阿莫奈韦中间体的反应底物检测方法

技术领域

本发明涉及化合物检测技术领域，具体涉及一种阿莫奈韦中间体的反应底物检测方法。

背景技术

现有技术中，对于羧酸生成酰氯的反应监测，常采用衍生化方法来检测酰氯，如中国专利公开文献CN116718691A、CN107014944A等。由于酰氯非常活泼，且反应过程中需用到氯化剂如二氯亚砜、三氯氧磷作为反应试剂等，直接用HPLC法或GC法分析酰氯含量往往会产生错误的结果(因会受到氯化剂的干扰)，且酰氯也会对仪器、色谱柱可能造成不可逆的伤害，酰氯化合物可能会与色谱柱的固定相等发生反应。

另外，对于羧酸制备酰氯的反应，HPLC法多利用DAD检测器，通过检测衍生化的酰氯来检测酰氯的含量，而衍生过后反应体系产物复杂，使用DAD检测器可能无法避免底物及其合成中间体的基质干扰。

阿莫奈韦是一种抗带状疱疹病毒药物，1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酸是其合成的重要中间体。由于酰氯比相应的羧酸活性更强，用酰氯作原料的反应也往往产率更高，因此工艺上制取酰胺、酯、酸酐时常以酰氯为原料。在阿莫奈韦合成过程中，通常需将1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酸与氯化剂反应生成1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酰氯。反应过程中的底物1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酸的消耗量和产物1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酰氯的量的监控对于反应的过程控制非常重要。但目前还没有针对反应过程中底物、产物如何准确检测的报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种阿莫奈韦中间体的反应底物检测方法。该检测方法简单高效、准确度高，且不会对检测仪器造成不可逆伤害。

本发明技术方案详述如下：

第一方面，本发明提供了阿莫奈韦中间体的反应底物检测方法，是先向阿莫奈韦中间体的供试品溶液中加入衍生试剂发生衍生化反应，使供试品溶液中的反应底物酰氯转化为相应的衍生化合物，再加入水终止反应，通过检测剩余羧酸含量来计算反应底物酰氯含量。

供试品溶液即供检测的样品溶液，内含酰氯。所述衍生试剂为苯胺、对甲氧基苯胺、苯甲醇、苯酚、甲醇中的任意一种。不同衍生试剂与酰氯反应后的衍生化合物如下：苯胺→1,1-二氧代-N-苯硫杂环己烷-3-甲酰胺；对甲氧基苯胺→2-(1,1-二氧代硫杂环己烷-3-基)-N-(3-甲氧基苯基)甲酰胺；甲醇→1,1-二氧代硫杂环己烷-4-羧酸甲酯；苯酚→1,1-二氧代硫杂环己烷-4-羧酸苯酯；苯甲醇→1,1-二氧代硫杂环己烷-4-羧酸苄酯。

可选或优选的，上述检测方法中，所述检测剩余羧酸含量使用液相色谱仪完成，制备对照品溶液，将对照品溶液和供试品溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液浓度通过外标法计算供试品中羧酸含量。

对照品溶液即用于计算供试品溶液中羧酸含量的已知羧酸浓度的溶液。外标法即外标一点法，使用一种浓度的对照品溶液与供试品溶液在相同条件下多次进样，测量峰面积的平均值，并用这些数据来计算样品中待测组分的量。

可选或优选的，上述检测方法中，所述液相色谱仪为电喷雾液相色谱仪。

可选或优选的，上述检测方法中，所述电喷雾液相色谱仪的色谱条件为：

色谱柱：C18色谱柱；

流动相A：0.2％三氟乙酸水溶液(三氟乙酸的体积百分浓度为0.2％)；

流动相B：乙腈

梯度洗脱程序：

可选或优选的，上述检测方法中，所述色谱条件还包括：

柱温：40℃；

进样体积：10μl；

流速：1.0ml/min；

CAD雾化器温度：40℃。

可选或优选的，上述检测方法中，所述色谱柱为YMC Triart C18色谱柱，规格：4.6×150mm，3μm。

可选或优选的，上述检测方法中，所述反应底物酰氯为1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酰氯，所述羧酸为1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酸。

可选或优选的，上述检测方法中，所述供试品溶液和对照品溶液均用乙腈水溶液进行稀释。所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比优选为3:7，可最大程度减小溶剂效应。

可选或优选的，上述检测方法中，所述衍生试剂为苯胺，加入衍生试剂后，还加入乙腈作为溶剂，再用超声进行分散溶解，最后加入水进行稀释。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明方法是通过检测羧酸来计算待测阿莫奈韦中间体的反应底物的供试品中的酰氯，检测对象为供试品经过反应后剩余的羧酸，相较于以往检测衍生产物，检测羧酸更容易定位羧酸的出峰位置，无需另外制备衍生物的对照品，无需标定衍生物作为外标对照品。操作简单、结果准确。

本发明方法在向供试品溶液中加入苯胺发生衍生化反应，使供试品中的酰氯转化为酰胺化合物，苯胺加入量通常远超酰氯的10倍当量，以确保无酰氯残留，再加入水终止反应，由于苯胺与酰氯发生反应迅速，加水基本不会影响结果准确性，使得进样之前，样品变成一个稳定的体系，不会损伤色谱柱。

在阿莫奈韦中间体1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酰氯含量检测时，加入苯胺后还可以加入乙腈作为溶剂，用超声使供试品与苯胺充分分散溶解，便于苯胺和酰氯充分反应。加水还能有效防止检测过程中未反应的羧酸与二氯亚砜反应生成酰氯后，再和苯胺反应，导致剩余羧酸被消耗检测结果不准确。以及，防止二氯亚砜(可迅速与水反应)对色谱柱的伤害。

与常见的液相色谱仪检测器DAD(二极管阵列)检测器相比，本发明使用电喷雾检测器(CAD)，其响应不受化合物紫外吸收基团的影响，可以检测DAD检测器无法检测到的弱紫外吸收化合物。本发明方法利用CAD检测器，可避免衍生过后反应体系中少量强紫外吸收产物的影响，检测目标对象为酰氯的反应底物羧酸。

附图说明

图1为实施例1中空白溶液1色谱图；

图2为实施例1中对照品溶液1色谱图；

图3为实施例1中供试品溶液1色谱图；

图4为实施例2中空白溶液2色谱图；

图5为实施例2中对照品溶液2色谱图；

图6为实施例2中供试品溶液2色谱图；

图7为实施例3中DMF稀释的供试品溶液3色谱图；

图8为实施例3中DMSO稀释的供试品溶液3色谱图；

图9为实施例3中乙腈稀释的供试品溶液3色谱图；

图10为实施例5中对照品溶液5-苯胺色谱图；

图11为实施例5中供试品溶液5-苯胺色谱图；

图12为实施例5中对照品溶液5-对甲氧基苯胺色谱图；

图13为实施例5中供试品溶液5-对甲氧基苯胺色谱图；

图14为实施例5中对照品溶液5-苯甲醇色谱图；

图15为实施例5中供试品溶液5-苯甲醇色谱图；

图16为实施例5中对照品溶液5-苯酚色谱图；

图17为实施例5中供试品溶液5-苯酚色谱图；

图18为实施例5中对照品溶液5-甲醇色谱图；

图19为实施例5中供试品溶液5-甲醇色谱图；

图20为实施例6对照品溶液6-苯胺色谱图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合实施例及附图，对本申请进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

以下实施例中，所用设备：

HPLC-DAD：厂家：岛津，型号：LC-20AD；

HPLC-CAD：厂家：Thermo，型号：Ultimate 3000。

所用试剂：

1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酸，厂家：山东轩德；

1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酰氯溶液，厂家：自制。

对甲氧基苯胺，厂家：阿拉丁，级别/含量：99％

苯胺，厂家：川东化工，级别/含量：AR；

苯酚，厂家：科龙，级别/含量：AR；

苯甲醇，厂家：科隆，级别/含量：AR；

甲醇，厂家：Honeywell，级别/含量：HPLC；

乙腈，厂家：Honeywell，级别/含量：HPLC；

实施例1CAD检测器可有效避免苯胺干扰

检测方法：液相色谱检测

检测器：CAD检测器

溶液配制：

溶剂1：乙腈与水按体积比3:7混合而成。

空白溶液1：移取苯胺1ml，置10ml量瓶中，用溶剂1稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品储备液1：精密称取对照品1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酸100mg，置于10ml量瓶中，用溶剂1超声溶解，定容至刻度，摇匀，即得(含1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酸10mg/ml)

对照品溶液1：移取对照品储备液1用量为1ml，置10ml量瓶中，加苯胺1ml，摇晃，放置5分钟后用溶剂1稀释至刻度，摇匀，即得(含1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酸1mg/ml)。

供试品溶液1：取1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酰氯溶液(浓度为80mg/ml，溶剂为THF，四氢呋喃)0.5ml，加入0.5ml苯胺，加入3ml乙腈，超声5min，加超纯水稀释至刻度，摇匀。(含1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酰氯4mg/ml)。

空白溶液1、对照品溶液1、供试品溶液1分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

色谱条件：

洗脱程序：

空白溶液1、对照品溶液1、供试品溶液1的色谱图如图1-3所示，图1为空白溶剂1仅含有苯胺，在前15min，未见出峰，图2为1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酸对照品溶液，其出峰时间约为8.8min，图3中8.8min左右的峰为1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酰氯利用苯胺衍生后的供试品溶液中的1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酸，其左右均未有杂质干扰，表明本方法具有较好的专属性。由于CAD检测器的特殊要求只能使用挥发性缓冲液，如甲酸，乙酸，甲酸铵，乙酸铵，三氟乙酸不能超过0.3％，所以流动相1A不能使用磷酸与氨水，更换为与CAD检测器相适配的三氟乙酸。

实施例2DAD检测器无法避免苯胺干扰

其他条件与实施例1均相同，检测器使用DAD检测器。

溶液配制：

溶剂2：乙腈与水按体积比3:7混合而成。

空白溶液2：移取苯胺1ml，置10ml量瓶中，用溶剂2稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品储备液2：精密称取对照品1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酸100mg，置于10ml量瓶中，用溶剂2超声溶解，定容至刻度，摇匀，即得(含1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酸10mg/ml)。

对照品溶液2：移取对照品储备液2用量为1ml，置10ml量瓶中，加苯胺1ml，摇晃，放置5分钟后用溶剂2稀释至刻度，摇匀，即得(含1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酸1mg/ml)。

供试品溶液2：取1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酰氯溶液(浓度为80mg/ml，溶剂为THF，四氢呋喃)0.5ml，加入0.5ml苯胺，加入3ml乙腈，超声5min，加超纯水稀释至刻度，摇匀。(含1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酰氯4mg/ml)。

空白溶液2、对照品溶液2、供试品溶液2分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

色谱条件：

洗脱程序：

空白溶液2、对照品溶液2、供试品溶液2的色谱图如图4-6所示，图4为空白溶液2，仅含有苯胺，前10min有一较大的苯胺峰，会干扰羧酸的检测；图5为羧酸在空白溶液2中的响应情况。图6为供试品溶液2中羧酸的响应情况。图5，6均能看出羧酸出峰位置在苯胺出峰的末尾，此时由于基质效应，羧酸峰较小，且羧酸峰(10.628min处)左右可能会出现未知杂质干扰测定。对比图3与图6发现苯胺在CAD检测器中对羧酸的检测几乎没有干扰并且没有其余强紫外吸收物质干扰方法具有更好的专属性。

实施例3对稀释剂的筛选

溶液配制：

供试品溶液3：分别取1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酰氯溶液(浓度为80mg/ml，溶剂为THF)0.5ml，置10ml量瓶中，加入0.5ml苯胺后，分别加入不同稀释剂(75％DMF水，75％DMSO水，75％乙腈水，均为体积比)溶解并稀释至刻度，超声5min，摇匀(含1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酰氯4mg/ml)。

将上述不同稀释剂稀释的供试品3注入液相色谱仪，记录色谱图。

色谱条件：

洗脱程序：

DMF稀释的供试品溶液3、DMSO稀释的供试品溶液3、乙腈稀释的供试品溶液3的色谱图如图7-9所示，图7为DMF稀释的供试品溶液3，与图8、9对比，DMF作为稀释剂掩盖了羧酸出峰。图8为DMSO稀释的供试品溶液3，与图9乙腈稀释的供试品溶液3对比，基质效应更加明显。优选反应溶剂为乙腈，即稀释剂中的有机相为乙腈。

实施例4本发明方法回收率

溶液配制：

溶剂4：乙腈-水(体积比3：1)。

对照品储备液4：取对照品1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酸50mg，精密称定，置于10ml量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀，即得(含对照品5mg/ml)。

对照品溶液4：取对照品储备液4总计0.1ml，置于10ml量瓶中，加苯胺0.5ml用溶剂4稀释成0.05mg/ml溶液。

供试品溶液4：取酰氯溶液(浓度为100mg/ml，溶剂为THF)0.5ml，置10ml量瓶中，加苯胺0.5ml，摇晃，反应5分钟后，加1ml超纯水淬灭反应，用溶剂4稀释至刻度，摇匀，即得。

1％加标供试品溶液4：取酰氯溶液(浓度为100mg/ml，溶剂为THF)0.5ml，置10ml量瓶中，加苯胺0.5ml，摇晃，反应5分钟后，加1ml超纯水淬灭反应，加入对照品储备液0.1ml，用溶剂4稀释至刻度，摇匀，即得。

5％加标供试品溶液4：取酰氯溶液(浓度为100mg/ml，溶剂为THF)0.5ml，置10ml量瓶中，加苯胺0.5ml，摇晃，反应5分钟后，加1ml超纯水淬灭反应，加入对照品储备液0.5ml，用溶剂4稀释至刻度，摇匀，即得。

10％加标供试品溶液4：取酰氯溶液(浓度为100mg/ml，溶剂为THF)0.5ml，置10ml量瓶中，加苯胺0.5ml，摇晃，反应5分钟后，加1ml超纯水淬灭反应，加入对照品储备液1ml，用溶剂4稀释至刻度，摇匀，即得。

色谱条件：

洗脱程序：

回收率计算公式：

M

标准加入法计算回收率：

当供试品中羧酸含量在1％～10％之间时，回收率范围在97％～105％之间，RSD由1％水平至10％水平分别是2.0％、1.3％、1.0％。

实施例5衍生化反应试剂筛选

备选的衍生化反应试剂：苯胺、对甲氧基苯胺、苯甲醇、苯酚、甲醇。

溶液配制：

溶剂5：乙腈-水(体积比3：1)。

对照品储备液5：精密称取对照品1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酸200mg，置于20ml量瓶中，用溶剂5溶解，定容至刻度，摇匀，即得(含对照品10mg/ml)。

对照品溶液5-苯胺：移取1ml对照品储备液5，置10ml量瓶中，加苯胺1ml，摇晃，放置5分钟后用溶剂5稀释至刻度，摇匀，即得(含对照品1mg/ml)。

对照品溶液5-苯甲醇：移取1ml对照品储备液5，置10ml量瓶中，加苯甲醇1ml，摇晃，放置5分钟后用溶剂5稀释至刻度，摇匀，即得(含对照品1mg/ml)。

对照品溶液5-甲醇：移取1ml对照品储备液5，置10ml量瓶中，加甲醇1ml，摇晃，放置5分钟后用溶剂5稀释至刻度，摇匀，即得(含对照品1mg/ml)。

对照品溶液5-苯酚：移取1ml对照品储备液5，置10ml量瓶中，加苯酚1g，摇晃，放置5分钟后用溶剂5稀释至刻度，摇匀，即得(含对照品1mg/ml)。

对照品溶液5-对甲氧基苯胺：移取1ml对照品储备液5，置10ml量瓶中，加对甲氧基苯胺1g，摇晃，放置5分钟后用溶剂5稀释至刻度，摇匀，即得(含对照品1mg/ml)。

供试品溶液5：取1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酰氯溶液(浓度为80mg/ml，溶剂为THF)0.5ml，置10ml量瓶中，加入0.5ml苯胺(或0.5g苯酚、0.5ml苯甲醇、0.5g对甲氧基苯胺，0.5ml甲醇)，加入溶剂溶解并稀释至刻度，超声5min，摇匀(含1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酰氯4mg/ml)。分别标记为供试品溶液5-苯胺、供试品溶液5-苯酚、供试品溶液5-苯甲醇、供试品溶液5-对甲氧基苯胺和供试品溶液5-甲醇。

色谱条件：

洗脱程序：

各样品的色谱图如图10-19所示，图10-19分别为使用不同衍生试剂进行衍生的结果，分别对应衍生试剂为苯胺、对甲氧基苯胺、苯甲醇、苯酚、甲醇。可观察到8min左右为羧酸的峰，其左右均无明显的杂质干扰，使用CAD检测器，可选衍生试剂种类更多且干扰更少。

实施例6检测器RID(示差折光指数检测器)

溶液配制：

溶剂6：乙腈-水(体积比3：7)。

对照品储备液6：精密称取对照品1,1-二氧代-六氢-1L6-硫基吡喃-4-甲酸200mg，置于20ml量瓶中，用溶剂6溶解，定容至刻度，摇匀，即得(对照品浓度10mg/ml)。

对照品溶液6-苯胺：移取对照品储备液6总计1ml，置10ml量瓶中，加苯胺1ml，摇晃，放置5分钟后用溶剂6稀释至刻度，摇匀，即得(对照品浓度1mg/ml)。

色谱条件：

洗脱程序：

对照品溶液6-苯胺的色谱图如图20所示，羧酸的峰为12.230min的峰，图中羧酸的峰前后仍有未知峰的干扰，且基线抬起，表明在示差检测器条件下仍无法避免衍生试剂带来的基质效应，对羧酸的检测有一定的影响。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。