一种液相色谱-质谱联用测定左卡尼汀中三甲胺含量的方法

技术领域

本申请涉及三甲胺分析测试技术领域，具体是涉及一种液相色谱-质谱联用测定左卡尼汀中三甲胺含量的方法。

背景技术

三甲胺常温下为气体，有鱼腥味恶臭，主要对眼、鼻、咽喉和呼吸道黏膜有刺激作用；三甲胺被人体摄入后，在肝脏黄素单加氧酶3作用下氧化成氧化三甲胺。氧化三甲胺导致心血管疾病风险增加，对内分泌系统疾病、阿尔兹海默病，肾脏病等的发生发展有促进作用。

左卡尼汀是哺乳动物能量代谢所必须的天然物质，临床上也称为左旋肉碱，其注射液多用于缓解肾衰竭者因长期血液透析，肉碱缺乏所引发的高脂血症、心肌病、肌痉挛及心律失常等症状。三甲胺是左卡尼汀的起始物料，同时也是其高温降解产物，因此在原料和注射剂中对三甲胺进行控制尤为重要。

目前，左卡尼汀中三甲胺的测定方法有气相色谱法和离子色谱法，在气相色谱法测定时，由于三甲胺在左卡尼汀原料或制剂中常以离子形态存在，需添加强碱使其转化为易挥发的三甲胺分子形态，强碱性会缩短色谱柱使用寿命；离子色谱法直接测定时，左卡尼汀对三甲胺测定存在干扰，为了避免干扰，需经过复杂的前处理过程。

因此，需要针对左卡尼汀中三甲胺检测建立一种简便且灵敏度、准确性高的定量检测方法。

发明内容

本申请需要解决的技术问题是现有技术中测定结果偏高、前处理复杂等技术问题，提供一种液相色谱-质谱联用测定左卡尼汀中三甲胺(TMA)含量的方法，将三甲胺和左卡尼汀完全分离，避免了左卡尼汀对三甲胺测定的干扰，能避免出现假阳性，假阴性，测定方法简便快速，灵敏度高，定量结果准确。

一种液相色谱-质谱联用测定左卡尼汀中三甲胺含量的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)配制三甲胺的线性对照品溶液：将三甲胺盐酸盐对照品解于水中，制备得到不同浓度的线性对照品溶液；

(2)获得含有待测样品的供试品溶液：将待检测是否含有三甲胺杂质的左卡尼汀待测样品溶解于水中，制备得到供试品溶液；

(3)采用液相色谱-质谱联用法进行检测，标准曲线法计算待测样品中三甲胺的含量，

色谱条件为：

色谱柱：离子交换型复合型填料色谱柱；

流速：0.4～0.6mL·min

柱温：25～35℃，优选30℃，

进样体积：5μL；

流动相：0.1％甲酸水溶液-甲醇(95:5)，

洗脱方式：等度洗脱；

质谱条件为：

离子化方式：ESI；

干燥气流速：9～12L·min

干燥气温度：300～350℃，优选300℃，

雾化气流速：40～55psi，优选45psi，

鞘气温度：300～400℃，优选350℃，

鞘气流速：9～12L·min

毛细管电压：1500～4500V，优选1500V，

喷嘴电压：0～500V，优选300V；

扫描模式：正离子模式；

监测方式：

多反应监测(MRM)：m/z 60.1→60.1和m/z 60.1→45.1，

碰撞电压：10V和17V

碎裂电压：40V，

加速电压：3V。

进一步的，所述待测样品为左卡尼汀原料药、左卡尼汀注射液或左卡尼汀口服溶液。

进一步的，步骤(1)所述线性对照品溶液的浓度选自1～100ng·mL

进一步的，步骤(2)中，所述供试品溶液配制方法为：

当所述待测样品为左卡尼汀原料药、注射液、口服溶液时，精密取待测样品，加水定量稀释成含左卡尼汀20～100μg·mL

进一步的，步骤(3)所述检测为将步骤(1)配制的线性对照品溶液注入液相色谱-质谱联用仪中进行分离和检测，记录供试品溶液的色谱图，获得的三甲胺的标准曲线，再将步骤(2)配制的供试品溶液注入液相色谱-质谱联用仪中进行分离和检测，并根据供试品溶液峰面积计算三甲胺的浓度C，并计算待测样品中三甲胺的含量。

进一步的，步骤(3)所述离子交换型复合型填料色谱柱为以阳离子交换填料和C18为复合填料的复合型色谱柱。

进一步的，步骤(3)所述色谱柱为CAPCELL PAK CR 1:4，规格为150mm×2.0mmI.D.,5.0μm。

有益效果：

本申请所述一种液相色谱-质谱联用测定左卡尼汀中三甲胺(TMA)含量的方法采用以上技术方案与现有技术(气相色谱法和离子色谱法)相比，具有以下技术效果：

1、本申请采用液相进行干扰物质分离，C18和SCX混合填料色谱实现三甲胺(TMA)和左卡尼汀的有效分离，完全避免左卡尼汀对三甲胺(TMA)测定的干扰，保证了测定的准确度；色谱条件温和，延长色谱柱使用寿命。

2、本申请实现了三甲胺(TMA)和左卡尼汀的在线分离，分离与检测同步进行，有效简化了前处理方法，完成一次提取检测的时间仅为12分钟，分析检测效率高，且避免了前处理提取不完全导致的测定结果偏低或假阴性问题。

3、本申请所述技术的灵敏度更高，满足杂质定量要求，检测限为0.002ng，定量限为0.005ng。

附图说明

图1空白溶剂(水)典型色谱图；

图2对照品溶液(0.3ng·mL

图3对照品溶液(1ng·mL

图4供试品溶液(注射液)典型色谱图；

图5口服溶液空白辅料典型色谱图；

图6口服溶液加标溶液(0.5ng·mL

图7口服溶液加标溶液(1ng·mL

图8供试品溶液(口服溶液)典型色谱图；

图9原料加标溶液(0.5ng·mL

图10原料加标溶液(1ng·mL

图11供试品溶液(原料)典型色谱图；

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

本申请中所涉及甲醇和甲酸均为色谱纯，均从默克公司购买；纯净水为市售的屈臣氏蒸馏水；盐酸三甲胺(TMA)对照品从Aldrich-Sigma购买98.0％，批号1003513076。

实施例1注射液

(1)线性对照品溶液的制备：取三甲胺盐酸盐(TMA)适量，精密称定，加水溶解并定量稀释成浓度为1、2、5、20、50和100ng·mL

(2)供试品溶液的制备：精密量取待测样品1mL，加水定量稀释成20μg·mL

(3)液相色谱-质谱联用法检测：

色谱条件：

色谱柱：CAPCELL PAK CR 1:4(150mm×2.0mm I.D.,5.0μm)；流速为0.5mL·min

质谱条件：

离子化方式ESI；干燥气流速：9L·min

方法学验证：

1)专属性注射液中的主要成分为注射用水和盐酸，空白溶剂(水)、对照品溶液和供试品溶液的典型色谱图见图1，图3～图4，结果表明，该方法专属性良好。

2)线性和线性范围取浓度为1、2、5、20、50和100ng·mL

3)检出限和定量限取对照品溶液逐步稀释分别进样，记录S/N，S/N约为3∶1时的浓度作为检出限(图2)。S/N约为10∶1时的浓度作为定量限(图3)，

表1检出限，定量限和线性结果

4)重复性和准确度精密量取供试品(批号：1ZA230304)1mL，置200mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，平行制备6份，进样分析，三甲胺含量的RSD为2.8％，表明该方法重复性良好。

精密量取供试品(批号：1ZA230304)1mL，置200mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置50mL量瓶中，分别精密加入三甲胺对照品贮备液(500ng·mL

表2准确度测定结果

实际样品测定：

选取2批左卡尼汀注射液，分别用气相色谱法、离子色谱法和本申请方法同时测定，测定结果(表3)表明，本申请方法测定结果与气相色谱法测定结果基本一致；本申请方法高于离子色谱法，可能因离子色谱法前处理操作繁琐，导致提取不完全。

表3样品测定结果

实施例2口服溶液

(1)线性对照品溶液的制备：取三甲胺盐酸盐(TMA)适量，精密称定，加水溶解并定量稀释成浓度为1、2、5、20、50和100ng·mL

(2)供试品溶液的制备：精密量取待测样品1mL，加水定量稀释成100μg·mL

(3)液相色谱-质谱联用法检测：

色谱条件：

色谱柱：CAPCELL PAK CR 1:4(150mm×2.0mm I.D.,5.0μm)；流速为0.5mL·min

质谱条件：

离子化方式ESI；干燥气流速：9L·min

方法学验证：

1)专属性按处方量制备不同生产企业的口服溶液空白辅料，照供试品溶液制备方法同法操作，对照品溶液(1ng·mL

2)线性和线性范围取浓度为1、2、5、20、50和100ng·mL

3)检出限和定量限将对照品溶液用供试品溶液逐步稀释，记录S/N，S/N约为3∶1时的浓度作为检出限(图6)，S/N约为10∶1时的浓度作为定量限(图7)。

表4检出限，定量限和线性结果

4)重复性和准确度精密量取供试品(批号：2303151)1mL，置20mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，平行制备6份，进样分析，三甲胺均未检出。

精密量取供试品(批号：2303151)1mL，置20mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置50mL量瓶中，分别精密加入三甲胺对照品贮备液(500ng·mL

由于口服溶液中未检出三甲胺，故以回收率的RSD作为重复性的考察指标，结果表明(表5)，该方法的重复性良好。

表5准确度测定结果

实际样品测定

选取3批左卡尼汀口服溶液，采用气相色谱法和本申请方法同时测定，测定结果(表6)表明，本申请方法测定结果与气相色谱法测定结果一致；定量灵敏度与气相色谱法一致。

表6样品测定结果

实施例3原料药

1)线性对照品溶液的制备：取三甲胺盐酸盐(TMA)适量，精密称定，加水溶解并定量稀释成浓度为1、2、5、10和20ng·mL

(2)供试品溶液的制备：精密量取待测样品适量，加水定量稀释成100μg·mL

(3)液相色谱-质谱联用法检测：

色谱条件：

色谱柱：CAPCELL PAK CR 1:4(150mm×2.0mm I.D.,5.0μm)；流速为0.5mL·min

质谱条件：

离子化方式ESI；干燥气流速：9L·min

方法学验证：

1)专属性空白溶剂(水)、对照品溶液和供试品溶液的典型色谱图见图1、图3和图11，结果表明，该方法专属性良好。

2)线性和线性范围取浓度为1、2、5、10和20ng·mL

3)检出限和定量限将对照品溶液用供试品溶液逐步稀释，记录S/N，S/N约为3∶1时的浓度作为检出限(图9)，S/N约为10∶1时的浓度作为定量限(图10)。

表7检出限，定量限和线性结果

4)重复性和准确度精密量取供试品(批号：230101)25mg，置25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置10mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，平行制备6份，进样分析，三甲胺含量均未检出。

精密量取供试品(批号：230101)20mg，置25mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置10mL量瓶中，分别精密加入三甲胺对照品贮备液(100ng·mL

表8准确度测定结果

实际样品测定

选取3批左卡尼汀，采用气相色谱法和本申请方法同时测定，测定结果(表9)表明，本申请方法的检测灵敏度与气相色谱法相似，定量灵敏度与气相色谱法一致。

表9样品测定结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。