明显差异，无新增报告限以上的杂质峰，溶液稳定性良好。

5、定量限和检测限试验

精密称取杂质J、杂质Q、杂质R、杂质P和起始物料1对照品各适量，分别加乙腈溶解并稀释制成一定浓度的供试品溶液，并逐步稀释至信噪比(S/N)为10时，即为定量限；信噪比(S/N)为3时，即为检测限。结果见表5。

表5检测限和定量限

表5为检测限和定量限，由表可知，2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯、杂质J、杂质Q、杂质R、杂质P的检测限浓度分别为0.09990μg/mL、0.09566μg/mL、0.1067μg/mL、0.09849μg/mL和0.2534μg/mL，均低于供试品浓度(1mg/mL)的0.03％；定量限浓度分别为0.1998μg/mL、0.1913μg/mL、0.2134μg/mL、0.1970μg/mL和0.5068μg/mL，均低于供试品浓度(1mg/mL)的0.05％，说明本法选择的供试品浓度1mg/mL合适，方法灵敏度较高，6份定量限溶液中各成分峰面积RSD值均小于10％，符合验证要求。

6、线性与范围试验

线性系列溶液的配制：取2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯与杂质J、杂质P、杂质Q、杂质R对照品各适量，精密称定，分别加乙腈溶解并定量稀释制成定量限及杂质限度浓度的50％、80％、100％、150％、200％的系列溶液，具体溶液浓度范围见表6。

取线性系列溶液，注入液相色谱仪，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，做线性回归，结果如下表6所示。

表6线性与校正因子试验结果

表6为线性与范围试验结果，由表可知，采用本发明检测方法进行样品检测分析，2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯与杂质J、杂质P、杂质Q、杂质R在一定浓度范围内，线性相关系数均大于0.990，浓度与峰面积之间线性关系良好。

7、进样精密度试验

系统适用性溶液：取起始物料1对照品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加适量乙腈溶解，加入杂质J、杂质P、杂质Q母液各20μL、杂质R母液60μL，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

取上述系统适用性溶液连续进样6次，记录色谱图。结果见表7。

表7进样精密度结果

表7为进样精密度结果，由表可知，系统适用性溶液连续进样6次，杂质J、杂质Q、杂质R、2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯和杂质P峰面积的RSD值分别为0.07％、0.06％、0.06％、0.08％、0.12％，均小于2.0％；说明系统精密度良好。

8、重复性试验

供试品溶液：取本品适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中约含1mg的溶液。

对照溶液：精密量取供试品溶液适量，用乙腈稀释制成每1mL中约含1μg的溶液。

平行配制6份供试品溶液和对照溶液，按上述色谱条件进行试验，结果见表8。

表8重复性试验结果

表8为重复性试验结果，由表可知，采用本发明检测方法进行样品检测分析，6份供试品溶液杂质个数一致，各已知杂质和总杂含量无明显差异，说明本检测方法重复性良好。

9、中间精密度试验

供试品溶液：取本品适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中约含1mg的溶液。

对照溶液：精密量取供试品溶液适量，用乙腈稀释制成每1mL中约含1μg的溶液。

由不同试验人员于不同试验时间，分别在不同仪器上，照待验证的有关物质测定方法检测供试品溶液中杂质含量，并结合“8.重复性”试验结果，计算RSD值，应符合规定。结果见表9。

表9中间精密度测定结果

表9为中间精密度测定结果，由表可知，不同的人员在不同的时间采用不同HPLC仪器检测的12份供试品溶液中各已知杂质、最大未知单杂及总杂含量均无明显差异，说明中间精密度良好，符合验证要求。

10、准确度试验(加样回收率)

杂质J、Q混合对照品储备液：取杂质J、杂质Q对照品各适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中约含杂质J、杂质Q各20μg的混合溶液。

杂质P对照品储备液：取杂质P对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中约含杂质P 20μg的溶液。

杂质R对照品储备液：取杂质R对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中约含杂质R各60μg的溶液。

供试品溶液：取本品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。

回收率溶液1：取本品约20mg，精密称定，置20mL量瓶中，分别加入杂质J、Q混合对照品储备液0.2mL，杂质P对照品储备液0.5mL，杂质R对照品储备液0.2mL，用乙腈稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。

回收率溶液2：取本品约20mg，精密称定，置20mL量瓶中，分别加入杂质J、Q混合对照品储备液0.8mL，杂质P对照品储备液0.8mL，杂质R对照储备液0.5mL，用乙腈稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。

回收率溶液3：取本品约20mg，精密称定，置20mL量瓶中，分别加入杂质J、Q混合对照品储备液1.0mL，杂质P对照品储备液1.0mL，杂质R对照品储备液1.0mL，用乙腈稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。

回收率溶液4：取本品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，分别加入杂质J、Q混合对照储备液0.6mL，杂质P对照储备液0.6mL，用乙腈稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。

对照溶液：精密量取上述供试品溶液及回收率溶液各100μL，置不同100mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

取系统适用性溶液、杂质混合对照品溶液、回收率溶液、供试品溶液及对照溶液，照上述色谱条件进行测定，记录色谱图。分别按外标法及自身对照法计算各已知杂质的含量和回收率。结果见表10～13。

表10杂质J准确度试验结果

表10为杂质J准确度试验结果，由表可知，杂质J在限度浓度20％～120％范围内，按自身对照法计算回收率均在80％～120％之间，RSD值均小于5％，符合试验要求，表明本品有关物质检测方法准确度较好，自身对照法适用于本品杂质J的含量计算。

表11杂质Q准确度试验结果

表11为杂质Q准确度试验结果，由表可知，杂质Q在限度浓度20％～120％范围内，按自身对照法计算回收率均在80％～120％之间，RSD值均小于5％，符合试验要求，表明本品有关物质检测方法准确度较好，自身对照法适用于本品杂质Q的含量计算。

表12杂质R准确度试验结果

表12为杂质R准确度试验结果，由表可知，杂质R在限度浓度70％～120％范围内，按自身对照法计算回收率均在80％～120％之间，RSD值均小于5％，符合试验要求，表明本品有关物质检测方法准确度较好，自身对照法适用于本品杂质R的含量计算。

表13杂质P准确度试验结果

表13为杂质P准确度试验结果，由表可知，杂质P在限度浓度50％～120％范围内，按自身对照法计算回收率均在80％～120％之间，RSD值均小于5％，符合试验要求，表明本品有关物质检测方法准确度较好，自身对照法适用于本品杂质P的含量计算。

11、耐用性试验

分别考察色谱条件的柱温、流速、检测波长、流动相中有机相比例、相同型号不同批次的色谱柱等对本法色谱行为的影响，并根据考察结果在标准中对色谱条件的耐用范围进行了规定。耐用性考察条件见下表14。

表14耐用性条件

系统适用性溶液：取起始物料1与杂质J、杂质P、杂质Q、杂质R对照品各适量，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中约含起始物料1 1mg、杂质R 3μg、杂质J、杂质P和杂质Q各1μg的混合溶液。

供试品溶液：取本品适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中约含1mg的溶液。

对照溶液：精密量取供试品溶液适量，用乙腈溶解并稀释配制成每1mL中约含1μg的溶液。

取空白溶剂、系统适用性溶液、供试品溶液及对照溶液于上述考察的测试条件下进行检测。结果见表15～16。

表15系统适用性溶液耐用性考察结果—相对主峰保留时间

表16系统适用性溶液耐用性考察结果—分离度

表17系统适用性溶液耐用性考察结果—理论板数

表18供试品溶液耐用性试验结果

表15～18为耐用性试验结果，由表可知，对本方法中色谱条件中的检测波长、流速、柱温、色谱柱等参数作微小调整，样品有关物质的检测结果无显著差异。微调色谱条件中的检测波长、流速、柱温等参数或更换不同批次的色谱柱时，系统适用性无明显影响，但当流动相中有机相比例上调2％时，杂质R与主峰之间的分离度明显下降；流动相中有机相比例上调1％时，系统适用性结果较为理想，方法耐用性较好。根据不同耐用性条件下的考察结果，本品有关物质检测方法具有一定的耐用性，后续方法重现及样品检测中需注意流动相中有机相与水相间混合比例的准确性。