一种柘木组培苗继代培养方法

技术领域

本发明属于植物培植领域，涉及一种植物组织培养的方法，具体涉及一种柘木组培苗继代培养方法，属于生物技术领域。

背景技术

柘木(学名：Cudrania tricuspidata)，又名桑柘木，属桑科植物，广泛分布于我国华东、中南、西南至河北南部，为我国历史上著名名贵木料，大多历史文献都有记载。其木材细致，光滑沉重，材质坚硬，抗压强度大，抗腐性、耐磨性高；韧皮纤维为优质造纸原料；柘树的根、树皮或根皮、茎叶、果实等均可入药，具有祛风利湿、活血通经、止咳化痰之功效，可治疗风湿关节疼痛、黄疸、淋浊、闭经、跌打损伤以及疔疮痈肿等症，近年来又用于治疗食管癌、胃癌、肠癌等消化系统肿瘤；柘树药材中的主要化学成分为黄酮类、酮类化合物，但其资源有限。实现柘木资源的可持续性利用，建立柘木的高效快繁体系，实现柘木种苗大规模快速繁殖，并且能保持柘木品种的优良特性，是目前急需解决的问题。

上海雷允上科技发展有限公司、上海市中药研究所共同提出一种柘木提取物、其制备及应用，专利号CN101375937A。完善柘木提取物的制备方法工艺，健全工艺指标，制得的柘木提取物及其各类制剂活性成分可控，抗肿瘤效果显著，为打开柘木的广阔应用市场提供了技术支持。

伽蓝(集团)股份有限公司的发明专利——柘木提取物及其应用，专利号CN104758197A，所述柘木提取物具有很好的美白和抗衰老的功效，可用于化妆品、保健食品和医药领域，尤其是可应用于化妆品中

青岛农业大学提出了一种柘木硬枝扦插的繁育方法，申请号CN201911325077.5，提供一种柘木硬枝扦插的繁育方法，但是扦插需要大量的枝条，切受季节的限制，快繁的效率有限。

柘木具有广泛的应用价值，具有很高的经济价值。但是其自然资源有限，如果不能人工大量繁殖，资源必将枯竭。目前还未见柘木组织培养的报道。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中柘木无法大规模人工繁殖的缺陷，利用组织培养技术进行柘木增殖扩繁的问题，快速繁殖优良品种的柘木。利用此项技术，可以大规模快速繁殖柘木种苗，并且能保持品种的优良特性，繁育不受季节限制。

本发明是通过如下技术方案实现上述目的的，一种柘木组培苗继代培养方法，包括如下步骤：

1)外植体的选择:选择健壮的柘木幼苗，用带腋芽的茎段作为外植体；

2)外植体的消毒:采用自来水和消毒剂对外植体进行消毒，消毒后晾干接种于启动培养基上；

3)启动培养：将处理好的外植体，在超净工作台上接种于启动培养基上(培养基ZS01)，每只试管接入1个外植体茎段。培养28天后，即可得无菌苗。

4)增殖/继代培养：取无菌苗的顶芽，基部芽丛，以及茎段用于继代增殖。本发明方法增殖系数可达1：4-4.5，株高3.5cm左右。成活率合格率>98％。

优选的，所述增殖/继代培养中的培养基为由下述成分组成水体系：

六水合氯化钴(0.025mg/L)；五水硫酸铜(0.25mg/L)；EDTA钠铁盐(36.7mg/L)；硼酸(6.3mg/L)；碘化钾(0.83mg/L)；一水合硫酸锰(16.9mg/L)；二水合钼酸钠(0.25mg/L)；七水合硫酸锌(8.2mg/L)；二水合氯化钙(330mg/L)；磷酸二氢钾(255mg/L)；硝酸钾(825mg/L)；七水合硫酸镁(370mg/L)；硝酸铵(309mg/L)；盐酸硫胺素(0.4mg/L)；肌醇(100mg/L)；烟酸(0.5mg/L)；盐酸吡多辛(0.5mg/L)；甘氨酸(2mg/L)；蔗糖(30g/L)；植物琼脂(5g/L)；6-BA(6-苄氨基嘌呤)(0.1-0.5mg/L)；IBA(0-0.1mg/L)(吲哚丁酸)。进一步优选为6-BA(6-苄氨基嘌呤)(0.3mg/L)；IBA(0.05mg/L)(吲哚丁酸)。

优选的，所述启动培养基为由下述成分组成水体系：

六水合氯化钴0.025mg/L；五水硫酸铜0.25mg/L；EDTA钠铁盐36.7mg/L；硼酸6.3mg/L；碘化钾0.83mg/L；一水合硫酸锰16.9mg/L；二水合钼酸钠0.25mg/L；七水合硫酸锌8.2mg/L；二水合氯化钙330mg/L；磷酸二氢钾255mg/L；硝酸钾825mg/L；七水合硫酸镁370mg/L；硝酸铵309mg/L；0.4mg/L盐酸硫胺素；100mg/L肌醇；0.5mg/L烟酸；0.5mg/L盐酸吡多辛；2mg/L甘氨酸；30g/L蔗糖；5g/L植物琼脂；3mg/L6-BA(6-苄氨基嘌呤)；0.1mg/LNAA(萘乙酸)

优选的，所述外植体的消毒过程中采用自来水和消毒剂对外植体进行消毒，消毒后晾干接种于启动培养基上的具体步骤为：先用自来水冲洗外植体5-8min，把表面冲洗干净；将茎段切成2-3cm的小段，用容器盛放再冲洗一遍；用70％的酒精浸泡1min，转移到超净工作台内，然后用3％的次氯酸钠溶液浸泡10min，最后用0.15％的无菌柠檬酸水浸洗3遍，晾干后接种于启动培养基上。

优选的，所述启动培养步骤的培养的条件为：温度：25±3℃；光照强度：1500±300lux；光照培养14h/暗培养10h。

优选的，所述增殖/继代培养中无菌苗的顶芽取1.0-1.5cm，基部丛芽取0.5-0.8cm，茎段0.8-1.2cm至少带2个芽点，接种于增殖培养基上。培养条件为，温度：25±3℃；光照强度：1500±300lux；光照培养16h/暗培养8h，培养45天后，即可得用于继代的组培苗或用于生根的生根苗。

本发明提供了一种操作简单、成本低廉、成活率高的柘木组培苗的继代培养方法，从而大规模快速繁殖柘木种苗，为柘木人工种植提供充足的种苗，从技术上为柘木的市场需求提供资源保障。

本发明的培养周期短，增殖系数高，成活率高，节约成本，适合柘木的大规模工厂化育苗。本发明采用的培养基配方，直接使用有机物的高纯度化学试剂，避免了前述研究中直接使用生物组织液的情况(部分植物品种组培培养基配方中，直接使用土豆、椰汁、香蕉等等植物组织器官，利用它们含有的维生素等复杂不确定的成分，达到培养需求。但这样使用的实践证明，在实际讲究效率、质量的工厂化生产中，会带来不稳定性)，降低了成分不确定性的风险，更有利于实际生产的管控。

附图说明

图1为本发明柘木组培苗继代培养的流程图。

具体实施方式

一、按如下方法进行柘木组培苗继代培养(方法A)：

外植体的选择:选择健壮的柘木两年生幼苗，用带腋芽的茎段作为外植体；

外植体的消毒:先用自来水冲洗外植体5-8min，把表面冲洗干净；将茎段切成2-3cm的小段，用容器盛放再冲洗一遍；用70％的酒精浸泡1min，转移到超净工作台内，然后用3％的次氯酸钠溶液浸泡10min，最后用0.15％的无菌柠檬酸水浸洗3遍，晾干后接种于启动培养基上。

启动培养：将处理好的外植体，在超净工作台上接种于启动培养基上(培养基ZS01)，每只试管接入1个外植体茎段。培养28天后，即可得无菌苗。温度：25±3℃；光照强度：1500±300lux；光照培养14h/暗培养10h。

增殖培养(继代培养)：无菌苗的顶芽，基部芽丛，以及茎段都可以用于继代增殖。顶芽取1.0-1.5cm，基部丛芽取0.5-0.8cm，茎段0.8-1.2cm至少带2个芽点，接种于增殖培养基上(培养基ZS02)。温度：25±3℃；光照强度：1500±300lux；光照培养16h/暗培养8h，培养45天后，即可得用于继代的组培苗或用于生根的生根苗。一般增殖系数可达1：4-4.5，株高3.5cm左右。成活率合格率>98％

二、培养基的迭代研发

各培养基配方如下：

1.基础培养基成分配方(命名为ZS)：

2.启动培养基(ZS01)

ZS基础上添加：0.4mg/L盐酸硫胺素+100mg/L肌醇+0.5mg/L烟酸+0.5mg/L盐酸吡多辛+2mg/L甘氨酸+30g/L蔗糖+5g/L植物琼脂+3mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0.1mg/L NAA(萘乙酸)

3.增殖/继代培养基(ZS02)

ZS基础上添加：0.4mg/L盐酸硫胺素+100mg/L肌醇+0.5mg/L烟酸+0.5mg/L盐酸吡多辛+2mg/L甘氨酸+30g/L蔗糖+5g/L植物琼脂+0.3mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0.05mg/LIBA(吲哚丁酸)

基础培养基(ZS培养基)，是在MS培养基无机盐部分的基础上进行的改良。改良的部分见表1：

表1基础培养基的改良

申请人在基础培养上的创新，传统的基础培养基没有达到预期的效果；根据以往的研发经验逻辑进行了元素的调整。一方面效果提升，一方面节约生产成本。

三、增殖/继代培养基(ZS02)成分对柘木组培苗继代培养的生长状况的影响：

增殖/继代培养基(ZS02)激素实验水平，细胞分裂素使用6-BA0.1mg/L-0.5mg/L；生长素使用NAA0-0.2mg/L和IBA0-0.1mg/L，其因素水平设计表如表2所示：

表2增殖/继代培养基(ZS02)激素实验水平

按照上述的培养方法(方法A)，改变增殖/继代培养基(ZS02)成分比例对柘木增殖/继代培养正交实验，各处理结果如下表3(以顶芽生长状况做分析)：

表3增殖/继代培养基(ZS02)成分对柘木组培苗继代培养的生长状况的影响

注：增殖系数是指切割接种的符合要求的单株(按要求切取的顶芽、茎段或丛芽中的小芽株)，在完成一次继代培养后，从最初那个单株的培养结果上，能切取出符合要求的有效单株的数量。

最终选择处理：0.3mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA；继代培养基平均增殖系数为4.5。

4.增殖培养(继代培养)阶段中接种部位和培养周期的影响

按照上述柘木组培苗继代培养的方法(方法A)，分别采用启动培养阶段后得到的无菌苗的顶芽、茎段和基部芽丛作为增殖培养(继代培养)，如表4所示：

表4增殖培养(继代培养)阶段中接种部位和培养周期的影响

实验结果表明，各部位接种后的苗况都较好，故在工厂化生产中，各部位都可接种。40天后生长已经很缓慢，50天后几乎不再生长，故45天的增殖周期为最适。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。