马来酸阿伐曲泊帕有关物质的超高效液相色谱测定方法

技术领域

本发明属于药物的测定技术领域，具体涉及马来酸阿伐曲泊帕有关物质的超高效液相色谱测定方法。

背景技术

马来酸阿伐曲泊帕其化学名称为1-(3-氯代-5-{[4-(4-氯噻吩-2-基)-5-(4-环己基哌嗪-1-基)-1,3-噻唑-2-基]氨基甲酰基}吡啶-2-基)哌啶-4-羧酸马来酸盐，分子量为765.73，具体结构式如下所示：

现有的关于马来酸阿伐曲泊帕有关物质的检测，如专利CN115047106A中公开了一种马来酸阿伐曲泊帕中有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法，其中色谱柱采用Agilent RRHD Bonus-RP，3.5μm，4mm×250nm；色谱柱温度50℃，流动相流速1.0mL/min，检测波长254nm，进样量10μL，流动相A为高氯酸-水-甲醇(2:950:50)，流动相B为高氯酸-乙腈-甲醇(2:950:50)进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：(1)在0-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至45:55；(2)在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至0:100；(3)在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持0:100不变。该检测方法主要研究了马来酸阿伐曲泊帕的部分杂质，未研究此色谱条件下能否将马来酸阿伐曲泊帕中极可能存在的中间体3及起始物料传递杂质T、杂质S有效分离，且此方法检验时间较长。

因此，对于中间体3与产物马来酸阿伐曲泊帕只有一步的工艺顺序，杂质T是起始物料降解杂质的传递杂质，杂质S是起始物料中主要杂质的传递杂质，这3个杂质的溶解性、极性与马来酸阿伐曲泊帕相近，清除效果较差，对于产品的质量影响难以控制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种马来酸阿伐曲泊帕有关物质的超高效液相色谱测定方法，不仅将马来酸阿法曲波帕中间体2、杂质F、杂质N、杂质H、马来酸阿法曲波帕中间体4、杂质G的六种杂质有效分离，而且将工艺中的马来酸阿法曲波帕中间体3、杂质T、杂质S也能进行有效分离，控制产品质量，并且缩短了分析时间，减少了溶剂用量，降低了分析成本。

本发明所述的马来酸阿伐曲泊帕有关物质的超高效液相色谱测定方法，测定中采用的超高效液相色谱条件包括：色谱柱以十六烷基酰胺基键合硅胶为填充剂，以水-甲醇-三氟乙酸为流动相A，乙腈-三氟乙酸为流动相B，梯度洗脱。

所述的马来酸阿伐曲泊帕有关物质的超高效液相色谱测定方法，测定中还包括以下步骤：

(1)配制供试品溶液：

取马来酸阿伐曲泊帕原料，加乙腈-三氟乙酸水溶液溶解并稀释，摇匀，作为供试品溶液；

(2)配制对照品溶液：

取马来酸阿伐曲泊帕对照品，加乙腈-三氟乙酸水溶液溶解并稀释，摇匀，继续用乙腈-三氟乙酸水溶液稀释定容，作为对照品溶液；

(3)配制系统适用性溶液：

取各杂质马来酸阿伐曲泊帕中间体2对照品、马来酸阿伐曲泊帕中间体3对照品、马来酸阿伐曲泊帕中间体4对照品、杂质F对照品、杂质G对照品、杂质N对照品、杂质T对照品、杂质S对照品、杂质H对照品，用乙腈-三氟乙酸水溶液溶解并稀释，作为杂质贮备溶液；取马来酸阿伐曲泊帕，加入杂质贮备溶液中，用乙腈-三氟乙酸水溶液稀释，作为系统适用性溶液；

(4)配制灵敏度溶液：

取对照品溶液用乙腈-三氟乙酸水溶液稀释，摇匀，作为灵敏度溶液；

(5)检测：将配制的供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液、灵敏度溶液注入超高效液相色谱仪检测，记录色谱图，由系统适用性溶液中各杂质的保留时间定性，以加校正因子的主成分对照法计算各杂质的含量。

采用的超高效液相色谱条件还包括：进样量，2μL；柱温，13～17℃，优选为15℃；流速，0.38～0.42mL/min，优选为0.4mL/min。

采用的超高效液相色谱条件还包括：采用紫外检测器，检测波长为254nm。

色谱柱为C

流动相A与流动相B的体积比为(95～5)：(5～95)。

流动相A中水、甲醇、三氟乙酸的体积比(92～98)：(2～8)：(0.1～0.5)，流动相B中的乙腈、三氟乙酸的体积比(98～92)：(0.1～0.5)。

梯度洗脱的洗脱条件，如表1所示。

表1洗脱条件

优选的洗脱条件，如表2所示。

表2优选洗脱条件

乙腈-三氟乙酸水溶液中的乙腈、水、三氟乙酸的体积比为(40～60):(40～60):(0.1～0.5)。

系统适用性溶液中马来酸阿伐曲泊帕的浓度为1.0mg/mL～1.2mg/mL，各杂质的浓度为1.0μg/mL～1.2μg/mL。

供试品溶液中的马来酸阿伐曲泊帕的浓度为1.0mg/mL～1.2mg/mL。

对照品溶液中马来酸阿伐曲泊帕的浓度为0.01mg/mL～0.02mg/mL。

本发明所述的各个杂质的结构式、化学式如表3所示。

表3各个杂质的结构式、化学式

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

(1)本发明的马来酸阿伐曲泊帕有关物质的超高效液相色谱测定方法，将存在的马来酸阿伐曲泊帕中间体2、马来酸阿伐曲泊帕中间体3、马来酸阿伐曲泊帕中间体4、杂质F、杂质G、杂质N、杂质T品、杂质S、杂质H共九种杂质同时进行有效分离，有效控制产品质量，并且缩短了分析时间，减少了溶剂用量，降低了分析成本。

(2)本发明的马来酸阿伐曲泊帕有关物质的超高效液相色谱测定方法，快速有效的检测马来酸阿伐曲泊帕有关物质，且各杂质间分离度好，，系统适用性、线性关系好，精密度高，准确度、重复性好，结果更准确真实。

附图说明

图1为本发明方法的专属性试验中的空白溶液、供试品溶液、系统适用性溶液、马来酸定位溶液，以及其他九种杂质的定位溶液的超高效液相色谱图的叠加谱图；

图2为本发明方法的专属性试验中的系统适用性溶液的超高效液相色谱图；

图3为本发明方法的检测限、定量限试验中的定量限溶液的超高效液相色谱图的叠加谱图；

图4为本发明方法的检测限、定量限试验中的检测限溶液的超高效液相色谱图的叠加谱图；

图5为本发明方法的线性与范围试验中的阿伐曲泊帕线性标准曲线图；

图6为本发明方法的线性与范围试验中的马来酸阿伐曲泊帕中间体2线性标准曲线图；

图7为本发明方法的线性与范围试验中的杂质F线性标准曲线图；

图8为本发明方法的线性与范围试验中的杂质T线性标准曲线图；

图9为本发明方法的线性与范围试验中的杂质N线性标准曲线图；

图10为本发明方法的线性与范围试验中的马来酸阿伐曲泊帕中间体3线性标准曲线图；

图11为本发明方法的线性与范围试验中的杂质G线性标准曲线图；

图12为本发明方法的线性与范围试验中的马来酸阿伐曲泊帕中间体4线性标准曲线图；

图13为本发明方法的耐用性试验中的不同流速的系统适用性溶液的超高效液相色谱图；

图14为本发明方法的耐用性试验中的不同比例的系统适用性溶液的超高效液相色谱图。

图15为本发明方法的耐用性试验中的不同柱温的系统适用性溶液的超高效液相色谱图。

图16为本发明方法的耐用性试验中的不同色谱柱的系统适用性溶液的超高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明所述的具体的马来酸阿伐曲泊帕有关物质的超高效液相色谱测定方法，包括以下步骤：

(1)配制供试品溶液：

取马来酸阿伐曲泊帕原料30mg，精密称定，置25mL量瓶中，加乙腈-三氟乙酸水溶液超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

(2)配制对照品溶液：

取马来酸阿伐曲泊帕对照品30mg，精密称定，置25mL量瓶中，加乙腈-三氟乙酸水溶液超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置100mL量瓶中，用乙腈-三氟乙酸水溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；

(3)配制系统适用性溶液：

取各杂质马来酸阿伐曲泊帕中间体2对照品、马来酸阿伐曲泊帕中间体3对照品、马来酸阿伐曲泊帕中间体4对照品、杂质F对照品、杂质G对照品、杂质N对照品、杂质T对照品、杂质S对照品、杂质H对照品各适量，用乙腈-三氟乙酸水溶液溶解并稀释制成每1mL含30μg的溶液，作为杂质贮备溶液；取马来酸阿伐曲泊帕适量，精密加入杂质贮备溶液适量，用乙腈-三氟乙酸水溶液并稀释制成每1mL分别约含马来酸阿伐曲泊帕1.2mg与各杂质1.5μg的溶液，作为系统适用性溶液；

(4)配制灵敏度溶液：

精密量取对照品溶液1mL，置20mL量瓶中，用乙腈-三氟乙酸水溶液稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度溶液；

(5)检测：将配制的供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液、灵敏度溶液注入超高效液相色谱仪检测，记录色谱图，由系统适用性溶液中各杂质的保留时间定性，以加校正因子的主成分对照法计算各杂质的含量。色谱条件为：色谱柱，Agilent RRHD Bonus-RP，2.1×100mm，1.8μm，以十六烷基酰胺基键合硅胶为填充剂；进样量，2μL；检测波长，254nm；柱温，13～17℃；流速，0.38～0.42mL/min；以水-甲醇-三氟乙酸溶液为流动相A，乙腈-三氟乙酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱。

实施例使用的马来酸阿伐曲泊帕原料来源于：瑞阳制药股份有限公司，批号892101102。其他试剂如无特别说明，均为市售常规原料。马来酸阿伐曲泊帕对照品与马来酸阿伐曲泊帕原料是同一物质，对照品就是把原料标定准确含量。

本发明所述的马来酸阿伐曲泊帕有关物质的超高效液相色谱测定方法的方法学验证。

以下实验所采用的测定方法及条件为：

(1)稀释剂：乙腈-水-三氟乙酸(体积比50:50:0.3)；

空白溶液：乙腈-水-三氟乙酸(体积比50:50:0.3)；

灵敏度溶液：精密量取对照品溶液1mL，置20mL量瓶中，用乙腈-水-三氟乙酸(50:50:0.3)稀释至刻度，摇匀。

(2)样品分析

空白溶液：进样1针；

系统适用性溶液：进样1针；

灵敏度溶液：进样1针；

对照品溶液：进样1针；

供试品溶液：进样1针。

(3)色谱条件

色谱柱：Agilent RRHD Bonus-RP，2.1×100mm，1.8μm；

色谱柱温度：15℃；

流动相流速：0.4mL/min；

检测波长：254nm；

进样量：2μL；

流动相：以水-甲醇-三氟乙酸(950:50:3)为流动相A，乙腈-三氟乙酸(1000:3)为流动相B，采用梯度洗脱，如表2所示。

(4)系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，杂质N峰与阿伐曲泊帕峰之间的分离度应不小于1.2，阿伐曲泊帕峰的拖尾因子不得过3.0，理论板数按阿伐曲泊帕峰计算不低于20000。

(5)灵敏度溶液要求：灵敏度溶液色谱图中，阿伐曲泊帕峰峰高的信噪比应不小于10。

(6)计算方式：杂质的峰面积/对照品的峰面积×校正因子×1/100。

实施例1

专属性试验：

(1)配制供试品溶液：

取马来酸阿伐曲泊帕原料30mg，精密称定，置25mL量瓶中，加乙腈-三氟乙酸水溶液超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

(2)配制各杂质定位溶液：

取杂质马来酸阿伐曲泊帕中间体2对照品、马来酸阿伐曲泊帕中间体3对照品、马来酸阿伐曲泊帕中间体4对照品、杂质F对照品、杂质G对照品、杂质H对照品、杂质N对照品、杂质T对照品、杂质S对照品、马来酸对照品各适量，用乙腈-三氟乙酸水溶液溶解并稀释制成每1mL中约含马来酸阿伐曲泊帕中间体2、马来酸阿伐曲泊帕中间体3、马来酸阿伐曲泊帕中间体4、杂质F、杂质G、杂质H对照品、杂质N、杂质T、杂质S各5μg与马来酸0.18mg的溶液，作为各杂质定位溶液；

(3)配制系统适用性溶液：

取杂质马来酸阿伐曲泊帕中间体2对照品、马来酸阿伐曲泊帕中间体3对照品、马来酸阿伐曲泊帕中间体4对照品、杂质F对照品、杂质G对照品、杂质N对照品、杂质T对照品、杂质S对照品、杂质H对照品、马来酸阿伐曲泊帕原料各适量，用乙腈-三氟乙酸水溶液溶解并稀释制成每1mL分别含马来酸阿伐曲泊帕1.2mg与各杂质5μg的溶液，作为系统适用性溶液；

通过进样供试品溶液、各杂质定位溶液及系统适用性溶液作为专属性溶液，考察方法的专属性，通过专属性试验确定该潜在杂质在测定条件下相对保留时间、分离度、确定所关注的杂质能被有效分离。如图1～图2所示，可以看出主峰与相邻杂质及各已知杂质均能有效分离，专属性强。专属性试验结果见表4。

表4有关物质检查专属性试验结果

结论：本色谱条件下，马来酸阿伐曲泊帕与相邻杂质间的最小分离度为1.442(不得小于1.2)，符合要求，各已知杂质均能有效分离，专属性强。

实施例2

检测限、定量限试验：

取马来酸阿伐曲泊帕对照品30mg，精密称定，置25mL量瓶中，加乙腈-三氟乙酸水溶液超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置100mL量瓶中，用乙腈-三氟乙酸水溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；

取马来酸阿伐曲泊帕及各杂质对照品，采用逐步稀释法，当信噪比S/N≥3时的浓度作为检测限浓度；当信噪S/N≥10的浓度作为定量限浓度，定量限溶液6针，峰面积的RSD应≤10.0％。如图3～图4所示，可以看出阿伐曲泊帕及各杂质定量限与检测限良好。

检测限、定量限试验结果见表5、表6。

表5有关物质检查定量限试验结果

表6有关物质检查检测限试验结果

结论：各定量限浓度重复进样6次，峰面积的RSD均小于10.0％，阿伐曲泊帕及各杂质定量限均小于供试品标示浓度的报告限(0.05％)，定量限、检测限良好。

实施例3

线性与范围试验：

不同浓度的溶液的配制：取杂质马来酸阿伐曲泊帕中间体2对照品、马来酸阿伐曲泊帕中间体3对照品、马来酸阿伐曲泊帕中间体4对照品、杂质F对照品、杂质G对照品、杂质N对照品、杂质T对照品、马来酸阿伐曲泊帕对照品各适量，用溶剂定量稀释制成每1mL中约含各杂质0.30μg、0.75μg、1.50μg、2.25μg、3.00μg、6.00μg；阿伐曲泊帕0.30μg、0.75μg、1.50μg、3.00μg、10..00μg、15.00μg的溶液，即得。

方法的线性通过6个不同浓度溶液的线性来实现，以测得峰面积对浓度作图，呈现良好的线性(线性相关系数≥0.995)，并同时确定测定的范围。如图5～图12所示，可以看出阿伐曲泊帕及各杂质线性关系良好。

阿伐曲泊帕线性实验结果见表7。

表7有关物质检查阿伐曲泊帕线性关系试验结果

马来酸阿伐曲泊帕中间体2线性实验结果见表8。

表8有关物质检查马来酸阿伐曲泊帕中间体2线性关系试验结果

杂质F线性实验结果见表9。

表9有关物质检查杂质F线性关系试验结果

杂质T线性实验结果见表10。

表10有关物质检查杂质T线性关系试验结果

杂质N线性实验结果见表11。

表11有关物质检查杂质N线性关系试验结果

马来酸阿伐曲泊帕中间体3线性实验结果见表12。

表12关物质检查马来酸阿伐曲泊帕中间体3线性关系试验结果

杂质G线性实验结果见表13。

表13有关物质检查杂质G线性关系试验结果

马来酸阿伐曲泊帕中间体4线性实验结果见表14。

表14有关物质检查马来酸阿伐曲泊帕中间体4线性关系试验结果

根据上述线性试验结果，计算测得已知杂质的相对校正因子(f＝k

表15有关物质检查杂质的校正因子试验结果

结论：阿伐曲泊帕及各杂质的线性与范围的相关系数均大于0.99，线性关系良好。

实施例4

重复性试验：

平行配制6份供试品溶液与实施例1相同的配制方法，计算供试品溶液中各杂质含量的RSD，考察方法的重复性。

各杂质重复性试验结果见表16。

表16有关物质检查重复性试验结果

结论：6份供试品杂质含量的RSD均小于10％，符合要求，方法的重复性良好。

实施例5

精密度试验：

更换不同人员、日期、仪器(仪器型号：Waters Acquity H-CLASS超高效液相色谱仪；重复性试验仪器编号：LC-27；中间精密度试验仪器编号：LC-20)，同实施例1的方法制备6份(供试品溶液，计算供试品溶液中各杂质含量的RSD，测得的结果与重复性试验项下共12份(n为12)供试品溶液的结果汇总，计算含量的RSD，考察方法的精密度。各杂质重复性试验结果见表17。

表17有关物质检查重复性试验结果

结论：12份供试品杂质含量的RSD均小于30％，均符合要求，方法的精密度良好。

实施例6

准确度试验：

样品中加入不同浓度的杂质的溶液的配制：

(1)配制杂质混合溶液：

取杂质马来酸阿伐曲泊帕中间体2对照品、马来酸阿伐曲泊帕中间体3对照品、马来酸阿伐曲泊帕中间体4对照品、杂质F对照品、杂质G对照品、杂质N对照品、杂质T对照品各适量，用乙腈-三氟乙酸水溶液溶解并稀释制成每1mL约含各杂质0.03mg的溶液，作为杂质混合溶液；

(2)配制杂质对照品溶液：

精密量取杂质混合溶液0.5mL，置10mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品溶液。

(3)配制回收率溶液：

精密称取马来酸阿伐曲泊帕原料9份各适量，置不同的量瓶中，分别精密加入杂质混合溶液适量，用溶剂溶解并定量稀释制成每1mL中约含阿伐曲泊帕1mg，各杂质分别约为0.45μg、1.50μg、2.25μg的溶液(每个浓度平行配制3份)，作为回收率溶液。

准确度是指用该方法测定与真实值的接近程度，用回收率表示，通过考察样品中加入不同浓度的杂质的回收率来实现。各杂质准确度实验结果见表18。

表18有关物质检查准确度试验结果

结论：各杂质的回收率均在80％～120％之间，回收率的RSD均小于10.0％，表明本方法测定各杂质的含量准确度良好。

实施例7

耐用性试验：

通过改变不同的色谱条件，系统适用性均符合标准规定，不同条件下有关物质测定结果一致，耐用性良好。

不同色谱条件下测得结果见表19和表20，如图13～图16所示，可以看出方法的耐用性良好。

表19有关物质检查耐用性试验结果1(供试品溶液)

表20有关物质检查耐用性试验结果2(系统适用性溶液)

结论：通过改变不同的色谱条件，系统适用性溶液中杂质N峰与阿伐曲泊帕的分离度最小为1.312(＞1.2)符合要求，最大单杂，总杂质变化的RSD均小于10％，符合要求。本法耐用性良好。

从以上验证结果可以得知，本发明的测定方法为超高效液相色谱法，不仅将工艺过程中的马来酸阿法曲波帕中间体2、杂质F、杂质N、杂质H、马来酸阿法曲波帕中间体4、杂质G 6个杂质有效分离，而且将工艺中极可能存在的杂质较难分离杂质马来酸阿法曲波帕中间体3、杂质T、杂质S进行有效分离，能有效的控制产品质量；并且缩短了分析时间，减少了溶剂用量，降低了分析成本。而且该方法灵敏度高、专属性强，准确度高，耐用性好、适用性强、结果稳定可靠，从而可用于马来酸阿伐曲泊帕的质量控制，为最终成品的质量提供有效保障，填补了利用超高效液相色谱仪检测马来酸阿伐曲泊帕有关物质的空白。