智能反应型的多模态成像及增效放疗纳米粒的制备方法

技术领域

本发明涉及纳米粒制备技术领域，具体涉及智能反应型的多模态成像及增效放疗纳米粒的制备方法。

背景技术

放疗通常是通过电离辐射(通常为伽马射线，X射线、α离子等)引起遗传物质损伤，从而引起DNA的破坏杀伤肿瘤细胞。电离辐射引起遗传物质损伤有两个方面，一是高能的电离辐射可以直接打断DNA，造成双链断裂；二是产生活性氧，活性氧对DNA进行亲核攻击，更多的是造成DNA单链断裂，如果两条链上的断裂点很近，可能就会造成双链断裂。其中，双链断裂的杀伤性最大，遗传物质损伤，如果DNA修复跟不上，那细胞就会进入凋亡等死亡途径。此外，细胞内的氧气可进一步与断裂的DNA作用，产生稳定的有机过氧化物，提高放疗疗效。研究发现放疗的疗效主要受三个因素影响：一、肿瘤乏氧的程度；二、肿瘤细胞放疗后6-7周内增殖的能力；三、肿瘤细胞自身对放疗敏感性及耐受性。其中，肿瘤的乏氧程度是最关键的影响因素，当肿瘤微环境乏氧时，它会诱导血管生成因子、化学趋化肿瘤因子、致癌因子及其他促使肿瘤转移的因素的产生，增加肿瘤侵袭力及远处转移机会，严重影响放疗效果。因此，亟需研发一种能够催化肿瘤细胞自发性的生产氧气，实现氧气“自补充”的纳米粒，解决由乏氧引起的放疗耐受的问题。

发明内容

本发明意在提供智能反应型的多模态成像及增效放疗纳米粒的制备方法，以实现氧气的“自补充”，改变肿瘤内部的乏氧微环境，从而解决了由乏氧引起的肿瘤细胞放疗耐受的问题，同时利用硫化铋自身的高X射线衰减系数，达到协同增效放疗的效果。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：智能反应型的多模态成像及增效放疗纳米粒，包括PLGA外壳，PLGA外壳内包裹有过氧化氢酶，PLGA外壳上交联有硫化铋。

智能反应型的多模态成像及增效放疗纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

S1：将PLGA与硫化铋溶解于二氯甲烷中，得体系I；

S2：将过氧化氢酶溶解于水中，并添加到体系I中得体系II；

S3：将体系II进行声震处理；

S4：向声震后的体系II中加入异丙醇溶液并搅拌，而后离心洗涤得BS-PLGA@Cat纳米粒。

本方案的原理及优点是：肿瘤细胞中的ROS水平明显高于正常细胞，而过氧化氢(H

本发明BS-PLGA@Cat纳米粒的制备方法通过简单、易操作和实验重复性强的双乳化法就制得内部包载Bi

优选的，作为一种改进，PLGA、硫化铋、过氧化氢酶的质量比为50-80:2-4:5-7，纳米粒呈球形，粒径为242.00±33.99nm，表面电位为-(7.79±5.3)mV。

本技术方案中，通过对制备而成的BS-PLGA@Cat纳米粒进行表征检测，通过激光粒度仪及电位仪检测其粒径与表面电位分别为242.00±33.99nm和-(7.79±5.3)mV；通过扫描电镜、透射电镜观察其形态、表面形貌，BS-PLGA@Cat纳米粒呈球形，粒径较均一，分布均匀。

优选的，作为一种改进，纳米粒10min内催化H

本技术方案中，通过对BS-PLGA@Cat纳米粒进行氧释放实验，验证了其氧气产生释放量随着反应时间的延长而逐渐增加，BS-PLGA@Cat纳米粒10min内催化H

优选的，作为一种改进，S1中，硫化铋的浓度为10mg/L。

本技术方案中，利用上述浓度的硫化铋，能够使制备而成的纳米粒具备良好的增效放疗和多模态成像的效果。

优选的，作为一种改进，S3中，声震处理包括一次声震和二次声震。

本技术方案中，在制备纳米粒的过程中，创新性的采用了双次声震的方式，一次声震主要是使纳米粒成球，初步形成纳米粒的形态；二次声震中达到稳定纳米粒粒径的目的，使纳米粒的粒径均一。

优选的，作为一种改进，一次声震的条件为65W、3min。

本技术方案中，在一次声震的过程中，采用的是相对较低的声震功率和相对较短的声震时间，一方面能够避免高功率声震产热对纳米粒的稳定性造成不利影响，另一方面也能够降低纳米粒因震动产生的机械损伤，对纳米粒的机械破坏小，使制备而成的纳米粒结构完整。

优选的，作为一种改进，二次声震前，向体系II内加入PVA溶液；二次声震的条件为39W、2.5min。

本技术方案中，在二次声震前，加入PVA溶液，能够提高体系的稳定性，使得制备而成的纳米粒分散性更好，且能够在一定程度上避免久放成团问题。二次声震时，采用的也是相对较低的声震功率和相对较短的声震时间，一方面能够避免高功率声震产热对纳米粒的稳定性造成不利影响，另一方面也能够降低纳米粒因震动产生的机械损伤，对纳米粒的机械破坏小，使制备而成的纳米粒结构完整。

优选的，作为一种改进，S4中，搅拌方式为磁力搅拌，搅拌时间为2h。

本技术方案中，搅拌的主要目的是使二氯甲烷充分挥发，使得制备而成的纳米粒生物安全性更高，避免对实验动物肝肾功能破坏。搅拌时间过短会使二氯甲烷挥发不充分，搅拌时间过长会对纳米粒造成较大的机械损伤，容易破坏纳米粒结构的完整性。

优选的，作为一种改进，S4中，离心洗涤的条件为12000r、5min。

本技术方案中，离心洗涤转速过高会破坏纳米粒，而转速过低会使体系内存在较大粒径的纳米粒，本方案通过对离心洗涤条件的优化，能够保证纳米粒粒径的均一性。

附图说明

图1为本发明实施例中的BS-PLGA@Cat纳米粒扫描电镜图。

图2为本发明实施例中BS-PLGA@Cat纳米粒中Cat含量曲线图。

图3为本发明实施例中体外氧气释放曲线图。

图4为本发明实施例中模拟体内环境溶氧曲线图。

图5为本发明实施例中BS-PLGA@Cat纳米粒体外CT成像曲线图。

图6为本发明实施例中BS-PLGA@Cat纳米粒体外光声成像曲线图。

图7为本发明实施例中BS-PLGA@Cat纳米粒体外增效放疗数据图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例一

智能反应型的多模态成像及增效放疗纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

S1：将50mg高分子聚合材料PLGA与200μL、10mg/L的硫化铋充分溶解于二氯甲烷中，得体系I；

S2：将5mg过氧化氢酶溶解于200μL水中，并添加到体系I中得体系II；

S3：将体系II进行声震处理，本实施例中的声震处理包括一次声震和二次声震，一次声震的条件为65W、3min；一次声震后向体系II内加入8mL、5％的PVA溶液进行二次声震，二次声震的条件为39W、2.5min；

S4：向声震后的体系II中加入10mL异丙醇溶液，磁力搅拌2h，而后用高速离心机在12000r下离心洗涤5min得BS-PLGA@Cat纳米粒。

经检测，本发明的制备方法制备而成的纳米粒包封率为87.34±0.3％，载药量为0.0378±0.0001，产品性质稳定。

一、BS-PLGA@Cat纳米粒表征检测

用激光粒度仪与电位仪检测BS-PLGA@Cat纳米粒的粒径及表面电位分别为242.00±33.99nm和-(7.79±5.3)mV；通过扫描电镜、透射电镜观察其形态、表面形貌，如图1所示，BS-PLGA@Cat纳米粒呈球形，粒径较均一，分布均匀。

二、Cat含量检测

利用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测BS-PLGA@Cat纳米粒中Cat的吸光值，并计算Cat含量，结果如图2所示，随着BS-PLGA@Cat纳米粒中Cat浓度增加，相对应的吸光值也逐渐增加，呈线性相关。

三、氧释放实验

将BS-PLGA@Cat纳米粒及BS-PLGA纳米粒各稀释为2mg/mL。将H

结果如表1及图3所示，BS-PLGA纳米粒和完全对照组均没有氧气释放，水中含氧量非常低，而BS-PLGA@Cat纳米粒处理H

表1氧释放实验结果(结果表示为平均数)

四、溶氧实验

肿瘤细胞内有高浓度H

结果如表2及图4所示，BS-PLGA@Cat纳米粒及BS-PLGA纳米粒被乳腺癌4T1细胞吞噬，BS-PLGA@Cat能分解肿瘤微环境中高浓度的H

表2溶氧实验结果(结果表示为平均数)

五、体外CT成像

将不同浓度的BS-PLGA@Cat纳米粒多功能分子探针分别放入2.0mL密封EP管内，振荡摇匀后固定于带孔塑料板上，进行CT扫描,应用软件测量各管中溶液的CT值。

结果如图5所示：BS-PLGA@Cat纳米粒具备CT成像能力，随着Bi

六、体外光声成像

将BS-PLGA@Cat纳米粒稀释后置于凝胶孔洞模型，置于光声成像仪中。调制光声成像仪，使激光发射中心与声学信号接收部件处于同一水平。以一定波长的激光激发，记录光声信号，采集光声成像图，与不含光吸收子的普通高分子显像剂对照。光声成像结果显示，激光发射过程中，即使不断提高激发激光能量，不含Bi

结果如图6所示：BS-PLGA@Cat纳米粒有较强的光声信号；并且随着Bi

七、体外增效放疗

将对数生长期的乳腺癌4T1细胞分为6组：

1、BS-PLGA@Cat+放疗；2、Cat-PLGA+放疗；3、BS-PLGA+放疗；4、BS-PLGA@Cat；5、单纯放疗；6、对照组。其中Cat-PLGA纳米粒以及BS-PLGA纳米粒的制备方法时在BS-PLGA@Cat纳米粒的制备方法基础上稍作调整即可。对照组是细胞培养后不进行辐照处理；单纯放疗组是细胞经过培养之后，不添加纳米粒进行辐照处理。

将各组纳米粒用培养液分别稀释为0.5mg/mL，1mg/mL，2mg/mL。用稀释的溶液替换之前培养液，继续共培养6h。然后放射辐照(8Gy)，继续孵育6-12h。将cck8溶液及培养液以1:10的比例配比，分别加入96孔板中，100μL/孔，用酶标仪读数，每个处理组均进行三次重复实验，结果表示为mean±SD。

结果如图7所示：BS-PLGA@Cat+放疗组乳腺癌4T1细胞存活率最低，增效放疗效果最好，随着BS-PLGA@Cat浓度逐渐增加，细胞存活率逐渐最低，放疗效果逐渐增加；Cat-PLGA+放疗组及BS-PLGA+放疗组细胞存活率也降低，具备增效放疗的作用；Cat-PLGA+放疗组细胞存活率低于BS-PLGA+放疗组，说明Cat-PLGA+放疗组增效放疗效果强于BS-PLGA+放疗组，但二者效果均低于BS-PLGA@Cat+放疗组。空白对照组及BS-PLGA@Cat组细胞存活率几乎没有影响，没有增效放疗作用。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。