瑞卢戈利有关物质的超高效液相色谱测定方法

技术领域

本发明属于药物的测定技术领域，具体涉及瑞卢戈利有关物质的超高效液相色谱测定方法。

背景技术

瑞卢戈利(Relugolix)是一种促性腺激素(GnRH)受体拮抗剂，用于子宫肌瘤引起的出血和疼痛。除用于治疗子宫肌瘤外，该药正在开展子宫内膜异位症引起的疼痛以及前列腺癌等的研究。瑞卢戈利的化学名称为1-(4-{1-[(2,6-二氟苯基)]-5-[(二甲基氨基)甲基]-3-(6-甲氧基哒嗪-3-基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢噻吩并[2,3-d]嘧啶-6-基]苯基}-3-甲氧基脲，分子量为623.63，具体结构式如下所示：

目前对于瑞卢戈利关键中间体及相关杂质的检测方法比较有限。如专利CN116223685A中公开了一种瑞卢戈利关键中间体及相关杂质的检测方法，采用高效液相色谱法，其中色谱柱采用YMC-Pack Pro C18，150mm×4.6mm，3μm；流速：0.8mL/min，柱温：30℃，检测波长：254nm，进样体积：10μ1，流动相A为20mmol/L磷酸二氢饵缓冲液(pH值7.0)-乙腊(70:30)，流动相B为乙睛进行梯度洗脱。该检测方法主要研究了瑞卢戈利关键中间体：2-((2,6-二氟苄基)(乙氧羰基)氨基)-4-((二甲基氨基)甲基)-5-(4-硝基苯基)噻吩-3-羧酸乙酯，及相关杂质A：2-((2,6-二氟苄基)(乙氧羰基)氨基)-4-甲基-5-(4-硝基苯基)噻吩-3-羧酸乙酯，杂质B：4-(溴甲基)-2-((2,6-二氟苄基)(乙氧羰基)氨基)-5-(4-硝基苯基)噻吩-3-羧酸乙酯，杂质N：2-((2,6-二氟苄基)(乙氧羰基)氨基)-4-((二甲氨基)甲基)-5-(4-硝基苯基)噻吩-3-羧酸，杂质M：2-((2,6-二氟苄基)(乙氧羰基)氨基)-4-((二甲基氨基)甲基)-5-(4-硝基苯基)噻吩-3-羧酸，杂质G：2-((2,6-二氟苄基)氨基)-4-((二甲基氨基)甲基)-5-(4-硝基苯基)噻吩-3-羧酸，杂质D：4-(氨基甲基)-2-(((2,6-二氟苄基)(乙氧基羰基)氨基)-5-(4-硝基苯基)噻吩-3-羧酸乙酯，虽然检测了中间体以及六种杂质，但是并未对成品中的相关工艺产生的杂质和降解产生的杂质进行研究，且此方法检测时间较长。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供瑞卢戈利有关物质的超高效液相色谱测定方法，对瑞卢戈利生产中产生的12种杂质进行有效分离检测，从而有效的控制了产品质量，并且缩短了分析时间，减少了溶剂用量，降低了分析成本。

本发明所述的瑞卢戈利有关物质的超高效液相色谱测定方法，测定中采用的超高效液相色谱条件包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以高氯酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱。

所述的瑞卢戈利有关物质的超高效液相色谱测定方法，测定中还包括以下步骤：

(1)配制杂质对照品定位溶液：

分别各取杂质TJJ、NHCD、XHQ、JYN、NOCD、YYJ、XQY、CTT、CNO、NOAC、EJW、NOND，分别加乙腈溶解并用高氯酸水溶液-乙腈稀释制成浓度为5μg/mL的各个杂质对照品定位溶液；

(2)配制混合溶液：

精密称取各杂质TJJ、NHCD、XHQ、JYN、NOCD、YYJ、XQY、CTT、CNO、NOAC、EJW、NOND，分别加入乙腈溶解并稀释，摇匀，分别作为杂质TJJ、NHCD、XHQ、JYN、NOCD、YYJ、XQY、CTT、CNO、NOAC、EJW、NOND各自的贮备溶液；

精密称取瑞卢戈利，加高氯酸水溶液-乙腈溶解，并精密加入上述各杂质的贮备溶液混合，用高氯酸水溶液-乙腈稀释，摇匀，作为混合溶液；

(3)配制供试品溶液：

精密称取瑞卢戈利，加高氯酸水溶液-乙腈溶解并稀释，摇匀，作为供试品溶液；

(4)检测：将配制的各个杂质对照品定位溶液、混合溶液、供试品溶液注入超高效液相色谱仪检测，记录色谱图，由定位溶液及混合溶液中各杂质的保留时间定性，以加校正因子的主成分对照法计算各杂质的含量。

采用的超高效液相色谱条件还包括：进样量：1μL～2μL；检测器为紫外检测器，检测波长：220nm～240nm；柱温：30～40℃，进一步优选为35℃；流速，0.25～0.35mL/min，进一步优选为0.3mL/min。

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Shield RP18，2.1×100mm，1.7μm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

流动相A与流动相B的体积比为(80～25)∶(20～75)。

流动相A的高氯酸溶液中高氯酸的含量为0.08％～0.12％，进一步优选为0.1％高氯酸水溶液。

梯度洗脱的洗脱条件，如表1所示。

表1洗脱条件

优选的洗脱条件，如表2所示。

表2优选洗脱条件

配制的各个杂质对照品定位溶液中各个杂质的浓度为3μg/mL～7μg/mL。

高氯酸水溶液-乙腈中高氯酸水溶液的高氯酸质量浓度为0.08％～0.12％，其中的高氯酸水溶液与乙腈的体积比为(80～25):(20～75)。

混合溶液中瑞卢戈利的浓度为0.3mg/mL～0.6mg/mL，各个杂质的浓度为0.1μg/mL～0.5μg/mL；供试品溶液中瑞卢戈利的浓度为0.3mg/mL～0.6mg/mL。

本发明的杂质信息，如表3所示。

表3杂质信息

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

(1)本发明的瑞卢戈利有关物质的超高效液相色谱测定方法，可以很好的将成品中的工艺杂质和降解杂质如杂质TJJ、NHCD、杂质XHQ、杂质JYN、NOCD、杂质YYJ、杂质XQY、杂质CTT、杂质CNO、NOAC、杂质EJW、NOND的12个杂质进行有效分离，从而能有效的控制产品质量；并且缩短了分析时间，减少了溶剂用量，降低了分析成本。

(2)本发明的瑞卢戈利有关物质的超高效液相色谱测定方法，能够快速有效的检测瑞卢戈利有关物质，且各杂质间分离度较佳，专属性良好，线性关系良好，重复性好，精密度高，耐用性好，结果更准确真实。

附图说明

图1为本发明方法的专属性试验中的空白溶液、供试品溶液、混合溶液，以及其他12种杂质的定位溶液的超高效液相色谱图的叠加谱图；

图2为本发明方法的专属性试验中的混合溶液的超高效液相色谱图；

图3为本发明方法的检测限、定量限试验中的定量限溶液的超高效液相色谱图的叠加谱图；

图4为本发明方法的线性与范围试验中的瑞卢戈利线性标准曲线图；

图5为本发明方法的线性与范围试验中的杂质TJJ线性标准曲线图；

图6为本发明方法的线性与范围试验中的杂质NHCD线性标准曲线图；

图7为本发明方法的线性与范围试验中的杂质XHQ线性标准曲线图；

图8为本发明方法的线性与范围试验中的杂质JYN线性标准曲线图；

图9为本发明方法的线性与范围试验中的杂质NOCD线性标准曲线图；

图10为本发明方法的线性与范围试验中的杂质YYJ线性标准曲线图；

图11为本发明方法的线性与范围试验中的杂质XQY线性标准曲线图；

图12为本发明方法的线性与范围试验中的杂质CTT线性标准曲线图；

图13为本发明方法的线性与范围试验中的杂质CNO线性标准曲线图；

图14为本发明方法的线性与范围试验中的杂质NOAC线性标准曲线图；

图15为本发明方法的线性与范围试验中的杂质EJW线性标准曲线图；

图16为本发明方法的线性与范围试验中的杂质NOND线性标准曲线图；

图17为本发明方法的重复性试验中的平行6份重复性溶液的超高效液相色谱图；

图18为本发明方法的耐用性试验中的不同柱温的混合溶液的超高效液相色谱图；

图19为本发明方法的耐用性试验中的不同流速的混合溶液的超高效液相色谱图。

图20为本发明方法的耐用性试验中的微调流动相A中高氯酸含量的混合溶液的超高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

所述的瑞卢戈利有关物质的超高效液相色谱测定方法，测定中还包括以下步骤：

(1)配制杂质对照品定位溶液：

杂质TJJ定位溶液：取杂质TJJ，加乙腈超声振摇溶解并用0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)稀释制成浓度5μg/mL的溶液；

NHCD定位溶液：取NHCD，加乙腈超声振摇溶解并用0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)稀释制成浓度5μg/mL的溶液；

杂质XHQ定位溶液：取杂质XHQ，加乙腈超声振摇溶解并用0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)稀释制成浓度5μg/mL的溶液；

杂质JYN定位溶液：取杂质JYN，加乙腈超声振摇溶解并用0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)稀释制成浓度5μg/mL的溶液；

NOCD定位溶液：取NOCD，加乙腈超声振摇溶解并用0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)稀释制成浓度5μg/mL的溶液；

杂质YYJ定位溶液：取杂质YYJ，加乙腈超声振摇溶解并用0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)稀释制成浓度5μg/mL的溶液；

杂质XQY定位溶液：取杂质XQY，加乙腈超声振摇溶解并用0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)稀释制成浓度5μg/mL的溶液；

杂质CTT定位溶液：取杂质CTT，加乙腈超声振摇溶解并用0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)稀释制成浓度5μg/mL的溶液；

杂质CNO定位溶液：取杂质CNO，加乙腈超声振摇溶解并用0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)稀释制成浓度5μg/mL的溶液；

NOAC定位溶液：取NOAC，加乙腈超声振摇溶解并用0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)稀释制成浓度5μg/mL的溶液；

杂质EJW定位溶液：取杂质EJW，加乙腈超声振摇溶解并用0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)稀释制成浓度5μg/mL的溶液；

NOND定位溶液：取NOND，加乙腈超声振摇溶解并用0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)稀释制成浓度5μg/mL的溶液；

(2)配制混合溶液：

取杂质TJJ、NHCD、杂质XHQ、杂质JYN、NOCD、杂质YYJ、杂质XQY、杂质CTT、杂质CNO、NOAC、杂质EJW、NOND各1.5mg，精密称定，分置10mL量瓶中，加入乙腈超声振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，分别作为杂质TJJ、NHCD、杂质XHQ、杂质JYN、NOCD、杂质YYJ、杂质XQY、杂质CTT、杂质CNO、NOAC、杂质EJW、NOND贮备溶液；

取瑞卢戈利25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)适量超声使溶解，并精密加入上述杂质贮备溶液各100μl，用0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)稀释至刻度，摇匀；

(3)配制供试品溶液：

取瑞卢戈利约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)超声使溶解并稀释至刻度，摇匀；

(4)检测：将配制的各个杂质对照品定位溶液、混合溶液、供试品溶液注入超高效液相色谱仪检测，记录色谱图，由定位溶液及混合溶液中各杂质的保留时间定性，以加校正因子的主成分对照法计算各杂质的含量。采用的超高效液相色谱条件包括：进样量(1μL～2μL)；检测器为紫外检测器，检测波长，(220nm～240nm)；柱温，30～40℃；流速，0.25～0.35mL/min；色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Shield RP18，2.1×100mm，1.7μm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％高氯酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱。

实施例使用的瑞卢戈利原料来源于：瑞阳制药股份有限公司，批号2306081803。其他试剂如无特别说明，均为市售常规原料。

本发明所述的瑞卢戈利有关物质的超高效液相色谱测定方法的方法学验证。

以下实验所采用的测定方法包括：

(1)稀释剂：0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)；

空白溶液：0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)；

供试品溶液：取瑞卢戈利约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)超声使溶解并稀释至刻度，摇匀。

对照品溶液：取瑞卢戈利对照品约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置100mL量瓶中，用0.1％高氯酸水溶液-乙腈(75：25)稀释至刻度，摇匀。

定位溶液和混合溶液都按照以上制备方法制定。

(2)样品分析

空白溶液：进样1针；

对照品溶液：进样1针；

供试品溶液：进样1针。

(3)色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Shield RP18，2.1×100mm，1.7μm；

色谱柱温度：35柱；

流动相流速：0.3mL/min；

检测波长：230nm；

进样量：1μl；

流动相：以0.1％高氯酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱，如表2所示。

(4)计算方式：对照品称样量×对照品含量/对照品稀释倍数×杂质的峰面积/对照品的峰面积×供试品的稀释倍数×校正因子×1/100。

(一)专属性试验：

通过进样各杂质定位溶液及含有杂质的混合溶液作为专属性溶液，考察方法的专属性，通过专属性试验确定该潜在杂质在测定条件下相对保留时间、分离度、确定所关注的杂质能被有效分离。专属性试验结果见表4，如图1～图2所示，可以看出混合溶液中主成分与相邻杂质以及各杂质之间均能得到有效分离，专属性良好。

表4有关物质检查专属性试验结果

结论：本色谱条件下，混合溶液中瑞卢戈利与相邻杂质间的最小分离度为2.761(不得小于1.5)，各色谱峰间最小分离度为1.544(要求不得小于1.0)，均符合要求，各已知杂质均能有效分离，专属性良好。

(二)检测限、定量限试验：

取瑞卢戈利及各杂质对照品，采用逐步稀释法，当信噪比S/N≥3时的浓度作为检测限浓度；当信噪S/N≥10时的浓度作为定量限浓度，定量限溶液连续进样6针，保留时间的RSD应≤1.0％，峰面积的RSD应≤10.0％。检测限、定量限试验结果见表5、表6，具体图谱如图3所示。

表5有关物质检查定量限试验结果

表6有关物质检查检测限试验结果

结论：定量限溶液重复进样6次，保留时间的RSD均小于1.0％，峰面积的RSD均小于10.0％，瑞卢戈利及各杂质定量限均小于供试品标示浓度的报告限(0.05％)，s/n均大于10；检测限溶液的s/n均大于3；定量限、检测限良好。

(三)线性与范围试验：

方法的线性通过7个不同浓度溶液的线性来实现，以测得峰面积对浓度作图，呈现良好的线性(线性相关系数≥0.995)，并同时确定测定的范围。

瑞卢戈利线性实验结果见表7、图4，有关杂质见表8-20、图5～图16。

表7有关物质检查瑞卢戈利线性关系试验结果

杂质TJJ线性实验结果见表7、图5。

表8有关物质检查杂质TJJ线性关系试验结果

杂质NHCD线性实验结果见表9、图6。

表9有关物质检查杂质NHCD线性关系试验结果

杂质XHQ线性实验结果见表10、图7。

表10有关物质检查杂质XHQ线性关系试验结果

杂质JYN线性实验结果见表11、图8。

表11有关物质检查杂质JYN线性关系试验结果

NOCD线性实验结果见表12、图9。

表12有关物质检查NOCD线性关系试验结果

杂质YYJ线性实验结果见表13、图10。

表13有关物质检查杂质YYJ线性关系试验结果

杂质XQY线性实验结果见表14、图11。

表14有关物质检查杂质XQY线性关系试验结果

杂质CTT线性实验结果见表15、图12。

表15有关物质检查杂质CTT线性关系试验结果

杂质CNO线性实验结果见表16、图13。

表16有关物质检查杂质CNO线性关系试验结果

NOAC线性实验结果见表17、图14。

表17有关物质检查NOAC线性关系试验结果

杂质EJW线性实验结果见表18、图15。

表18有关物质检查杂质EJW线性关系试验结果

NOND线性实验结果见表19、图16。

表19有关物质检查NOND线性关系试验结果

根据上述线性试验结果，计算测得已知杂质的相对校正因子(f＝k

表20有关物质检查杂质的校正因子试验结果

结论：瑞卢戈利及各杂质的线性与范围的相关系数均大于0.995，线性关系良好。

(四)重复性试验：

平行配制6份供试品溶液，计算供试品溶液中各杂质含量的RSD，考察方法的重复性。重复性试验各杂质结果见表21，重复性试验图谱见图17。

表21有关物质检查重复性试验结果

结论：6份供试品溶液中杂质面积百分比的RSD≤10.0％，主峰纯度的RSD≤2.0％，符合要求，方法的重复性良好。

(五)耐用性试验：

在其他条件不变的情况下，通过微小调节色谱条件，不同条件下有关物质测定结果一致，耐用性良好。不同色谱条件下测得结果见表22，耐用性试验图谱见图18～图20。

表22有关物质检查耐用性试验结果

结论：通过微小改变柱温(标准条件±5℃：)、流速(标准条件±0.05mL/min)、流动相A中高氯酸含量(标准条件±0.02％)条件下，主峰纯度的RSD为0.09％≤2.0％，最大单杂及总杂的面积百分比的RSD分别为7.36％、6.48％均≤10.0％，主峰与相邻杂质峰间最小分离度为2.207＞1.5，各相邻杂质的最小分离度为1.099≥1.0，符合要求，方法的耐用性良好。

从以上验证结果可以得知，本发明的测定方法为超高效液相色谱法，可以很好的将成品中的工艺杂质和降解杂质如杂质TJJ、NHCD、杂质XHQ、杂质JYN、NOCD、杂质YYJ、杂质XQY、杂质CTT、杂质CNO、NOAC、杂质EJW、NOND、12个杂质进行有效分离，从而能有效的控制产品质量；并且缩短了分析时间，减少了溶剂用量，降低了分析成本。而且该方法灵敏度高、专属性强，重复性、耐用性及线性良好、结果稳定可靠，从而可用于瑞卢戈利的质量控制，为最终成品的质量提供有效保障，填补了利用超高效液相色谱仪检测瑞卢戈利有关物质的空白。