一种聚多曲霉菌BTBU20213012及其代谢化合物和应用

技术领域

本发明涉及微生物代谢技术领域，具体涉及一种聚多曲霉菌BTBU20213012及其代谢化合物和应用。

背景技术

聚多曲霉(Aspergillus sydowii)，又名喜多式曲霉，属于散囊菌目发菌科曲霉属的一种真菌，可生长在土壤、粪、酒曲、食品、望远镜筒内壁及各种材料的基物上。微生物代谢中会产生丰富的代谢产物，包括初级代谢产物和次级代谢产物，次级代谢产物往往结构复杂，其中包括大量具有生物活性的化合物。通过微生物发酵获取活性物质的技术在发酵工程技术在食品、医药、精细化学品、生物能源、生物材料以及生物质资源化方面发挥着重要作用，对国民经济所作的贡献令人瞩目。目前，现有技术针对已发现的多种聚多曲霉的代谢产物进行研究，提取得到了不同功效的化合物成分，也使得聚多曲霉菌成为具有重要应用前景的微生物之一。因此，对新的聚多曲霉菌的发现以及对新的聚多曲霉菌代谢化合物的研究与提取是本领域研究的关键。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种聚多曲霉菌BTBU20213012及其代谢化合物和应用，所述聚多曲霉菌BTBU20213012经发酵培养、萃取、色谱柱分离，可制备得到抑制金黄色葡萄球菌的化合物，最低抑菌浓度为200μg/mL。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种聚多曲霉菌BTBU20213012，所述聚多曲霉菌BTBU20213012的保藏号为CGMCC NO.40156。

本发明还提供了上述聚多曲霉菌BTBU20213012在制备具有抑制金黄色葡萄球菌的化合物中的应用。

本发明还提供了利用上述聚多曲霉菌BTBU20213012发酵制备抑制金黄色葡萄球菌的化合物的方法，包括如下步骤：

将所述聚多曲霉菌BTBU20213012接种到含大米的培养基上进行发酵培养，获得包括所述化合物的发酵产物，提取得到所述化合物。

优选的，所述发酵培养温度为25～32℃，发酵培养时间为10～30天。

优选的，所述提取方法包括如下步骤：

(1)发酵产物用乙酸乙酯-甲醇浸泡，抽滤后蒸干，再用乙酸乙酯-去离子水进行萃取，得到有机层继续蒸干，溶解到二氯甲烷-甲醇的混合溶剂中得到发酵粗提物；

(2)发酵粗提物依次采用体积比为50:50、30:70、20:80、5:95、2:98、0:100的正己烷-二氯甲烷、体积比为99:1、98:2、97:3、95:5、90:10、85:15、80:20的二氯甲烷-甲醇进行减压正相硅胶柱洗脱分离，得到A～M共13个组分；

(3)将组分L、J、K分别采用二氯甲烷-甲醇进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，分别得到L1～L11共11个组分、J1～J11共11个组分、K1～K9共9个组分；

(4)采用Agilent Eclipse XDB-C8反相色谱柱洗脱分离获得化合物，J6组分分离获得化合物I；L7组分分离获得化合物II；K6组分分离获得化合物III。

优选的，所述步骤(1)中，乙酸乙酯-甲醇体积比为4:1，乙酸乙酯-去离子水体积比为1:1；二氯甲烷-甲醇体积比为1:1。

优选的，所述步骤(3)中，二氯甲烷-甲醇体积比为2:1，等度洗脱；每个组分收集20mL。

优选的，所述步骤(4)中，Agilent Eclipse XDB-C8反相色谱柱规格为9.4×250mm，5μm；洗脱流速为3mL/min，流动相为水-乙腈的混合溶剂。

本发明还提供了上述方法制备得到的化合物，所述化合物为化合物I、化合物II或化合物III，所述化合物I、化合物II、化合物III的结构通式为：

本发明还提供了上述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗菌药物中的应用。

与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果：

本发明所述聚多曲霉菌BTBU20213012，经发酵培养、萃取、色谱柱分离，可制备得到抑制金黄色葡萄球菌的化合物，最低抑菌浓度为200μg/mL。

本发明提供了所述聚多曲霉菌BTBU20213012发酵制备抑制金黄色葡萄球菌化合物的方法，该制备方法设备要求低、操作简单、条件温和、易于产业化，得到的新的抑制金黄色葡萄球菌的化合物。

生物保藏信息：

本发明所述聚多曲霉菌Aspergillus sydowii BTBU20213012保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称为CGMCC；保藏编号为CGMCC NO.40156，保藏日期为2022年4月15日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。

附图说明

图1为化合物I、化合物II、化合物III的结构通式；

图2为聚多曲霉菌BTBU20213012菌落；

图3为聚多曲霉菌BTBU20213012的ITS基因序列系统发育树；

图4为化合物I高分辨质谱图；

图5为化合物I核磁共振氢谱图；

图6为化合物I核磁共振碳谱图；

图7为化合物II高分辨质谱图；

图8为化合物II核磁共振氢谱图；

图9为化合物II核磁共振碳谱图；

图10为化合物III高分辨质谱图；

图11为化合物III核磁共振氢谱图；

图12为化合物III核磁共振碳谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种聚多曲霉菌BTBU20213012，所述聚多曲霉菌BTBU20213012的保藏号为CGMCC NO.40156。

本发明所述聚多曲霉菌BTBU20213012分离自海泥样品，所述海泥采集于西太平洋海底(经度134°4′23.049"，纬度：13°33′46.315")，经麦芽提取物琼脂培养基(MEA)分离得到。

本发明还提供了所述聚多曲霉菌BTBU20213012在制备具有抑制金黄色葡萄球菌的化合物中的应用。

本发明还提供了所述聚多曲霉菌BTBU20213012发酵制备抑制金黄色葡萄球菌的化合物的方法，包括如下步骤：将所述聚多曲霉菌BTBU20213012接种到含大米的培养基上进行发酵培养，获得包括所述化合物的发酵产物，提取得到所述化合物。

本发明所述发酵培养温度为25～32℃，优选为27～30℃，更优选为28～29℃；发酵培养时间为10～30天，优选为14～26天，更优选为28～22天。本发明中所述的培养方式优选为恒温振荡培养，所述恒温振荡培养的转速优选为110～140rpm，所述恒温震荡培养优选的在摇床中进行。

本发明发现，利用大米培养基对所述聚多曲霉菌BTBU20213012进行发酵后，该菌株可产生一系列小分子代谢产物，包括具有抑制金黄色葡萄球菌作用的新的化合物。

本发明所述提取方法包括如下步骤：

(1)发酵产物用乙酸乙酯-甲醇浸泡，抽滤后蒸干，再用乙酸乙酯-去离子水进行萃取，得到有机层继续蒸干，溶解到二氯甲烷-甲醇的混合溶剂中得到发酵粗提物；

(2)发酵粗提物依次采用体积比为50:50、30:70、20:80、5:95、2:98、0:100的正己烷-二氯甲烷、体积比为99:1、98:2、97:3、95:5、90:10、85:15、80:20的二氯甲烷-甲醇进行减压正相硅胶柱洗脱分离，得到A～M共13个组分；

(3)将组分L、J、K分别采用二氯甲烷-甲醇进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，分别得到L1～L11共11个组分、J1～J11共11个组分、K1～K9共9个组分；

(4)采用Agilent Eclipse XDB-C8反相色谱柱洗脱分离获得化合物，J6组分分离获得化合物I；L7组分分离获得化合物II；K6组分分离获得化合物III。

在本发明中，所述发酵产物用乙酸乙酯-甲醇浸泡过夜，所述乙酸乙酯-甲醇体积比为4:1。发酵液浸泡后进行抽滤，然后蒸干，蒸干后的产物溶于乙酸乙酯-去离子水中进行萃取，所述乙酸乙酯-去离子水体积比为1:1，萃取得到有机层继续进行蒸干；所述萃取次数优选为重复萃取1～3次；萃取得到的有机层物质溶解于二氯甲烷-甲醇中得到发酵粗提物；所述二氯甲烷-甲醇体积比为1:1。所述蒸干设备优选为旋转蒸发仪。

本发明以重量比为发酵粗提物：柱层析硅胶＝1：1.5拌样品，依次采用体积比为50:50、30:70、20:80、5:95、2:98、0:100的正己烷-二氯甲烷、体积比为99:1、98:2、97:3、95:5、90:10、85:15、80:20的二氯甲烷-甲醇，对应得到A～M(依次为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M)共13个组分。所述柱层析硅胶优选为100～200目；所述减压正相硅胶柱洗脱分离流速不限定，采用常规流速即可，每组洗脱液用量为500mL。其中组分L为二氯甲烷-甲醇体积比为85:15时洗脱收集得到；组分J为二氯甲烷-甲醇体积比为95:5时洗脱收集得到；组分K为二氯甲烷-甲醇体积比为90:10时洗脱收集得到。

本发明将收集得到的组分L、J、K分别采用二氯甲烷-甲醇进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，分别得到L1～L11共11个组分、J1～J11共11个组分、K1～K9共9个组分。所述各组收集的组分优选为使用薄层色谱分析合并；所述洗脱方式为等度洗脱，所述二氯甲烷-甲醇体积比优选为2:1；所述流速不限定，采用常规流速即可；每个组分收集20mL。其中，L组收集洗脱流份为L7组，为洗脱得到的第120～140mL的流份；J组收集洗脱流份为J6组，为洗脱得到的第100～120mL的流份；K组收集洗脱流份为K6组，为洗脱得到的第100～120mL的流份。

本发明分别将J6组分、L7组分、K6组分进行HPLC制备，然后分别采用AgilentEclipse XDB-C8反相色谱柱(9.4×250mm，5μm)分离获得化合物I、化合物II和化合物III，流动相为水-乙腈的混合溶剂，流速为3mL/min。

化合物I洗脱程序为：20％乙腈等度洗脱10min，20％～30％乙腈梯度洗脱2min，30％等度洗脱8min，30％～40％乙腈线性梯度洗脱2min，40％乙腈等度洗脱13min，40％～100％乙腈线性梯度洗脱5min，保留时间为32.7分钟的组分即为化合物I。

化合物II洗脱程序为：10％～20％乙腈梯度洗脱10min，20％乙腈等度洗脱5min，20％～35％乙腈线性梯度洗脱15min，35％～100％乙腈线性梯度洗脱5min，保留时间为24.5分钟的组分即为化合物II。

化合物III洗脱程序为：20％～30％乙腈梯度洗脱6min，30％～40％乙腈线性梯度洗脱19min，40％～100％乙腈线性梯度洗脱5min，保留时间为15.2分钟的组分即为化合物III。

本发明依次通过高分辨质谱(HRESIMS)、核磁共振氢谱和核磁共振碳谱得到化合物I、化合物II和化合物III的结构式，详见图1。

本发明还提供了上述方法制备得到的化合物，所述化合物为上述化合物I、化合物II或化合物III，所述化合物均对于金黄色葡萄球菌具有显著的抑制作用。其中化合物I对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为200μg/mL、化合物II对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为200μg/mL，化合物III对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为400μg/mL。

本发明还提供了上述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗菌药物中的应用，所述抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌的药物。

在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明具体实施例中麦芽提取物琼脂培养基(MEA，每升培养基)：麦芽浸粉(malt extract)30.0g，蛋白胨(peptone)5.0g，琼脂(agar)15.0g，pH 6.0。大米培养基：150g大米加入120mL蒸馏水。

实施例1

聚多曲霉菌BTBU20213012的分离筛选：

(1)配置MEA培养基，培养基灭菌放置不烫手背时(温度约为40℃左右)，同时加入氯霉素和链霉素至终浓度为0.2mg/mL(提前配制好，用0.22μm微孔滤膜过滤，-20℃存储)，混匀后倒平板，用于抑制细菌生长。

(2)采集西太平洋海底的海泥(经度134°4′23.049"，纬度：13°33′46.315")。称取10g泥土，加入100mL无菌水，浸泡10分钟，震摇使其分散开。取200μL的悬液(2个稀释度10

实施例2

聚多曲霉菌BTBU20213012的鉴定：

聚多曲霉菌BTBU20213012在MEA平皿培养基上28℃恒温培养7天后，观察其菌落特征，菌落颜色呈现墨绿色，并有数圈白色稀疏菌丝，菌落呈圆形扩散，最外圈无白色菌丝，边缘整齐，质地紧密，绒毛状，菌落与培养基之间的连接较为紧密，详见图2。

从生长7天的培养皿上用接种针切取约1cm

PCR扩增体系(50μL)：10×Buffer 5μL，2.5mM dNTP 5μL，25mM MgCl

经鉴定，菌株BTBU20213012与模式菌株Aspergillus sydowii CBS 593.65(AB267812)的ITS基因序列最为相似，其相似度为99.80％，将菌株BTBU20213012鉴定为聚多曲霉菌，命名为聚多曲霉菌BTBU20213012，根据ITS基因序列进行构建系统发育树，详见图3。

实施例3

聚多曲霉菌BTBU20213012发酵制备抑制金黄色葡萄球菌的化合物的方法：

(1)将聚多曲霉菌BTBU20213012接种到大米培养基上进行发酵培养，摇床恒温振荡培养，转速为120rpm，发酵培养温度为28℃，发酵培养时间为15天。

(2)发酵产物用乙酸乙酯-甲醇(4:1，V/V)浸泡过夜，抽滤后采用旋转蒸发仪蒸干，再用乙酸乙酯-去离子水(1:1，V/V)进行萃取，萃取三次后得到有机层继续蒸干，溶解到二氯甲烷-甲醇的混合溶剂(1:1，V/V)中得到发酵粗提物。

(3)以重量比为发酵粗提物：柱层析硅胶(200目)＝1：1.5拌样品，依次采用正己烷-二氯甲烷(体积比分别为：50:50、30:70、20:80、5:95、2:98、0:100)、二氯甲烷-甲醇(体积比分别为：99:1、98:2、97:3、95:5、90:10、85:15、80:20)进行减压正相硅胶柱分离，每组洗脱液用量为500mL，每组洗脱液对应得到A～M(依次为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M)共13个组分，其中组分L为二氯甲烷-甲醇体积比为85:15时洗脱收集得到；组分J为二氯甲烷-甲醇体积比为95:5时洗脱收集得到；组分K为二氯甲烷-甲醇体积比为90:10时洗脱收集得到。

(4)将组分L、J、K分别采用二氯甲烷-甲醇(2:1，V/V)进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，等度洗脱；每个组分收集20mL。其中，L组收集洗脱流份为L7组，为洗脱得到的第120～140mL的流份；J组收集洗脱流份为J6组，为洗脱得到的第100～120mL的流份；K组收集洗脱流份为K6组，为洗脱得到的第100～120mL的流份。

(5)J6组分、L7组分、K6组分进行HPLC制备，然后分别采用Agilent Eclipse XDB-C8反相色谱柱(9.4×250mm，5μm)分离获得化合物I、化合物II和化合物III，流动相为水-乙腈的混合溶剂，流速为3mL/min。

化合物I洗脱程序为：20％乙腈等度洗脱10min，20％～30％乙腈梯度洗脱2min，30％等度洗脱8min，30％～40％乙腈线性梯度洗脱2min，40％乙腈等度洗脱13min，40％～100％乙腈线性梯度洗脱5min，保留时间为32.7分钟的组分即为化合物I。

化合物II洗脱程序为：10％～20％乙腈梯度洗脱10min，20％乙腈等度洗脱5min，20％～35％乙腈线性梯度洗脱15min，35％～100％乙腈线性梯度洗脱5min，保留时间为24.5分钟的组分即为化合物II。

化合物III洗脱程序为：20％～30％乙腈梯度洗脱6min，30％～40％乙腈线性梯度洗脱19min，40％～100％乙腈线性梯度洗脱5min，保留时间为15.2分钟的组分即为化合物III。

实施例4

聚多曲霉菌BTBU20213012发酵制备抑制金黄色葡萄球菌的化合物的方法：

(1)将聚多曲霉菌BTBU20213012接种到大米培养基上进行发酵培养，摇床恒温振荡培养，转速为120rpm，发酵培养温度为30℃，发酵培养时间为20天。

(2)发酵产物用乙酸乙酯-甲醇(4:1，V/V)浸泡过夜，抽滤后采用旋转蒸发仪蒸干，再用乙酸乙酯-去离子水(1:1，V/V)进行萃取，萃取三次后得到有机层继续蒸干，溶解到二氯甲烷-甲醇的混合溶剂(1:1，V/V)中得到发酵粗提物。

(3)以重量比为发酵粗提物：柱层析硅胶(200目)＝1：1.5拌样品，依次采用正己烷-二氯甲烷(体积比分别为：50:50、30:70、20:80、5:95、2:98、0:100)、二氯甲烷-甲醇(体积比分别为：99:1、98:2、97:3、95:5、90:10、85:15、80:20)进行减压正相硅胶柱分离，每组洗脱液用量为500mL，每组洗脱液对应得到A～M(依次为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M)共13个组分，其中组分L为二氯甲烷-甲醇体积比为85:15时洗脱收集得到；组分J为二氯甲烷-甲醇体积比为95:5时洗脱收集得到；组分K为二氯甲烷-甲醇体积比为90:10时洗脱收集得到。

(4)将组分L、J、K分别采用二氯甲烷-甲醇(2:1，V/V)进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，等度洗脱；每个组分收集20mL。其中，L组收集洗脱流份为L7组，为洗脱得到的第120～140mL的流份；J组收集洗脱流份为J6组，为洗脱得到的第100～120mL的流份；K组收集洗脱流份为K6组，为洗脱得到的第100～120mL的流份。

(5)J6组分、L7组分、K6组分进行HPLC制备，然后分别采用Agilent Eclipse XDB-C8反相色谱柱(9.4×250mm，5μm)分离获得化合物I、化合物II和化合物III，流动相为水-乙腈的混合溶剂，流速为3mL/min。

化合物I洗脱程序为：20％乙腈等度洗脱10min，20％～30％乙腈梯度洗脱2min，30％等度洗脱8min，30％～40％乙腈线性梯度洗脱2min，40％乙腈等度洗脱13min，40％～100％乙腈线性梯度洗脱5min，保留时间为32.7分钟的组分即为化合物I。

化合物II洗脱程序为：10％～20％乙腈梯度洗脱10min，20％乙腈等度洗脱5min，20％～35％乙腈线性梯度洗脱15min，35％～100％乙腈线性梯度洗脱5min，保留时间为24.5分钟的组分即为化合物II。

化合物III洗脱程序为：20％～30％乙腈梯度洗脱6min，30％～40％乙腈线性梯度洗脱19min，40％～100％乙腈线性梯度洗脱5min，保留时间为15.2分钟的组分即为化合物III。

分别对提取得到的化合物I进行高分辨质谱、核磁共振氢谱和核磁共振碳谱测定，化合物I的高分辨质谱(HRESIMS)显示其准分子离子峰为m/z251.1653，详见图4；核磁共振氢谱(500MHz,CDCl

分别对提取得到的化合物II进行高分辨质谱、核磁共振氢谱和核磁共振碳谱测定，化合物II的高分辨质谱(HRESIMS)显示其准分子离子峰为m/z265.1444，详见图7；核磁共振氢谱(500MHz,CD

分别对提取得到的化合物III进行高分辨质谱、核磁共振氢谱和核磁共振碳谱测定，化合物III的高分辨质谱(HRESIMS)显示其准分子离子峰为m/z265.1443，详见图10；核磁共振氢谱(500MHz,CD

实施例5

采用96孔板微量稀释法对实施例3～4得到的化合物抑菌浓度进行测试：

(1)测试病原菌：金黄色葡萄球菌(S.aureus)，LB固体培养。

(2)化合物与阳性对照配置：用二甲基亚砜将待测化合物浓度配制为4mg/mL，阳性对照甲氧西林(methicillin)用DMSO配置成0.2mg/mL的溶液。

(3)实验操作：

将MHB液体培养基灭菌备用，用接种环在LB固体培养基上挑取一个菌落大小约1mm的新鲜单菌落于1mL的MHB液体培养基中，涡旋2min，震荡均匀；取10mL的MHB培养基于50mL的无菌离心管中，加入10μL涡旋后的菌液，再次涡旋2min，使菌液均匀后倒入无菌的移液槽中。

将96孔细胞培养板的各孔均加入80μL菌液，每个培养板均设阳性对照与阴性对照，即在第一行的1孔内加入3.2μL的阳性对照(最大浓度为4μg/mL)，另一孔加入8μL的DMSO作为阴性对照，剩余孔中加入8μL浓度为4mg/mL的待测化合物，随后将第一行用相应的菌液补齐，使其总体积至160μL，抽吸混匀后，用排枪从第1行中吸取80μL溶液置于第2行，抽吸混匀，依次梯度稀释至第8行，使待测化合物在浓度为800μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL，培养板用封口膜封好。培养金黄色葡萄球菌的96孔培养板，均37℃恒温培养箱中培养，培养16～18h后肉眼观察菌液是否澄清，菌液澄清孔相对应化合物的浓度即为其最低抑菌浓度。

分别对化合物I、化合物II、化合物III的抑菌效果进行测定，三者的最低抑菌浓度见表1。

表1化合物I、化合物II、化合物III的最低抑菌浓度

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。