一种组织蛋白酶B靶向激活型PET分子探针及其应用

技术领域

本发明涉及一种组织蛋白酶B靶向激活型PET分子探针及其应用，属于化学技术领域。

背景技术

组织蛋白酶B(Cathepsin B，CTB)是木瓜蛋白酶家族的一种溶酶体蛋白酶，参与吞噬性物质的降解，具有识别并剪切底物的能力。许多疾病(包括癌症、动脉硬化和阿尔茨海默病等)都与组织蛋白酶B的水解有关。此外，组织蛋白酶B在人类癌症(如结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和胰腺癌等)中都高度表达。同时，组织蛋白酶B表达水平的上调极大地促进了肿瘤的血管生成、侵袭和转移。因此，组织蛋白酶B可以作为一种重要的肿瘤生物标志物，用于相关癌症的诊断和治疗，并且，准确检测组织蛋白酶B的活性对于癌症的早期诊断非常重要。

PET成像是一种非侵入性分子成像技术，具有灵敏度高和组织穿透性强的优势，拥有理想的内在特性来成像酶的活性，进而为区分癌症的变化提供有效的信息。开发能够准确检测组织蛋白酶B活性的PET分子探针，对癌症早期诊断的实现十分重要。然而，现阶段，并无能准确检测组织蛋白酶B活性的PET分子探针。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种靶向组织蛋白酶B的分子探针，所述靶向组织蛋白酶B的分子探针具有如下所示结构：

其中，X为放射性核素，R为

在本发明的一种实施方式中，所述放射性核素为

在本发明的一种实施方式中，当R为

当R为

当R为

当R为

当R为

时，

所述靶向组织蛋白酶B的分子探针具有如下所示结构：

在本发明的一种实施方式中，当R为

当R为

当R为

本发明还提供了一种制备上述靶向组织蛋白酶B的分子探针的方法，当R为

步骤一：将化合物CBT-1和化合物CitV经缩合反应，得到化合物Ⅰ-1；

步骤二：将化合物Ⅰ-1经脱保护反应，得到化合物Ⅰ-2；

步骤三：将化合物Ⅰ-2和2-(乙基二硫烷基)吡啶经缩合反应，得到化合物Ⅰ-3；

步骤四：将化合物Ⅰ-3、羟基琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸(NOTA-NHS)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)经缩合反应，得到靶向组织蛋白酶B的分子探针的前体化合物A；

步骤五：对靶向组织蛋白酶B的分子探针的前体化合物A进行放射性核素标记，得到靶向组织蛋白酶B的分子探针；

所述化合物CBT-1具有如下所示结构：

所述化合物CitV具有如下所示结构：

所述化合物Ⅰ-1具有如下所示结构：

所述化合物Ⅰ-2具有如下所示结构：

所述化合物Ⅰ-3具有如下所示结构：

当R为

步骤一：将化合物CBT-1和化合物CitV-M经缩合反应，得到化合物Ⅱ-1；

步骤二：将化合物Ⅱ-1经脱保护反应，得到化合物Ⅱ-2；

步骤三：将化合物Ⅱ-2和2-(乙基二硫烷基)吡啶经缩合反应，得到化合物Ⅱ-3；

步骤四：将化合物Ⅱ-3、羟基琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸(NOTA-NHS)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)经缩合反应，得到靶向组织蛋白酶B的分子探针的前体化合物B；

步骤五：对靶向组织蛋白酶B的分子探针的前体化合物B进行放射性核素标记，得到靶向组织蛋白酶B的分子探针；

所述化合物CitV-M具有如下所示结构：

所述化合物Ⅱ-1具有如下所示结构：

所述化合物Ⅱ-2具有如下所示结构：

所述化合物Ⅱ-3具有如下所示结构：

当R为

步骤一：将化合物CBT-1和化合物CitV-HEM经缩合反应，得到化合物Ⅲ-1；

步骤二：将化合物Ⅲ-1经脱保护反应，得到化合物Ⅲ-2；

步骤三：将化合物Ⅲ-2和2-(乙基二硫烷基)吡啶经缩合反应，得到化合物Ⅲ-3；

步骤四：将化合物Ⅲ-3、羟基琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸(NOTA-NHS)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)经缩合反应，得到靶向组织蛋白酶B的分子探针的前体化合物C；

步骤五：对靶向组织蛋白酶B的分子探针的前体化合物C进行放射性核素标记，得到靶向组织蛋白酶B的分子探针；

所述化合物CitV-HEM具有如下所示结构：

所述化合物Ⅲ-1具有如下所示结构：

所述化合物Ⅲ-2具有如下所示结构：

所述化合物Ⅲ-3具有如下所示结构：

本发明还提供了上述靶向组织蛋白酶B的分子探针在制备组织蛋白酶B显像剂中的应用。

本发明还提供了上述靶向组织蛋白酶B的分子探针在制备用于诊断癌症的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述癌症是指表达组织蛋白酶B的癌症；所述表达组织蛋白酶B的癌症包括结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和/或胰腺癌。

在本发明的一种实施方式中，所述产品包括检测试剂盒。

本发明还提供了一种靶向组织蛋白酶B的显像剂，所述显像剂含有上述靶向组织蛋白酶B的分子探针。

本发明还提供了一种用于诊断癌症的产品，其特征在于，所述产品含有上述靶向组织蛋白酶B的分子探针。

在本发明的一种实施方式中，所述癌症是指表达组织蛋白酶B的癌症；所述表达组织蛋白酶B的癌症包括结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和/或胰腺癌。

在本发明的一种实施方式中，所述产品包括检测试剂盒。

本发明技术方案，具有如下优点：

本发明提供了一种靶向组织蛋白酶B的分子探针，所述分子探针是通过在刺激响应型生物正交反应支架(SF，SF参见文献“Lin,Jianguo et al.Journal oftheAmericanChemical Society.144,17(2022):7667-7675”)的基础上引入标记基团NOTA以螯合放射性核素，并连接组织蛋白酶B特异性识别序列瓜氨酸-缬氨酸得到的。研究表明：所述分子探针能够被肿瘤微环境中的谷胱甘肽(GSH)还原和被组织蛋白酶B识别剪切，分子被剪切后裸露的氰基能够和氨基硫醇触发CBT-Cys点击缩合反应，发生分子内环化，形成环化产物并聚集，形成并聚集的环化产物能够减少细胞内分子泵出，增强所述分子探针在肿瘤细胞内滞留效果；所述探针分子能够被组织蛋白酶B高表达的细胞特异性摄取；所述分子探针能够对组织蛋白酶B高表达的肿瘤部位进行示踪成像，并有效区分组织蛋白酶B高中低不同表达水平的肿瘤；所述分子探针在组织蛋白酶B高表达的荷瘤鼠体内具有较好的肿瘤靶向性。因此，所述分子探针能够对组织蛋白酶B的活性进行准确和动态的监测，在组织蛋白酶B高表达癌症的早期诊断中极具应用前景。

附图说明

图1：化合物CitV的合成路线。

图2：前体化合物A的高分辨质谱图。

图3：分子探针[

图4：前体化合物A酶切的HPLC分析图(a)和酶动力学计算结果图(b)。

图5：组织蛋白酶B在不同细胞之间的表达情况(a)和分子探针[

图6：分子探针[

图7：分子探针[

图8：前体化合物B的高分辨质谱图。

图9：前体化合物C的高分辨质谱图。

图10：分子探针[

图11：前体化合物B和前体化合物C酶切的HPLC分析图。

图12：分子探针[

图13：分子探针[

图14：分子探针[

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1-1：一种靶向组织蛋白酶B的分子探针[

本实施例提供了一种靶向组织蛋白酶B的分子探针[

实施例1-2：一种制备靶向组织蛋白酶B的分子探针[

本实施例提供了实施例1所述靶向组织蛋白酶B的分子探针[

步骤一：用二氯甲烷(DCM)冲洗砂芯漏斗两次，冲洗结束后，抽干溶剂；在抽干的砂芯漏斗中加入2-氯三苯甲基氯树脂(负载量为1.19mmol/g，300mg)，并加入10mL的二氯甲烷浸泡溶胀2-氯三苯甲基氯树脂，浸泡溶胀10min后，抽干溶剂。

步骤二：向步骤一获得的砂芯漏斗中加入氨基酸Fmoc-(4-氨甲基)苯甲酸(0.5mmol)，并加入10mL的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解氨基酸，得到溶解液；在溶解液中加入DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)(155μL，0.75mmol)调节溶解液的pH至8后，将溶解液在25℃下振荡3h，振荡完成后，抽干溶剂；向抽干的砂芯漏斗中加入10mL DMF/CH

步骤三：在步骤二的基础上，将氨基酸Fmoc-(4-氨甲基)苯甲酸(0.5mmol)依次替换为氨基酸Fmoc-(4-氨甲基)苯甲酸(0.5mmol)、氨基酸Fmoc-甘氨酸(0.5mmol)、氨基酸Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸(0.5mmol)、氨基酸Fmoc-瓜氨酸(0.5mmol)、氨基酸Fmoc-缬氨酸(0.5mmol)，并重复步骤二的操作。

步骤四：称取乙酸酐1mL加入步骤三获得的砂芯漏斗中，并加入10mL的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)，得到溶解液；在溶解液中加入1mLDIPEA(N,N-二异丙基乙胺)调节溶解液的pH至8后，将溶解液在25℃下振荡5h，振荡完成后，抽干溶剂；向抽干的砂芯漏斗中加入10mLDMF/CH

步骤五：根据文献“Lin,Jianguo et al.Journal ofthe American ChemicalSociety.144,17(2022):7667-7675”合成化合物CBT-1；将化合物CBT-1(30mg,0.325mmol，1eq)、化合物CitV(1.1eq)和苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，1.15eq)溶于5mL无水四氢呋喃(THF)中，得到溶解液；在溶解液中加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，4eq)调节pH至8，得到混合物；将混合物在氮气的保护下，于室温(25℃)下搅拌(150rpm)3h后，使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到化合物Ⅰ-1(产率为82％)。

步骤六：将化合物Ⅰ-1(102mg，0.013mmol，1eq)溶于2mL二氯甲烷(DCM)中，得到溶解液；在溶解液加入80μL三异丙基硅烷(Tips)和2mL三氟乙酸(TFA)，得到混合物；将混合物于室温(25℃)下搅拌(150rpm)30min后，先使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，然后使用乙醚洗涤、沉淀，再除去上清，取下层化合物干燥，得到化合物Ⅰ-2(产率为61％)。

步骤七：将化合物Ⅰ-2(46mg，0.007mmol，1eq)溶于4mL甲醇(MeOH)中，得到溶解液；在溶解液加入80μL三异丙基硅烷(Tips)和18μL 2-(ethyldisulfanyl)pyridine(SEt，0.675mmol)，得到混合物；将混合物于室温(25℃)下搅拌(150rpm)2h后，先使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，然后使用冷(4℃)乙醚洗涤3次，得到化合物Ⅰ-3(产率为85％)。

步骤八：将化合物Ⅰ-3(18mg，0.006mmol)与羟基琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸(NOTA-NHS，0.009mmol)溶于2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到溶解液；在溶解液中加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，4eq)调节pH至8，得到混合物；将混合物在氮气的保护下，于室温(25℃)下搅拌(150rpm)2h后，先使用半制备型高效液相进行纯化，再冷冻干燥，得到前体化合物A(10mg，白色粉末)。前体化合物A的高分辨质谱图见图2。前体化合物A的分子量为1373，纯度大于95％。前体化合物A具有如下所示结构：

步骤九：使用0.05M HCl从

实验例1-1：靶向组织蛋白酶B的分子探针的体外稳定性实验

本实验例提供了靶向组织蛋白酶B的分子探针的体外稳定性实验，具体过程如下：

实验一：将实施例1-2制得的靶向组织蛋白酶B的分子探针[

实验二：将实施例1-2制得的靶向组织蛋白酶B的分子探针[

由图3可知，当孵育时间增加至4小时，靶向组织蛋白酶B的分子探针[

实验例1-2：靶向组织蛋白酶B的分子探针的脂水分配系数实验

参照文献“Lin J,Gao D,Wang S,et al.J Am Chem Soc.2022；144(17):7667-7675.”检测实施例1-2制得的靶向组织蛋白酶B的分子探针[

实验测得靶向组织蛋白酶B的分子探针[

实验例1-3：靶向组织蛋白酶B的分子探针的酶切实验

本实验例提供了靶向组织蛋白酶B的分子探针的酶切实验，具体过程如下：

以含5mM二硫苏糖醇(DTT)的浓度为25mM、pH为5.5的吗啉乙磺酸(MES)缓冲液为活化缓冲液，以浓度为25mM、pH为5.0的吗啉乙磺酸(MES)缓冲液为分析缓冲液；在活化缓冲液中加入组织蛋白酶B(10U/mL)后，于37℃下孵育2小时激活组织蛋白酶B，得到活化组织蛋白酶B；将活化组织蛋白酶B加入分析缓冲液至浓度为1U/mL，得到活化组织蛋白酶B稀释液；将实施例1-2制得的分子探针[

由图4可知，前体化合物A的紫外吸收保留时间为14.5min，与硫醇类还原剂(TCEP)共孵育后，产生半保留时间为12.8min的还原产物A-R；接着与组织蛋白酶B共孵育后，又产生一个保留时间为10.2min新峰，经HR-MS分析可知，该峰为环化产物A-C，可见，分子探针[

实验例1-4：组织蛋白酶B的细胞表达实验

本实验例提供了组织蛋白酶B的细胞表达实验，具体过程如下：

将U87、A549、A375、MDA-MB-231、PC-3、HeLa和HCT116细胞(购自中国科学院细胞库)分别以每孔6×10

结果如图5所示，在U87和A549细胞中，组织蛋白酶B高表达；在HCT116和MDA-MB-231细胞中，组织蛋白酶B中表达；而在HeLa、A375和PC-3细胞中，组织蛋白酶B低表达。说明U87、HCT116和PC-3细胞可分别作为组织蛋白酶B高表达、中表达和低表达的细胞进行分子探针后续的靶向性实验。

实验例1-5：靶向组织蛋白酶B的分子探针的细胞摄取实验

本实验例提供了靶向组织蛋白酶B的分子探针的细胞摄取实验，具体过程如下：

将U87、HCT116和PC-3细胞分别以每管1×10

如图5显示，U87细胞对分子探针[

实验例1-6：靶向组织蛋白酶B的分子探针的荷瘤鼠PET显像实验

本实验例提供了靶向组织蛋白酶B的分子探针的荷瘤鼠PET显像实验，具体过程如下：

将U87、HCT116和PC-3细胞分别按照5×10

如图6所示，PET动态扫描显示，U87肿瘤在1小时内明显可见，其摄取迅速增加并在注射30分钟后达到最大值4.12±0.82％ID/mL。1小时内肿瘤肌肉比(T/M)始终大于2。此外，HCT116肿瘤的摄取从15分钟的3.13±0.59％ID/mL到60分钟的2.72±0.63％ID/mL。然而，PC-3肿瘤在整个PET扫描过程中几乎不可见，其摄取与肌肉一样低。T/M持续较低，在60分钟内保持在1.02±0.16。由于组织蛋白酶B的高表达，U87肿瘤中[

实验例1-7：靶向组织蛋白酶B的分子探针的体内生物分布实验

本实验例提供了靶向组织蛋白酶B的分子探针的体内生物分布实验，具体过程如下：

将U87、HCT116和PC-3细胞分别按照5×10

如图7所示，分子探针[

实验例1-8：靶向组织蛋白酶B的分子探针的放射性自显影分析实验

本实验例提供了靶向组织蛋白酶B的分子探针的放射性自显影分析实验，具体过程如下：

取实验例1-6中PET显像的U87、HCT116、PC-3荷瘤鼠，将荷瘤鼠经异氟烷麻醉后安乐死并解剖；解剖后，取荷瘤鼠的肿瘤组织和肌肉组织分别浸泡于组织包埋剂(购自无锡市江原实业技贸总公司)中，在-20℃下冷冻；冷冻结束后，使用病理切片机将肿瘤组织和肌肉组织切片(30μm)，载于载玻片上；待载玻片上的肿瘤组织和肌肉组织自然风干后，测量组织样本放射性活度，使用磷屏成像系统对其曝光2小时，图像结果使用OptiQuant软件进行分析处理；以肌肉组织片为阴性对照，对肿瘤组织切片进行放射自显影分析，分析结果见图7。

由图7可知，分子探针[

实施例2-1：一种靶向组织蛋白酶B的分子探针[

本实施例提供了一种靶向组织蛋白酶B的分子探针[

实施例2-2：一种制备靶向组织蛋白酶B的分子探针[

本实施例提供了实施例1所述靶向组织蛋白酶B的分子探针[

在实施例1-2的基础上，将乙酸酐替换为吗啉-4-基乙酸(0.5mmol)，得到化合物CitV-M；在实施例1-2的基础上，将化合物CitV(1.1eq)替换为化合物CitV-M(1.1eq)，得到化合物Ⅱ-1(产率为72％)、化合物Ⅱ-2(产率为61％)、化合物Ⅱ-3(产率为75％)、得到前体化合物B(8mg，白色粉末)和分子探针[

实施例3-1：一种靶向组织蛋白酶B的分子探针[

本实施例提供了一种靶向组织蛋白酶B的分子探针[

实施例3-2：一种制备靶向组织蛋白酶B的分子探针[

本实施例提供了实施例1所述靶向组织蛋白酶B的分子探针[

在实施例1-2的基础上，将氨基酸Fmoc-(4-氨甲基)苯甲酸(0.5mmol)依次替换为Fmoc-(4-氨甲基)苯甲酸(0.5mmol)、Fmoc-甘氨酸(0.5mmol)、Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸(0.5mmol)、Fmoc-瓜氨酸(0.5mmol)、Fmoc-缬氨酸(0.5mmol)、Fmoc-L-谷氨酸-5-叔丁酯(0.5mmol)、N-Fmoc-N-三苯甲基-L-组氨酸(0.5mmol)、Fmoc-L-谷氨酸-5-叔丁酯(0.5mmol)、N-Fmoc-N-三苯甲基-L-组氨酸(0.5mmol)、Fmoc-L-谷氨酸-5-叔丁酯(0.5mmol)、N-Fmoc-N-三苯甲基-L-组氨酸(0.5mmol)，并重复其步骤二的操作，将乙酸酐替换为吗啉-4-基乙酸(0.5mmol)，得到化合物CitV-HEM；在实施例1-2的基础上，将化合物CitV(1.1eq)替换为化合物CitV-HEM(1.1eq)，得到化合物Ⅲ-1(产率为65％)、化合物Ⅲ-2(产率为58％)、化合物Ⅲ-3(产率为77％)、得到前体化合物C(10mg，白色粉末)和分子探针[

实验例2-1：靶向组织蛋白酶B的分子探针的体外稳定性实验

本实验例提供了靶向组织蛋白酶B的分子探针的体外稳定性实验，具体过程如下：

参照实验例1-1的方法进行靶向组织蛋白酶B的分子探针[

由图10可知，当孵育时间增加至4小时，靶向组织蛋白酶B的分子探针[

实验例2-2：靶向组织蛋白酶B的分子探针的酶切实验

本实验例提供了靶向组织蛋白酶B的分子探针的酶切实验，具体过程如下：

参照实验例1-3的方法进行靶向组织蛋白酶B的分子探针[

由图11可知，前体化合物B的紫外吸收保留时间为13.4min，与TCEP共孵育后，产生半保留时间为11.9min的还原产物B-R；接着与组织蛋白酶B共孵育后，又产生一个保留时间为10.2min新峰，经HR-MS分析可知，该峰为环化产物B-C；前体化合物C的紫外吸收保留时间为11.8min，与TCEP共孵育后，产生半保留时间为10.5min的还原产物C-R；接着与组织蛋白酶B共孵育后，又产生一个保留时间为10.2min新峰，经HR-MS分析可知，该峰为环化产物C-C。可见，分子探针[

实验例2-3：靶向组织蛋白酶B的分子探针的细胞摄取实验

本实验例提供了靶向组织蛋白酶B的分子探针的细胞摄取实验，具体过程如下：

参照实验例1-5的方法进行靶向组织蛋白酶B的分子探针[

如图12显示，U87细胞对[

实验例2-4：靶向组织蛋白酶B的分子探针的荷瘤鼠PET显像实验

本实验例提供了靶向组织蛋白酶B的分子探针的荷瘤鼠PET显像实验，具体过程如下：

参照实验例1-6的方法进行靶向组织蛋白酶B的分子探针[

如图13所示，U87肿瘤在1小时内明显可见，其摄取迅速增加并在注射40min后并达到最大值3.78±0.69％ID/mL。1小时内肿瘤肌肉比(T/M)始终大于2。此外，HCT116肿瘤的摄取的增长幅度相对缓慢，然而，PC-3肿瘤在整个PET扫描过程中几乎不可见，其摄取与肌肉一样低。T/M持续较低，在60分钟内保持在1左右。因此，此结果证明了[

如图14所示，U87肿瘤在1小时内明显可见，其摄取迅速增加并在注射60min后并达到最大值5.84±1.56％ID/mL。1小时内肿瘤肌肉比(T/M)始终大于2。此外，HCT116肿瘤的摄取的增长幅度相对缓慢，然而，PC-3肿瘤在整个PET扫描过程中几乎不可见，其摄取与肌肉一样低。T/M持续较低，在60分钟内保持在1.33±0.16。因此，此结果证明了[

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。