柔性分子印迹葡萄糖传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种柔性分子印迹葡萄糖传感器及其制备方法和应用。

背景技术

可穿戴柔性葡萄糖传感器的研发使得通过汗液进行血糖的无创检测成为了可能，对于糖尿病的防治具有重要的意义。基于葡萄氧化酶制备的酶基柔性葡萄糖传感器灵敏度高，特异选择性强，但是葡萄糖氧化酶容易受到pH、温度等外界环境的影响而失活，保质期短，稳定性不足。使用可催化葡萄糖氧化的金属材料制备无酶葡萄糖传感器，可以增强葡萄糖传感器的稳定性，然而其存在对催化底物选择性低、容易氧化中毒失活等问题。

分子印迹技术将葡萄糖和功能单体在电极表面聚合形成分子印迹聚合膜，洗脱葡萄糖后得到具有与葡萄糖形状、大小和功能团互补的分子印迹空穴，制得的分子印迹葡萄糖传感器兼具特异选择性和稳定性。分子印迹葡萄糖传感器主要通过差分脉冲伏安法或者线性伏安扫描法，检测不同浓度葡萄糖存在时传感器的氧化还原电流的变化，从而实现对葡萄糖的检测。但是传统的分子印迹聚合物导电性较差，传感器的分子印迹聚合膜形成后，会阻碍电极与电解质之间的电子传递，极大地降低传感器的氧化还原电流。葡萄糖模板洗脱后形成的分子印迹空穴虽然可以为电子的传递提供通道，但是分子印迹空穴数量有限，而且单一的电子传递通道容易在电极界面造成堵塞，导致分子印迹传感器的氧化还原电流较弱，检测灵敏度较低。因此，有必要研制一种具有高的氧化还原电流及检测灵敏度的分子印迹葡萄糖传感器。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种柔性分子印迹葡萄糖传感器的制备方法，本发明的第二个目的在于提供该制备方法制得的柔性分子印迹葡萄糖传感器，本发明的第三个目的在于提供该柔性分子印迹葡萄糖传感器的应用。

根据本发明的第一个方面，提供了一种柔性分子印迹葡萄糖传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)将石墨烯海绵粉碎后加入壳聚糖溶液中，得到壳聚糖-石墨烯海绵溶液，取壳聚糖-石墨烯海绵溶液均匀涂布于碳三电极上，室温干燥后，重复涂布一次，得到修饰了壳聚糖-石墨烯海绵的碳三电极；

(2)将步骤(1)制得的修饰了壳聚糖-石墨烯海绵的碳三电极置于普鲁士蓝沉积液中进行电化学沉积，然后将碳三电极取出，用水冲洗后室温干燥，干燥后重复电化学沉积两次，得到修饰了壳聚糖-石墨烯海绵和沉积了普鲁士蓝的碳三电极；

(3)将步骤(2)制得的修饰了壳聚糖-石墨烯海绵和沉积了普鲁士蓝的碳三电极置于分子印迹聚合膜电化学聚合液中进行电化学聚合，然后将碳三电极取出，用水冲洗后室温干燥，得到电化学聚合分子印迹聚合膜后的碳三电极；

(4)将步骤(3)制得的电化学聚合分子印迹聚合膜后的碳三电极置于洗脱液中搅拌振荡，然后取出，用水冲洗，室温干燥，得到柔性分子印迹葡萄糖传感器。

本发明在碳三电极工作区域上通过滴加法修饰壳聚糖-石墨烯海绵，显著提高碳三电极的氧化还原电流。使用电化学沉积法，在修饰了壳聚糖-石墨烯海绵的碳三电极工作区域上电化学沉积普鲁士蓝，进一步提高碳三电极的氧化还原电流。在修饰了壳聚糖-石墨烯海绵和沉积了普鲁士蓝的碳三电极上，使用3-氨基苯硼酸和吡咯作为功能单体，葡萄糖作为模板，电化学聚合形成分子印迹聚合膜。电化学聚合形成含葡萄糖模板的分子印迹聚合膜后，阻碍了电极与电解质之间的电子传递，极大地降低了传感器的氧化还原电流。将分子印迹聚合膜上的葡萄糖洗脱后，形成对葡萄糖具有特异识别能力的分子印迹空穴，为电极与电解质之间的电子传递提供通道，传感器氧化还原电流得以大部分恢复。

本发明的柔性分子印迹葡萄糖传感器用于葡萄糖的检测时，分子印迹空穴与待测溶液中的葡萄糖特异性结合后，会关闭电极与电解质之间的电子传递通道，降低传感器的氧化还原电流。溶液中的葡萄糖含量越高，关闭的电子传递通道越多，传感器的氧化还原电流下降越明显。通过检测氧化还原电流的下降幅度，从而实现对待测溶液中葡萄糖含量的检测。

在一些实施方式中，步骤(1)中，壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度为1-3wt％，石墨烯海绵的质量与壳聚糖溶液的体积比为5mg：1mL。壳聚糖浓度的变化会影响石墨烯海绵的含量，从而导致传感器的电子传递发生变化，影响检测性能。

在一些实施方式中，步骤(1)中，碳三电极为丝网印刷碳三电极，其基底材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯，工作电极为碳电极，对电极为碳电极，参比电极为Ag/AgCl电极。

在一些实施方式中，步骤(2)中，普鲁士蓝沉积液中含有0.1mol/L HCl、0.1mol/LKCl、3mmol/L K

在一些实施方式中，步骤(3)中，分子印迹聚合膜电化学聚合液为含有12mmol/L3-氨基苯硼酸、36mmol/L吡咯和5mmol/L葡萄糖的磷酸盐缓冲液，pH为6.5。

在一些实施方式中，步骤(2)中，使用循环伏安法进行电化学沉积，以50mV/s的扫描速度，从-0.2至0.6V扫描10圈。

在一些实施方式中，步骤(3)中，使用循环伏安法进行电化学聚合，以50mV/s的扫描速度，从-0.2至0.6V扫描15圈。

在一些实施方式中，步骤(4)中，洗脱液的配制方法为：将水、甲醇和乙酸按照体积比为50:35:15混合得到的。

在一些实施方式中，步骤(4)中，搅拌振荡的搅拌速率为150-250rpm，时间为10-15min。

根据本发明的第二个方面，提供了上述的制备方法制得的柔性分子印迹葡萄糖传感器。

根据本发明的第三个方面，提供了上述的柔性分子印迹葡萄糖传感器在制备葡萄糖检测仪器中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

(1)本发明使用以聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)作为基底材料的碳三电极制备分子印迹葡萄糖传感器，制得的传感器具有柔韧性，可弯曲贴合于皮肤，适合用于可穿戴葡萄糖传感器的制备。

(2)石墨烯海绵具有相互交联的三维多孔网络结构，拥有比表面积大、孔隙率高、吸附性强、导电性好等优点。普鲁士蓝是一种优良的电子传递媒介，具有强催化氧化还原性能。本发明使用无毒的壳聚糖-石墨烯海绵修饰柔性丝网印刷碳三电极，并在其上电化学沉积普鲁士蓝，大幅增强了分子印迹空穴与碳电极之间的电子传递效率和电子传导能力，增大了传感器的氧化还原电流，提高了传感器检测葡萄糖的灵敏度。

(3)本发明使用3-氨基苯硼酸和吡咯共同作为分子印迹聚合膜的功能单体，与模板分子葡萄糖共同电化学聚合形成分子印迹聚合膜，将模板分子葡萄糖洗脱后得到分子印迹空穴。由于3-氨基苯硼酸对葡萄糖具有强亲和性，吡咯电化学聚合形成致密的聚吡咯，因此有利于形成与葡萄糖三维结构互补的分子印迹空穴，提高了分子印迹空穴对葡萄糖的亲和力，降低了其他具有邻二羟基结构的物质的非特异性吸附的干扰，实现了对葡萄糖分子的双重识别。

(4)丝网印刷制备柔性碳三电极具有一致性好、成本低廉、易于大规模生产等优点，但是在柔性碳三电极上制备分子印迹葡萄糖传感器对于工艺条件有较高的要求。在对碳三电极进行壳聚糖-石墨烯海绵修饰干燥过程中，壳聚糖-石墨烯海绵容易出现局部聚集，导致后续普鲁士蓝沉积过程中出现局部过度集中的问题。对碳三电极进行普鲁士蓝的电化学沉积过程中，如果沉积圈数过少，传感器的氧化还原电流不够强而且容易衰退；如果沉积圈数过多，修饰的普鲁士蓝层容易脱落。对碳三电极进行分子印迹聚合过程中，如果聚合圈数过少，形成的分子印迹聚合膜过薄，难以起到好的封闭效果；如果聚合圈数过多，葡萄糖分子被深埋于分子印迹聚合膜中，难以洗脱形成分子印迹空穴。对碳三电极进行模板葡萄糖分子洗脱过程中，如果洗脱时间过短，葡萄糖分子不能顺利洗脱；如果洗脱时间过长，则会对分子印迹聚合膜和碳三电极的绝缘层造成破坏，损坏传感器。本发明通过二次修饰法使得壳聚糖-石墨烯海绵在碳三电极上实现均匀分布；通过三次电化学沉积法得到适合的普鲁士蓝沉积层；通过合适的聚合圈数和洗脱时间解决了上述问题。

(5)本发明制得的柔性分子印迹葡萄糖传感器安全无毒，灵敏度高，性能稳定，成本低廉。

附图说明

图1为实施例1制得的柔性分子印迹葡萄糖传感器与皮肤贴合的效果图。

图2为壳聚糖-石墨烯海绵和普鲁士蓝对碳三电极氧化还原电流的影响结果。

图3为分子印迹聚合膜的电化学聚合和葡萄糖模板的洗脱对传感器氧化还原电流的影响结果。

图4为实施例1制得的柔性分子印迹葡萄糖传感器对不同浓度葡萄糖的差分脉冲伏安法检测结果。

图5为实施例1制得的柔性分子印迹葡萄糖传感器检测葡萄糖的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细的说明，值得说明的是，以下实施例只是为了更好地解释本发明的内容，并不对本发明保护的范围做限制。实施例中未公开的工艺步骤为现有技术。若无特殊说明，以下原料均为市购。

实施例1

本实施例的柔性分子印迹葡萄糖传感器的制备方法，包括以下步骤：

1.丝网印刷碳三电极的准备

本实施例使用的丝网印刷碳三电极(长40毫米，宽14毫米，厚0.28毫米)是从深圳市灏阳科技有限公司定制的，其使用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)作为基底材料，使用碳作为工作电极(圆形，直径5毫米)和对电极(圆弧形，宽2毫米)，使用Ag/AgCl(80/20)作为参比电极(短弧形，宽2毫米)。

2.壳聚糖-石墨烯海绵的修饰

(1)将1克壳聚糖溶于100毫升浓度为2wt％的冰醋酸溶液中，以500rpm磁力搅拌至透明，充分溶解，得到浓度为1wt％的壳聚糖溶液。

(2)将市购的石墨烯海绵(购自江苏先丰纳米材料科技有限公司)研磨粉碎，得到石墨烯海绵粉末。称量5毫克石墨烯海绵粉末，加入1mL步骤(1)制得的壳聚糖溶液中，得到5mg/mL的壳聚糖-石墨烯海绵溶液。

(3)取2.5μL步骤(2)制得的壳聚糖-石墨烯海绵溶液均匀涂布于丝网印刷碳三电极的工作区域(注：工作区域指的是工作电极中间区域直径4毫米的圆形的导电碳材料区域)，室温干燥，干燥后在丝网印刷碳三电极的工作区域重复涂布2.5μL步骤(2)制得的壳聚糖-石墨烯海绵溶液，通过二次涂布修饰，使得壳聚糖-石墨烯海绵能均匀分布于丝网印刷碳三电极的工作区域表面，得到修饰了壳聚糖-石墨烯海绵的碳三电极。

3.普鲁士蓝的电化学沉积

配制含0.1mol/L HCl、0.1mol/L KCl、3mmol/L K

4.分子印迹聚合膜的电化学聚合

配制含12mmol/L 3-氨基苯硼酸、36mmol/L吡咯和5mmol/L葡萄糖的磷酸盐缓冲液(pH＝6.5)作为分子印迹聚合膜电化学聚合液，用于分子印迹聚合膜的电化学聚合。将步骤3制得的修饰了壳聚糖-石墨烯海绵和沉积了普鲁士蓝的碳三电极置于100mL分子印迹聚合膜电化学聚合液中，使用循环伏安法进行电化学聚合，以50mV/s的扫描速度，从-0.2V至0.6V扫描15圈。然后将碳三电极取出，用超纯水小心冲洗，室温干燥，得到电化学聚合分子印迹聚合膜后的碳三电极。

5.葡萄糖模板的洗脱

按照超纯水：甲醇：乙酸的体积比为50:35:15将超纯水、甲醇、乙酸混合均匀，配制洗脱液。将步骤4制得的电化学聚合分子印迹聚合膜后的碳三电极置于100mL洗脱液中，以200rpm的转速搅拌振荡10分钟后取出，用超纯水小心冲洗，室温干燥，得到有分子印迹空穴的柔性分子印迹葡萄糖传感器。

本实施例制得的柔性分子印迹葡萄糖传感器与皮肤贴合的效果图如图1所示，从图1中可以看出，本发明制得的柔性分子印迹葡萄糖传感器具有柔韧性，可弯曲，可贴合于皮肤。

对比例1

本对比例直接以丝网印刷碳三电极作为传感器，所用丝网印刷碳三电极与实施例1的相同。

对比例2

本对比例以修饰了壳聚糖-石墨烯海绵的碳三电极作为传感器，所用修饰了壳聚糖-石墨烯海绵的碳三电极的制备方法与实施例1的相同。

对比例3

本对比例以修饰了壳聚糖-石墨烯海绵和沉积了普鲁士蓝的碳三电极作为传感器，所用修饰了壳聚糖-石墨烯海绵和沉积了普鲁士蓝的碳三电极的制备方法与实施例1的相同。

对比例4

本对比例以电化学聚合分子印迹聚合膜后的碳三电极作为传感器，所用电化学聚合分子印迹聚合膜后的碳三电极的制备方法与实施例1的相同。

为探究壳聚糖-石墨烯海绵的修饰、普鲁士蓝的电化学沉积、分子印迹聚合膜的电化学聚合和葡萄糖模板的洗脱对传感器氧化还原电流的影响，将实施例1及对比例1-4的传感器分别置于含0.1mol/L氯化钾、5mmol/L铁氰化钾、5mmol/L亚铁氰化钾的溶液中，使用循环伏安法测试其氧化还原电流，以50mV/s的扫描速度，从-0.55V至0.8V扫描。

壳聚糖-石墨烯海绵和普鲁士蓝对碳三电极氧化还原电流的影响如图2所示，图中，bare为对比例1的传感器，GS为对比例2的传感器，GS/PB为对比例3的传感器。

从图2中可以看出，对比例2的传感器的氧化还原电流整体上高于对比例1，对比例3的传感器的氧化还原电流整体上高于对比例2。表明壳聚糖-石墨烯海绵的修饰可以显著提高碳三电极在含0.1mol/L氯化钾、5mmol/L铁氰化钾、5mmol/L亚铁氰化钾的溶液中的氧化还原电流，普鲁士蓝的电化学沉积可以进一步提高碳三电极在含0.1mol/L氯化钾、5mmol/L铁氰化钾、5mmol/L亚铁氰化钾的溶液中的氧化还原电流。

分子印迹聚合膜的电化学聚合和葡萄糖模板的洗脱对传感器氧化还原电流的影响如图3所示，图中，GS/PB为对比例3的传感器，MIP为对比例4的传感器，extracted为实施例1的传感器。

从图3中可以看出，对比例4的传感器的氧化还原电流整体上低于对比例3，实施例1的传感器的氧化还原电流整体上高于对比例4，且与对比例3的相近。这是因为：电化学聚合形成含葡萄糖模板的分子印迹聚合膜后，阻碍了电极与电解质之间的电子传递，因而极大地降低了传感器在含0.1mol/L氯化钾、5mmol/L铁氰化钾、5mmol/L亚铁氰化钾的溶液中的氧化还原电流。洗脱分子印迹聚合膜上的葡萄糖模板后，分子印迹聚合膜上形成了分子印迹空穴，为电极与电解质之间的电子传递提供了通道，因此传感器在含0.1mol/L氯化钾、5mmol/L铁氰化钾、5mmol/L亚铁氰化钾的溶液中的氧化还原电流得到了大部分恢复。

为探究本发明的柔性分子印迹葡萄糖传感器对葡萄糖的检测灵敏度，将实施例1制得的柔性分子印迹葡萄糖传感器用于葡萄糖的检测。

分别配制含有0.1mol/L氯化钾的葡萄糖浓度分别为0、50、100、200、400、600μmol/L的pH为6.5的磷酸盐缓冲液，将实施例1制得的柔性分子印迹葡萄糖传感器分别置于磷酸盐缓冲液中浸泡吸附葡萄糖10分钟后使用差分脉冲伏安法检测电流峰，参数设置为起始电位-0.2V，终止电位0.5V，阶跃高度为4mV，脉冲高度为50mV，阶跃宽度400ms，脉冲宽度100ms，取样宽度20ms。

柔性分子印迹葡萄糖传感器对不同浓度葡萄糖的差分脉冲伏安法检测结果如图4所示。

根据图4的检测结果，将传感器在葡萄糖浓度为0μmol/L时的峰电流值减去在不同浓度的葡萄糖溶液中测得的峰电流值，得到峰电流值差(ΔI)。该峰电流值差与葡萄糖浓度的自然对数线性相关，得到对应的标准曲线。

柔性分子印迹葡萄糖传感器检测葡萄糖的标准曲线如图5所示。从图5可以看出，传感器的峰电流值差(ΔI)与葡萄糖浓度的自然对数线性相关(>0.99)，标准曲线为y＝3.2414x-6.6489(R

得到柔性分子印迹葡萄糖传感器检测葡萄糖的标准曲线后，通过差分脉冲伏安法检测待测溶液中的电流值，换算得到待测溶液中的葡萄糖含量。

以上所述的仅是本发明的一些具体实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造性构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。