用于治疗骨损伤的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求提交于2018年9月17日的美国临时申请号62/732,534和提交于2019年5月9日的美国临时申请号62/845,500的提交日的权益。这些在先提交的申请的全部内容据此以引用方式并入。

背景技术

仅在美国每年就发生了平均790万例骨折，其中约5-10％的骨折导致延迟愈合、不愈合、亚临界大小的缺损或大的骨缺损，从而对外科医生造成了巨大的治疗挑战(Zura等人，JAMA Surg.2016年11月16日；151)。在普通群体中，骨折严重度、解剖位置、患者合并症，吸烟以及某些药物的使用可显著地导致骨折愈合问题(Zura等人，JAMA Surg.2016年11月16日；151)。胫骨、股骨或肱骨范围的不愈合的治疗成本介于每例31,500美元与34,400美元之间，这每年给医疗保健费用造成了巨大的负担(Kanakaris NK,GiannoudisPV.Injury.2007；38增刊2:S77 S84；和Wu等人，Orthopedic Research and Reviews.2013:521-33)。

此外，超过59,000名军事人员已经在伊拉克和阿富汗服役时在与战斗有关的行动中受伤，他们中的50％是包括大节段性骨缺损在内的肌肉骨骼损伤(Belmont Jr.PJ,McCriskin BJ,Sieg RN,Burks R,Schoenfeld AJ.Combat wounds in Iraq andAfghanistan from 2005to 2009.J Trauma Acute Care Surg.2012；73:3-12)。已据估计，在这些冲突中遭受的肌肉骨骼损伤中的78％主要是肢体损伤(Stansbury LG,Lalliss SJ,Branstetter JG,Bagg MR,Holcomb JB.Amputations in U.S.military personnel inthe current conflicts in Afghanistan and Iraq.J Orthop Trauma.2008；22:43-46)。此类骨损伤愈合不良，特别是那些与高冲击力爆炸伤有关的那些骨损伤，这是由于受污染的骨头和软组织破坏与局部组织血管减少的组合所致。即使在没有此类并发症的情况下，超过临界大小的骨缺损也没有内在愈合能力。患有大节段性骨缺损的患者的管理仍然是军事外科医生和民用外科医生所面临的最具挑战性的临床问题之一(Pollak AN,Ficke JR,Extremity War Injuries III Session Moderators.Extremity war injuries:challenges in definitive reconstruction.J Am Acad Orthop Surg.2008；16:628-34)。不能过分强调提高临床医生成功管理这些损伤的能力的重要性，因为这些破坏性损伤往往会导致延长的持续医疗过程，所述延长的持续医疗过程不可避免地是昂贵的，并且有很大的失败和最终截肢的风险。仅作为在伊拉克和阿富汗(OIF/OEF)的军事活动的结果，就有超过两千名士兵需要进行至少一次截肢(Fischer H.A Guide to U.S.MilitaryCasualty Statistics:Operation Freedom’s Sentinel,Operation Inherent Resolve,Operation New Dawn,Operation Iraqi Freedom,and Operation EnduringFreedom.Congr Res Serv.2015；7)。此外，持续的不愈合骨缺损与延迟返回工作或军职相关联，并对应降低了个人的生活质量。因此，显然存在未被满足的临床需求，这是开发更有效的治疗策略以解决这些潜在的灾难性损伤的有力动力。

发明内容

本文公开了离体血肿，所述离体血肿包含：(a)分离的全血；(b)柠檬酸钠；和(c)蛇静脉酶；oscutarin和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或者凝血酶和氯化钙；其中所述离体血肿包含厚度为至少150-300nm±10％的血纤蛋白纤维。

本文公开了离体血肿，所述离体血肿包含：(a)富血小板血浆、血浆或具有红血细胞的血浆；和(b)蛇静脉酶；oscutarin和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或者凝血酶和氯化钙；其中所述离体血肿包含厚度为至少150-300nm±10％的血纤蛋白纤维。

本文公开了用于构建植入物的方法，所述方法包括：a)将贮库植入物的尺寸确定为有助于将所述贮库植入物植入骨缺损中的形状和大小中的至少一者；以及b)通过如下方式来将所述贮库植入物结构化为具有支架：引入(i)分离的全血和柠檬酸钠，或富血小板血浆、血浆、或具有红血细胞的血浆；以及(ii)蛇静脉酶；oscutarin和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙以创建支架；其中所述支架的孔隙率为55％至75％。

在以下描述、附图和权利要求书中举例说明了本发明的组合物和方法的其他特征和优点。

附图说明

图1是描绘来自蛇毒液的促血栓形成剂对哺乳动物凝固级联的机制的示意图。

图2示出了大鼠骨折血肿的扫描电子显微镜图像：0.5mm(正常愈合的骨缺损；左图)和5mm(节段性骨缺损，其不能自发愈合，并且需要来自外科医生的干预；右图)骨缺损。标度＝1μm。

图3A至图3B示出了在手术后3天大鼠的0.5mm(A)和5mm(B)股骨缺损中的血肿形成。

图4-D示出了大鼠血凝块：天然凝块(A)、低蛇静脉酶浓度凝块(B)、中等蛇静脉酶浓度凝块(C)和高蛇静脉酶浓度凝块(D)。

图5A至图5B示出了添加0.5U/mL的蛇静脉酶后血凝块中的干细胞存活。图5A示出了不含干细胞的凝块。图5B示出了含有干细胞的凝块。自体荧光红血细胞(绿色)、细胞核(蓝色)、干细胞的细胞骨架(红色)。标尺＝50μm。

图6是大鼠股骨缺损模型的图示。白框表示供离体血肿、富血小板血浆(PRP)或BMP-2植入用的5mm缺损间隙。

图7示出了骨折血肿的扫描电子显微镜图像：0.5mm(左图像；正常骨折)和5mm(右图像；大骨缺损)。标度＝1μm。

图8示出了大鼠骨折血肿的扫描电子显微镜图像(顶部)，以及纤维直径、纤维密度和孔隙率的定量(底部)。

图9示出了描绘血纤蛋白纤维形貌的扫描电子显微镜图像。

图10示出了扫描电子显微镜图像，其描绘了使用蛇静脉酶和氯化钙的大鼠离体全血和富血小板血浆凝块。全血(WB)+0.1U/mL蛇静脉酶(左上方)。全血+0.5U/mL蛇静脉酶(顶部中心)。全血+10mM氯化钙(右上方)。富血小板血浆(PRP)+0.1U/mL蛇静脉酶(左上方)。富血小板血浆+0.5U/mL蛇静脉酶(底部中心)。富血小板血浆+10mM氯化钙(右下方)。

图11示出了大鼠离体血凝块微架构的扫描电子显微镜图像(顶部)，以及纤维直径、纤维密度和孔隙率的定量(底部)；平均值±SD，*p<0.05，**p<0.01，n＝3。

图12示出了在蛇毒液酶蛇静脉酶存在下大鼠MSC的细胞活力(2D，体外；*p＜0.05，n＝3)。

图13示出了在蛇毒液酶蛇静脉酶存在下组织培养物中的细胞活力(3D，体外)。

图14A至图14F示出了使用不同植入物的骨愈合。图14A示出了8周时的全血(WB)+0.1U/mL蛇静脉酶。图14B示出了8周时的富血小板血浆(PRP)+氯化钙。图14C示出了8周时的胶原蛋白支架+1.1μg BMP-2。图14D示出了8周时的全血+0.3U/mL蛇静脉酶+1.1μg BMP-2。图14E示出了8周时的全血+0.3U/mL蛇静脉酶+0.55μgBMP-2。图14F示出了4周时的全血+0.6U/mL蛇静脉酶+0.55μgBMP-2。

图15示出了放射线图像，其示出了治疗8周后大骨缺损的愈合。示出了每个研究组中两只不同动物的代表性图像。‘++’＝弥合的缺损；‘+’＝稍微延迟的愈合(剩余少量软骨)；‘-’＝不愈合。

具体实施方式

通过参考本发明的以下详细描述、附图和本文所包括的示例，可以更容易地理解本公开。

在公开和描述本发明的组合物和方法之前，应理解它们不限于特定的合成方法(除非另外指明)或特定的试剂(除非另外指明)，因此此类组合物和方法当然可以变化。另外应当了解，本文使用的术语只是为了描述特定方面的目的，并非旨在进行限制。尽管与本文中描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用于本发明的实践或检验，但现在描述示例性方法和材料。

此外，应当理解的是，除非另有明确说明，否则决不意味着在此阐述的任何方法都被解释为要求其步骤以特定次序执行。因此，在方法权利要求没有实际列举其步骤要遵循的次序的情况下，或者在权利要求书或说明书中没有以另外方式具体说明所述步骤被限制为特定的次序的情况下，在任何方面都绝不意味着可推断出次序。这适用于任何可能的非表达解释基础，包括关于步骤排列或操作流程的逻辑事项、从语法组织或标点中得到的明显含义，以及在说明书中所描述的各方面的数量或类型。

本文提到的所有出版物以引用的方式并入本文以公开和描述与引用出版物有关的方法和/或材料。提供本文中讨论的公布仅仅是针对它们在本申请的提交日期之前的公开。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明由于在先发明而无权早于此类公布。此外，本文所提供的公开日可能不同于实际的公开日，这可能需要单独确认。

如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外明确指出不是这样。

如本文所用的字词“或”表示特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。

贯穿本说明书的描述和权利要求书，字词“包括”和所述字词的变型诸如“包含”和“含有”意指“包括但不限于”并且不旨在排除例如其他添加物、部件、整数或步骤。具体地，在被叙述为包括一个或多个步骤或操作的方法中，特别考虑了每个步骤包括所列出的事物(除非该步骤包括限制性术语，诸如“由......组成”)，这意味着每个步骤并非旨在排除例如该步骤中未列出的其他添加物、组分、整数或步骤。

范围在本文中可表示为“约(about)”或“大约(approximately)”一个特定值和/或至“约”或“大约”另一特定值。当表达此类范围时，进一步的方面包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，在通过使用先行词“约”或“大约”将值表示为近似值时，应了解特定值形成进一步的方面。将进一步理解，每个范围的端值对于另一端值而言都是重要的，并且独立于另一端值。还应当理解，本文公开了许多值，并且每个值在本文中除作为该特定值本身被公开之外还作为“约”该特定值被公开。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应理解的是，还公开了在两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，那么也公开了11、12、13和14。

如本文所使用，术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的实例和不发生的实例。

如本文所用，术语“受试者”是指施用对象，例如人。因此，所公开方法的“受试者”可以为脊椎动物，诸如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。术语“受试者”还包括家养动物(例如，猫、犬等)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)和实验室动物(例如，小鼠、家兔、大鼠、豚鼠、果蝇等)。在一个方面中，受试者为哺乳动物。在另一个方面中，受试者为人。所述术语不表示特定的年龄或性别。因此，旨在涵盖成年、幼年、未成熟的和新生的受试者，以及胎儿，无论是雄性还是雌性。

如本文所用，术语“患者”是指患有疾病或病症或疾患的受试者。术语“患者”包括人和兽医受试者。在所公开的方法的一些方面中，“患者”例如在施用步骤之前已经被诊断出需要用于骨损伤愈合的治疗。

如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全缓解、改善、减轻特定疾病、病症和/或疾患；延迟特定疾病、病症和/或疾患的发作；抑制或减缓特定疾病、病症和/或疾患的进展；降低特定疾病、病症和/或疾患的严重性；以及/或者降低特定疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状或特征的发生率。可向未表现出疾病、病症和/或疾患迹象的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或疾患的早期迹象的受试者施用治疗，以降低发展出与所述疾病、病症和/或疾患相关的病理的风险。例如，疾病、病症和/或疾患可以是骨损伤或骨折。

目前治疗大节段性骨缺损的方法。已经采用了许多技术来治疗骨骼缺损，包括自体骨移植、各种骨移植替代物、Ilizarov方法、使用大型假体的关节置换术、生物制剂以及作为最后手段的截肢术。然而，这些现有的治疗选项在特征上需要涉及多个手术的长期治疗，是昂贵的，具有高并发症率，并且与巨大的治疗失败风险相关联。例如，自体移植仍然是当愈合大节段性骨缺损时的治疗首选(Khan SN,Cammisa FP,Sandhu HS,Diwan AD,Girardi FP,Lane JM.J Am Acad Orthop Surg.2005；13:77-86)。然而，足够的自体移植材料的供应可能受到限制，特别是在平民群体中严重外伤或骨折不愈合以及士兵严重受伤的情况下，并且与供体部位的显著发病率相关联。相比之下，尽管同种异体移植骨大量可得，但其使用增加了关于疾病传播和免疫应答的问题(Khan SN,Cammisa FP,Sandhu HS,DiwanAD,Girardi FP,Lane JM.J Am Acad Orthop Surg.2005；13:77-86)，但是更重要的是，它由不能很好地再吸收或重塑的死骨组成。它还已被证明在受负荷时会逐渐积累微裂缝，从而导致5年失败率达到30％或更高(Enneking WF,Campanacci DA.J Bone Joint SurgAm.2001；83-A:971-986；和Wheeler DL,Haynie JL,Berrey H,Scarborough M,EnnekingW.Biomed Sci Instrum.2001；37:251-256)。另外，还已经开发了各种骨替代物来辅助治疗大节段性骨缺损，但是这些途径仅限于结局的轻微改善。骨形成不足、机械和处理特性差、缺乏生物相容性、不可预测的再吸收以及相关联的炎症反应仍然是此类材料的主要限制(McKee MD.J Am Acad Orthop Surg.2006；14:S163-7)。出于这种原因，对于超过8cm的骨缺损，牵张骨生成仍是军事外科医生的首选治疗法。然而，该技术是麻烦、痛苦且不可靠的，伴有钉道感染，并且可愈合缓慢(Pollak AN,Ficke JR,J Am Acad Orthop Surg.2008；16:628-34)。最重要的是，大节段性骨缺损的可用治疗选项的主要并发症是它们无法确保功能的快速恢复和降低骨折率的能力。

对骨生成生物学的研究已导致发现了骨形态发生蛋白(BMP)，所述骨形态发生蛋白是最有效的成骨诱导剂中的一些(Urist MR。J Bone Miner Res.1997；12:343-6)。BMP家族的两个成员已获批准用于临床使用：重组人BMP-2(rhBMP-2；

近年来，富血小板血浆(PRP)、富含高浓度血小板的血浆已经在包括肌肉骨骼损伤治疗在内的一系列应用中进行了试验。PRP被认为在超生理浓度下会分泌多种生长因子和细胞因子，并生成呈血纤蛋白凝块形式的细胞支持基质。特别地，已经有人提出PRP促进骨愈合的作用(Iqbal J,Pepkowitz SH,Klapper E.Curr Osteoporos Rep.2011；9:258-263；和Kurikchy MQ,Al-Rawi NH,Ayoub RS,Mohammed SS.Clin Oral Investig.2013；17:897-904)是由于诸如血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、骨形态发生蛋白(BMP)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)等因子的浓度增加所致(Soffer E,Ouhayoun JP,Anagnostou F.Oral Surgery,Oral Medicine,Oral Pathology,Oral Radiology,andEndodontics.2003.第521-528页)。然而，来自在口腔和颌面部骨移植手术中使用PRP的实验(Simman R,Hoffmann A,Bohinc RJ,Peterson WC,Russ AJ.Ann Plast Surg.2008；61:337-44)和临床研究(Marx RE,Carlson ER,Eichstaedt RM,Schimmele SR,Strauss JE,Georgeff KR.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.1998；85:638-46)的结果是有争议的，并且迄今为止几乎没有证据表明它实际上改善或加速了骨愈合，事实上，在大多数情况下存在骨形成减少(Choi B-H,Im C-J,Huh J-Y,Suh J-J,Lee S-H.Int JOral Maxillofac Surg.2004；33:56–9；和Marden LJ,Fan RSP,Pierce GF,Reddi AH,Hollinger JO.J Clin Invest.1993；92:2897-2905)。这种明显的功效缺乏还延伸至长骨和脊柱。最近使用股骨干截骨术并随后使用牵张骨生成在绵羊中进行的研究未能证明PRP的施加会改善新骨形成(Hernandez-Fernandez A,Vélez R,Soldado F,Saenz-Ríos JC,Barber I,Aguirre-Canyadell M.Injury.2013；44:901-7)。同样，在啮齿动物研究中，PRP对骨愈合没有有益的作用(Pryor ME,Yang J,Polimeni G,Koo K,Hartman MJ,Gross H,etal.J Periodontol.2005；76:1287-1292；和Ranly DM,Lohmann CH,Andreacchio D,BoyanBD,Schwartz Z.J Bone Joint Surg Am.2007；89:139-147)或最多显示出低再生潜能(Sánchez AR，Sheridan PJ，Eckert SE，Weaver AL)。J Periodontol.2005；76:1637-1644)。在促进脊柱融合术后骨愈合的研究中，在动物(Li H，Zou X，Xue Q，Egund N，Lind M，BüngerC.Eur Spine J.2004；13：354-8)或人类受试者(Weiner BK,Walker M.Spine(Phila Pa1976).2003；28:1968-1970)中均无益处。这些研究中导致可变结局的因素是未知的，但已有人提出血小板中存在的蛋白酶可能降解生长因子(Thibault L,Beauséjour A,DeGrandmont MJ,Lemieux R,Leblanc JF.Transfusion.2006；46:1292-1299)，从而改变了PRP的组成并降低了其实验和临床效果。此外，PRP激活需要凝血酶，所述凝血酶导致生长因子的突发释放和总生长因子浓度的降低。牛凝血酶通过刺激抗凝血酶的抗体来干扰人类凝固蛋白，这被认为会影响愈合过程(Oryan A,Alidadi S,Moshiri Expert Opin BiolTher.2016；16:213-32)。这也可能与PRP无法形成具有适当结构特性的凝块有关。

基于PRP的不良性能，法国颌面外科医生Joseph Choukroun开发了“第二代”血小板浓缩物，称为富血小板血纤蛋白(PRF)(Choukroun J、Diss A、Simonpieri A、Girard M-O、Schoeffler C、Dohan SL等人，Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral RadiolEndod.2006；101:299-303)。它被描述为一种更天然的血纤蛋白基质，其含有有利于愈合和免疫的血液成分，与PRP相比具有特定优势。例如，与当将凝血酶添加到PRP中时产生的快速聚合相比，凝结(clotting)过程是通过更慢的自然聚合发生的。最重要的是，PRF不需要抗凝剂或凝血酶添加剂(Dohan DM、Choukroun J、Diss A、Dohan SL、Dohan AJJ、Mouhyi J等人，Oral Surgery,Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endodontology.2006；101)。体外研究还已证明，PRF具有更持久的生长因子(诸如PDGF、TGF-β和BMP)释放，持续长达28天(HeL、Lin Y、Hu X、Zhang Y、Wu H.Oral Surgery,Oral Med Oral Pathol Oral RadiolEndodontology.2009；108:707-713)。这种释放谱与PRP明显不同，PRP的特征是一天之内细胞因子和生长因子的突发释放。尽管如此，PRF在被应用于口腔和颌面外科手术中时仍未显示出任何显著改善(Choukroun J、Diss A、Simonpieri A、Girard M-O、Schoeffler C、Dohan SL等人，Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.2006；101:299-303；和Busenlechner D,Huber CD,Vasak C,Dobsak A,Gruber R,Watzek G.Clin OralImplants Res.2009；20:1078-1083)。再次，类似于PRP，这可能与所递送的血小板量不足以及不合适的结构特性有关。

血肿形成对骨折愈合的影响。骨折血肿形成发生在骨骼损伤的几分钟之内，并且包括生物学事件级联，该生物学事件级联涉及来自血液学系统的激活的凝固因子以及来源于骨膜、骨髓和周围软组织的许多分子因子，诸如促炎性细胞因子和生长因子，包括成骨和血管生成因子(Lai BFL,Zou Y,Brooks DE,Kizhakkedathu JN.Biomaterials.ElsevierLtd；2010；31:5749-5758)。在骨折部位，血管收缩以防止持续失血，然后是凝固级联，所述凝固级联导致位于破裂的碎片之间的血肿或血凝块形成(Schindeler A,McDonald MM,Bokko P,Little DG.Semin Cell Dev Biol.2008；19:459-66)。在凝结过程中，有两个主要途径：内在途径和外在途径，其中常见途径是凝固因子X转化成Xa。凝固级联中的最终蛋白酶凝血酶是糜蛋白酶家族的典型丝氨酸蛋白酶，并且具有促凝固功能和抗凝固功能两者(Huntington JA。Thrombin plasticity.Biochim Biophys Acta-ProteinsProteomics.Elsevier B.V.；2012；1824:246-252)。在正常的血液凝结期间，凝固级联通过将酶原凝血酶原转化成丝氨酸蛋白酶凝血酶来激活所述酶原凝血酶原。凝血酶随后将可溶性血纤蛋白原转化为不溶性血纤蛋白纤维。最后，这些血纤蛋白纤维借助凝固因子XIII而有助于成熟网状血纤蛋白凝块的形成(Chernysh IN,Nagaswami C,Purohit PK,WeiselJW.Sci Rep.2012；2:879)。因此，血纤蛋白原、凝血酶和凝固因子XIII的浓度梯度在调节血纤蛋白凝块构象中起着重要作用(Wolberg AS，Campbell RA。Transfus Apher Sci.2008；38:15-23)。血纤蛋白凝块中的结构参数可以通过纤维直径、密度、分支点数量、分支点之间的距离，以及孔的尺寸来表征(Weisel JW，Litvinov RI。Blood.2013；121:1712-1719)。血纤蛋白纤维直径的增加与血纤蛋白纤维的密度成反比，并且与孔隙大小成正比(EichhornSJ,Sampson WW.J R Soc Interface.2005；2:309-318；和Kaur S,Sundarrajan S,Rana D,Matsuura T,Ramakrishna S.J Memb Sci.2012；392-393:101-111)。此外，纤维的直径和密度影响血纤蛋白凝块的孔隙率和表面积(Pham QP,Sharma U,AntoniosG.Mikos.Biomacromolecules.2006；7:2796–2805)，并负责干细胞的生物学功能，诸如粘附、增殖和分化(Badami AS,Kreke MR,Thompson MS,Riffle JS,GoldsteinAS.Biomaterials.2006；27:596-606)。例如，低凝血酶浓度(<1nM)生成高度易发生血纤蛋白溶解的粗血纤蛋白纤维的多孔网络，而高凝血酶浓度导致细纤维，所述细纤维形成相对抗血纤蛋白溶解的渗透性较差的血纤蛋白网络(Gabriel DA,Muga K,Boothroyd EM.JBiol Chem.1992；267:24259-63)。此外，尽管单独粗纤维具有较高的机械强度(刚度)，但是由于纤维数量减少，由粗纤维组成的血纤蛋白凝块往往具有较低的机械强度(CarlisleCR,Coulais C,Guthold M.Acta Biomater.2010；6:2997-3003；和Liu W,Thomopoulos S,Xia Y.Adv Healthc Mater.2012；1:10-25)。

尽管有大量关于血肿形成在骨折愈合中的重要性的研究，但尚无研究报道在自身正常愈合的骨折愈合与不会自身正常愈合的节段性骨缺损之间形成的血肿的结构和生物学特性之间的差异，以及是否可以调节血肿特性以增强大节段性骨缺损的修复。

替代地，似乎大多数研究已经集中于完善PRP的特性上，如“第二代”产品PRF所证明的那样。尽管一些研究确实表明PRF与其对应的PRP相比是稍微更有效的产品，但迄今为止的研究尚无说服力并且需要进一步研究，特别是在长骨的修复和再生方面。

本文公开了用于改善诱导的血凝块的结构和生物学特性以增强大节段性骨缺损的愈合的方法。例如，为了显著改善和加速士兵和平民中大节段性骨缺损的愈合，本文描述了离体血肿，所述离体血肿是通过构建模仿先天性骨折血肿的结构特性的血纤蛋白凝块而创建的。为此，使用大鼠模型来评定在骨折部位形成的血肿的质量是否决定了大骨缺损的愈合潜能；以及是否全血可以使用蛇毒液酶操纵以形成模仿正常骨折血肿的内在结构特性的血凝块，并随后用于增强大骨缺损的愈合。

促血栓形成蛇毒液。许多蛇毒液毒素含有蛋白水解酶，所述蛋白水解酶通过凝固剂凝血酶样酶和凝血酶原激活毒素的作用影响止血(图1)。如图1所示，因子X至(活化的)Xa的转化是外在凝固途径与内在凝固途径之间的共同纽带(common junction)。蛇毒液酶已经进化为利用凝固级联的各个阶段。这些毒液已经进化为利用血小板、内皮细胞和血浆蛋白与毒液蛋白之间存在的脆弱相互作用，所述毒液蛋白影响脊椎动物止血的阶段(MeierJ,Stocker K.Crit Rev Toxicol.1991；21:171-182)。根据蛇的类型，它们各自具有特异性的促凝固因子。例如，在太攀蛇(coastal taipan)(太攀蛇(Oxyuranus scutellatus))的毒液中发现的促凝固因子oscutarin在结构和功能上类似于哺乳动物凝固因子X。Oscutarin是一种属于C组凝血酶原激活剂毒液的丝氨酸蛋白酶，所述C组凝血酶原激活剂毒液与哺乳动物因子X不同，不需要非酶促因子V，因为它们含有它们自身的因子Va样分子(St.PierreL,Masci PP,Filippovich I,Sorokina N,Marsh N,Miller DJ等人，Comparativeanalysis of prothrombin activators from the venom of Australian elapids.MolBiol Evol.2005；22:1853-1864)。类似地，在锯鳞蝰(Saw-scaled viper)(锯鳞蝰(Echiscarinatus))的毒液中发现的蛇静脉酶(ecarin)是一种金属蛋白酶，其作用不涉及辅因子，诸如氯化钙(CaCl

来自蛇毒液的凝固因子由于若干原因而受到青睐，例如，它们不影响其他凝结因子，并且该分子的小尺寸使其在使用时不太可能被身体的免疫系统识别，因此也不太可能被攻击。此外，该分子在附着至它们的身体内靶标时是选择性的，这最小化了不希望的副作用的可能性。特别地选择蛇静脉酶，因为它不需要辅因子来激活。

本公开对于开发新的改进的治疗策略以在由于严重的创伤和战场损伤导致的平民群体以及军事人员两者中增强骨伤愈合、提高生活质量、降低高昂的治疗成本以及降低肢体截肢率而言是重要的。本文公开的结果可提供离体产生的血肿的要求，所述离体产生的血肿具有通过模仿自然愈合的骨折血肿的内在结构和生物学特性来增加骨愈合有效性的特性。本公开对于开发用作生长因子贮库、具有骨诱导性和骨传导性，以及用作生物相容性支架来增强大节段性骨缺损、亚临界大小缺损的愈合的离体血肿，以及对于治疗不愈合骨折(延迟的愈合或不愈合)而言也是重要的。

预期通过在手术室中简单地混合所需体积的全血和特定浓度的蛇毒液凝固酶，就可以实现快速的产品转化以及按需应用，而无需在民用或军用临床环境中使用高度专业化的设备。通过将符合的血肿结构特性并入到生物材料支架设计中以提高目前在再生医学中使用的性能较差的支架的帮助骨修复的能力，本文所述的结果也可以使生物材料研究人员受益。此外，从蛇毒液中分离出的促凝固因子可用作合适的凝结剂以改变血凝块的结构特性，并且可用于在医院环境中和战场上终止失控的出血。本文还公开了可以在几秒钟内终止出血的产品，所述产品易于携带、具有长保质期、可再吸收或者易于去除，并且便宜。由于这些蛇进化成通过引起即时、大量的凝血病来杀死它们的猎物，因此它们已经形成了使血液变成明胶的高度特异性的生物制剂。然而，当在受控条件下被正确地分离和仔细地制备时，相同的凝固因子(诸如蛇静脉酶)可替代地用来帮助挽救生命。通过立即控制失血，这种非凡的特性可限制平民患者或战场上受伤士兵的进一步失血。

本文公开了用于使大骨缺损愈合的生物相容性蛇毒液诱导的离体血肿。本文还公开了以特定方式处理和操纵离体血肿(血凝块)的方法，所述特定方式改变离体血肿的超微结构特征，从而改变了离体血肿在各种临床情况下的行为。本文公开了用改变全血或血液制品的结构构象并改变它的生物学活性的剂处理所述全血或血液制品，使得所述全血或血液制品可用于治疗几种不同的医学疾患的方法。

本文公开了可用于改善大骨缺损、亚临界大小缺损的再生和修复以及用于治疗不愈合骨折(延迟愈合或不愈合)的组合物和方法。本文公开了有组织的血凝块(离体血肿/生物相容性支架)，所述有组织的血凝块可用于通过用作供重要生长因子的持续释放用的暂时储存器，以及通过提供足够空间以同时帮助细胞浸润、增殖和分化来增强骨愈合。本文公开了用于增强修复过程的组合物和方法，所述修复过程涉及产生模仿自然愈合的骨折血肿的血凝块(离体血肿)。这个概念是，可以使用来源于蛇毒液的凝固因子蛇静脉酶改变离体产品血肿的结构特性，以模仿当被植入到骨缺损中时将增强和加速骨愈合的内在断裂血肿。来源于蛇毒液的凝固因子蛇静脉酶也可用于终止出血。在一些方面中，该组合物可被配制为粉末、液体或喷雾剂。

本文公开了包含全血、蛇静脉酶和BMP-2的组合物。在一些方面中，蛇静脉酶可以特定浓度存在。在一些方面中，可以使用低剂量或显著降低剂量的BMP-2。在一些方面中，所述组合物可用于增强骨缺损的愈合。在一些方面中，所述组合物可以被配制为液体或凝胶。

本文所述的愈合类型类似于由美敦力公司(Medtronic)出售的可商购产品提供的愈合，该产品使用在可吸收性胶原海绵(Infuse

如本文所公开的，BMP-2属于骨形态发生蛋白(BMP)家族。这些蛋白质是具有诱导软骨内骨新生物的能力的骨生长因子。在一些方面中，BMP-2可以是重组BMP-2。产生重组BMP-2的方法在本领域中是已知的，并且例如可以在美国专利号7,354,901中找到，该专利据此以引用方式并入本文。

本文公开了离体血肿。在一些方面中，所述离体血肿可包含：(a)分离的全血；(b)柠檬酸钠；(c)蛇静脉酶；oscutarin和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙。在一些方面中，所述离体血肿可包含：(a)富血小板血浆、血浆、或具有红血细胞的血浆；(b)蛇静脉酶；oscutarin和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙。在一些方面中，离体血肿可进一步包含柠檬酸钠。在一些方面中，短语“具有红血细胞的血浆”意指没有血小板的血浆。在一些方面中，离体血肿可包含厚度为至少150-300nm±10％的血纤蛋白纤维。在一些方面中，蛇静脉酶；oscutarin和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙可导致形成一种或多种厚度为至少150-300nm±10％的血纤蛋白纤维。如本文所用的术语“离体”是指可以在生物体外，例如在外部环境中形成的血肿。在一些方面中，离体血肿可包含(a)分离的全血和柠檬酸钠、富血小板血浆、单独的血浆、具有红血细胞的血浆(不含血小板)或其他血液制品；以及(b)一种或多种凝固因子。在一些方面中，离体血肿可包含全血和一种或多种凝固因子。

如本文所用，术语“全血”和“血液”在本文中用于意指可以直接从身体中抽出的血液，其中的包括血浆或血小板在内的所有组分都没有被去除。在一些方面中，全血或血液可以来自受试者或患者，所述受试者或患者将是本文所述的组合物中的任何组合物或本文所述的离体血肿中的任何离体血肿的接受者。在一些方面中，全血或血液可以来自供体受试者或患者。全血由红血细胞、白细胞、血小板和血浆构成。在一些方面中，可以使用血纤蛋白凝胶代替全血。

本领域的普通技术人员将理解，血液是特殊的体液，其将诸如营养物和氧的重要物质递送至细胞中并将代谢废产物从那些相同的细胞中运走。在脊椎动物中，血液由悬浮在血浆中的血细胞组成。血液可包含不同的组分，例如血浆、红血细胞(红细胞)、血小板(凝血细胞)和白血细胞(白细胞)。血浆是血液的主要组分，占血液的约55％，主要由水以及离子、蛋白质、营养物和废物组成。血浆可含有身体所产生的各种蛋白质中的一些蛋白质。例如，血浆可包含约90％的水和10％的以下物质的混合物：离子(Na

如本文所用，术语“富血小板血浆”(也称为自体条件血浆(autologousconditioned plasma))是指来源于全血的浓缩形式的富血小板血浆蛋白。例如，可以将全血离心以去除红血细胞。在一些方面中，术语“单独的血液血浆”、“单独的血浆”或“血浆”可以指来源于全血的淡黄色液体组分，所述淡黄色液体组分正常情况下使全血中的血细胞保持在悬浮状态。例如，可通过将血液离心直至血细胞落至试管底部，然后可将血浆从试管顶部抽出来从全血中分离出血浆。在一些方面中，术语“具有红血细胞的血浆”可以指具有添加的红血细胞的“单独血浆”。例如，红细胞可以通过离心全血直到它们落在试管的底部而获得，并在从试管的顶部去除血浆、白细胞和血小板后取回。

在一些方面中，离体血肿可包含一种或多种生长因子。在一些方面中，所述一种或多种生长因子可以是骨形态发生蛋白中的一种或多种骨形态发生蛋白。BMP的示例包括但不限于BMP-2、BMP-7、BMP-4、BMP-6、BMP-9和BMP-14(也称为GDF5)。设想了任何BMP，包括BMP-1至BMP-18。在一些方面中，所述一种或多种生长因子可以是血小板源性生长因子。在一些方面中，所述一种或多种生长因子可以是血管内皮生长因子。在一些方面中，所述一种或多种生长因子可以是成纤维细胞生长因子2。在一些方面中，所述一种或多种生长因子可以是以下中的一者或多者：骨形态发生蛋白、血小板源性生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子2，或它们的组合。在一些方面中，离体血肿可进一步包含BMP-2。在一些方面中，所述一种或多种生长因子可以是BMP-2。

在一些方面中，全血可包含能存活细胞。在一些方面中，在血肿形成之后，全血的能存活细胞的约50％至70％仍然能存活。在一些方面中，在血肿形成之后，全血的能存活细胞的至少50％仍然能存活。在一些方面中，在血肿形成之后，全血的能存活细胞的至少60％仍然能存活。在一些方面中，在血肿形成之后，全血的能存活细胞的至少70％仍然能存活。在一些方面中，在血肿形成之后，全血的能存活细胞的至少80％仍然能存活。在一些方面中，在血肿形成之后，全血的能存活细胞的至少90％仍然能存活。在一些方面中，在血肿形成之后，全血的能存活细胞的大于90％仍然能存活。

在一些方面中，全血可包含一种或多种生物因子。在一些方面中，术语“生物因子”或“其他生物因子”是指全血中排除水的血浆组分。其他生物因子的示例包括但不限于离子、蛋白质、凝血因子、糖、脂质，和矿物质。

在一些方面中，全血中存在的所述一种或多种生物因子可以是内源性生物因子。血小板存在于全血中。在血小板中可以发现许多生长因子。富血小板血浆中的生长因子血小板α颗粒已被证明含有促有丝分裂的趋化性生长因子以及呈非活性形式的相关联愈合分子，所述相关联愈合分子是在伤口愈合中重要的，包括但不限于血小板源性生长因子(PDGF)，转化生长因子β1、β2、β3(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)，血小板源性血管生成因子(PDAF)，胰岛素样生长因子1(IGF-1)，血小板因子4(PF-4)，表皮生长因子(EGF)，上皮细胞生长因子(ECGF)，血管内皮细胞生长因子(VEGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和其他细胞因子。另外，血浆液还含有许多生物活性蛋白，例如生长因子IGF-I和肝细胞生长因子(HGF)。在正常的伤口愈合期间，捕获的血小板被激活并脱粒，从而导致α颗粒含量的释放。血小板中存在的生长因子的示例包括但不限于血小板源性生长因子，转化生长因子β1、β2、β3，血小板源性血管生成因子，胰岛素样生长因子1，血小板因子4，表皮生长因子，上皮细胞生长因子，血管内皮细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，和其他细胞因子；以及血小板源性内皮生长因子(PDEGF)，白介素1，骨钙素和骨连接素。血浆液中存在的生长因子包括但不限于胰岛素样生长因子1和肝细胞生长因子。

在一些方面中，离体血肿可包含全血、蛇静脉酶和柠檬酸钠。在一些方面中，离体血肿可包含全血、氯化钙和柠檬酸钠。在一些方面中，离体血肿可包含富血小板血浆和蛇静脉酶。在一些方面中，离体血肿可包含富血小板血浆和氯化钙。在一些方面中，离体血肿可包含全血；氯化钙；或oscutarin和氯化钙；以及柠檬酸钠。在一些方面中，(a)分离的全血和柠檬酸钠；富血小板血浆，或具有红血细胞的血浆中的一者的组合可以与(b)蛇静脉酶、oscutarin和氯化钙，或氯化钙中的一者进行组合。在一些方面中，(a)分离的全血和柠檬酸钠；富血小板血浆，或具有红血细胞的血浆中的一者的组合可以与(b)凝血酶，或凝血酶和氯化钙中的一者进行组合。在一些方面中，本文所述的离体血肿组合中的任一种可进一步包含一种或多种抗生素。

在一些方面中，离体血肿中存在的氯化钙的浓度可在1mM至20mM的范围内。在一些方面中，氯化钙的浓度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20mM或其间的任何数值。在一些方面中，氯化钙的浓度可以为约10mM。

在一些方面中，凝血酶的浓度可以在0.1U/mL至1U/mL的范围内。在一些方面中，离体血肿中存在的凝血酶浓度可为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1U/mL或其间的任何数值或更高。在一些方面中，离体血肿中存在的凝血酶浓度可为0.5U/mL

在一些方面中，离体血肿中存在的蛇静脉酶浓度可为至少0.05U/mL。在一些方面中，离体血肿中存在的蛇静脉酶浓度可为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1U/mL或其间的任何数值或更高。在一些方面中，离体血肿中存在的蛇静脉酶浓度可为0.3U/mL。在一些方面中，离体血肿中存在的蛇静脉酶浓度可为0.6U/mL。在一些方面中，离体血肿中存在的蛇静脉酶浓度可为0.75U/mL。

在一些方面中，本文所述的离体血肿可进一步包含BMP-2。在一些方面中，BMP-2可以是重组BMP-2。在一些方面中，重组BMP-2可包含人BMP-2。在一些方面中，离体血肿中存在的BMP-2的剂量可为至少0.01mg。在一些方面中，离体血肿中存在的BMP-2的剂量可为0.01至5mg。在一些方面中，离体血肿中存在的BMP-2的剂量可以为0.01、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mg或其间的任何数值。在一些方面中，重组BMP-2可以约0.01mg至约12mg的剂量使用。在一些方面中，重组BMP-2可以以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0mg或其间的任何数值的剂量使用。在一些方面中，重组BMP-2可以以高于12.0mg的剂量使用。在一些方面中，BMP-2的剂量可以为约1mg至5mg。在一些方面中，离体血肿中存在的BMP-2的剂量可为至少0.01μg。在一些方面中，离体血肿中存在的BMP-2的剂量可为0.01至5μg。在一些方面中，离体血肿中存在的BMP-2的剂量可以为0.01、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0μg或其间的任何数值。在一些方面中，重组BMP-2可以约0.01μg至约12μg的剂量使用。在一些方面中，重组BMP-2可以以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0μg或其间的任何数值的剂量使用。在一些方面中，重组BMP-2可以以高于12.0μg的剂量使用。在一些方面中，BMP-2的剂量可以为约1μg至5μg。在一些方面中，离体血肿中存在的BMP-2的剂量可介于0.3μg与0.4μg之间。在一些方面中，离体血肿中存在的BMP-2的剂量可低于标准剂量。在一些方面中，离体血肿中存在的BMP-2的剂量可以比BMP-2/ACS的标准剂量或最低有效剂量低10-50倍。

在一些方面中，离体血肿中存在的蛇静脉酶的量可以为至少0.05U/mL；并且所述离体血肿中存在的BMP-2的量可以为至少0.01mg。

在一些方面中，离体血肿中存在的蛇静脉酶的量可以为至少0.05U/mL；并且所述离体血肿中存在的BMP-2的量可以为至少0.01μg。

在一些方面中，柠檬酸钠的浓度可以为约3.2mg/ml至4mg/ml。在一些方面中，该溶液是约3.2％至4％(重量/体积)的柠檬酸钠，其中一份该溶液然后可以与九份全血混合。

在一些方面中，本文所述的离体血肿可进一步包含一种或多种治疗剂。在一些方面中，治疗剂可以是生长因子。在一些方面中，治疗剂可以是BMP-2。在一些方面中，治疗剂可以是重组BMP-2。在一些方面中，治疗剂可以是干细胞或预分化的干细胞，包括但不限于间充质干细胞、脂肪干细胞和诱导的多能干细胞。在一些方面中，治疗剂可以是蛇静脉酶。

在一些方面中，离体血肿可以被配制为液体或凝胶。在一些方面中，离体血肿可以被配制为冻干或粉末形式。所述冻干或粉末形式可以使离体血肿储存时更稳定。在一些方面中，生长因子(BMP等)、凝固因子(蛇静脉酶、氯化钙等)和柠檬酸钠可作为冻干或粉末形式获得。在一些方面中，在与全血或其他血液制品(例如，PRP、血浆等)混合之前，可将用于制造本文公开的离体血肿的化合物溶于无菌蒸馏水中。稀释剂是无菌蒸馏水。制备或储存不需要附加组分。可以在手术之前(例如，紧接在手术之前)从患者抽取全血(或其他血液制品)，并对其进行柠檬酸化以防止凝结。在一些方面中，供体血液可以例如供患有血液病症或疾病的患者使用，所述血液病症或疾病包括但不限于贫血、血友病、白血病、HIV等。离体血肿的其余组分不需要任何附加稳定剂来储存。例如，BMP-2可以瓶形式商购获得，是即用型的；并且CaCl

在一些方面中，本文所述的离体血肿可进一步包含载体。例如，载体可以是可生物降解的生物材料支架(例如，丝心蛋白支架、聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(PLGA)或其他类似的可再吸收产品或材料)。此类载体可用于提供离体血肿的附加机械支持。

在一些方面中，离体血肿可被配制用于局部施用。在一些方面中，本文公开的组合物(例如，液体形式)或离体血肿(例如，凝胶形式)可以局部地施用、手术植入或经皮注射。在一些方面中，液体制剂可以通过注射器递送。在一些方面中，可以将凝胶制剂植入骨缺损部位中。可以使用身体外部的模具来制备凝胶制剂，所述模具对应于用于植入到骨缺损部位中的骨的大小和形状。在一些方面中，该制剂可以是介于液体与凝胶之间的中间形式。在一些方面中，可以将中间制剂施加至固体生物支架上，以弥合固体生物支架本身中可能存在的间隙(例如，大间隙)，与此同时还独立地提供机械支撑。固体生物支架的示例包括但不限于钛笼或其他多孔金属植入物。此类生物支架可用于重建骨骼缺损或实现脊柱融合。考虑到PEEK本身是生物学惰性的并且不具有内在骨愈合能力，因此当将PEEK脊柱笼用于椎间植骨融合(interbody spinal fusion)时可使用本文公开的制剂来增强愈合。替代地，本文公开的制剂中的任何制剂均可被输注或局部施加至如可用于重建节段性或亚节段性骨骼缺损的可再吸收的生物支架上。当与金属多孔植入物或可再吸收的生物支架结合使用时，这还将包括(股骨、胫骨或其他长骨的)开放性楔形截骨、牵张性关节固定部位，以及与关节成形术相关的骨缺损。此外，本文公开的制剂中的任何制剂均可以相同方式施加至具有骨缺损的其他关节固定部位，诸如踝关节、膝盖、腕部、肩膀、髋部或其他较小的关节，包括但不限于利斯弗朗关节(Lisfranc joint)，手、腕或脚中的较小关节，并且扩展到包括用于填充在收获骨移植物以转位至次要解剖位置时产生的骨缺损的应用。

在一些方面中，蛇静脉酶可单独使用或者与一种或多种如本文所述的组分组合使用以终止出血。在一些方面中，出血可能是严重的。在一些方面中，出血可以是动脉、静脉或毛细血管出血。在一些方面中，蛇静脉酶可以被配制为粉末、液体或喷雾剂。在一些方面中，蛇静脉酶可以被配制为珠粒(例如，胶原蛋白珠粒)。在一些方面中，蛇静脉酶可以被配制为纳米粒子。

本文公开了促进骨愈合的方法。本文还公开了产生骨置换材料的方法。本文进一步公开了产生植入物的方法。在一些方面中，本文公开的方法可进行组合。本文公开了促进骨愈合、产生骨置换材料、产生植入物或它们的组合的方法。在一个方面中，所述方法可包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含本文所公开的离体血肿的组合物。本文公开了在受试者中实现以下的方法：促进骨愈合、产生骨置换材料、产生植入物或它们的组合，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含本文所公开的离体血肿的组合物。

在一些方面中，所述离体血肿可包含：(a)分离的全血；(b)柠檬酸钠；(c)蛇静脉酶；oscutarin和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙。在一些方面中，所述离体血肿可包含：(a)富血小板血浆、血浆、或具有红血细胞的血浆；(b)蛇静脉酶；oscutarin和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙。在一些方面中，离体血肿可进一步包含柠檬酸钠。在一些方面中，离体血肿可包含厚度为至少150-300nm±10％的血纤蛋白纤维。在一些方面中，蛇静脉酶；oscutarin和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙可导致形成一种或多种厚度为至少150-300nm±10％的血纤蛋白纤维。在一些方面中，离体血肿可包含(a)分离的全血和柠檬酸钠、富血小板血浆、单独的血浆、具有红血细胞的血浆(不含血小板)或其他血液制品；以及(b)一种或多种凝固因子。在一些方面中，离体血肿可包含全血和一种或多种凝固因子。在一些方面中，全血可包含一个或多个能存活细胞。在一些方面中，全血可包含一种或多种生物因子。在一些方面中，离体血肿可包含全血、蛇静脉酶和柠檬酸钠。在一些方面中，离体血肿可包含全血、氯化钙和柠檬酸钠。在一些方面中，离体血肿可包含富血小板血浆和蛇静脉酶。在一些方面中，离体血肿可包含富血小板血浆和氯化钙。在一些方面中，离体血肿可包含血浆和蛇静脉酶。在一些方面中，离体血肿可包含血浆和氯化钙。在一些方面中，离体血肿可包含具有红血细胞的血浆和蛇静脉酶。在一些方面中，离体血肿可包含具有红血细胞的血浆和氯化钙。在一些方面中，离体血肿可包含含有oscutarin的血浆和氯化钙。在一些方面中，离体血肿可包含具有凝血酶的血浆和氯化钙。在一些方面中，离体血肿可进一步包含骨形态发生蛋白2(BMP-2)。在一些方面中，BMP-2可以是重组BMP-2。在一些方面中，重组BMP-2可包含人BMP-2。在一些方面中，所述组合物可进一步包含一种或多种生长因子、一种或多种血小板，以及一种或多种细胞。在一些方面中，所述组合物可以被配制为凝块或者被配制为支架。在一些方面中，支架可以是趋化性的。在一些方面中，支架可以吸引有助于骨愈合的内源性生长因子。

在一些方面中，受试者可以是人类。在一些方面中，所述受试者具有骨骼缺损。在一些方面中，骨骼缺损可以是大节段性骨缺损。在一些方面中，受试者具有一处或多处骨折。在一些方面中，受试者具有一处或多处骨损伤。

在一些方面中，所述组合物可以被配制为凝块或支架。在一些方面中，所述组合物可以被配制为离体血肿。在一些方面中，所述组合物可以被配制用于局部施用。在一些方面中，所述组合物可以局部施用。在一些方面中，所述组合物可以被植入。在一些方面中，所述组合物可以经皮注射。在一些方面中，所述组合物可以用注射器注射。在一些方面中，所述组合物中存在的蛇静脉酶的量可为至少0.05U/mL；并且所述组合物中存在的BMP-2的量可为至少0.01-5mg或其间的任何量。在一些方面中，所述组合物中存在的蛇静脉酶的量可为至少0.05U/mL；并且所述组合物中存在的BMP-2的量可为至少0.01-1μg或其间的任何量。

在一些方面中，治疗方案可以是用于治疗任何骨缺损的标准治疗方案。简而言之，可以对缺损伤口进行清创，用内板、外固定器或髓内钉对其进行固定。然后可以在闭合伤口之前将本文所述的组合物和离体血肿插入骨骼缺损中。如果没有感染存在并且缺损已另外准备好进行明确的治疗，则治疗方案可以是一致且不变的。可通过使本文所公开的植入物穿过皮肤或穿过体腔或解剖学开口进入身体中来将所述植入物插入到骨区域中，以最小化对附近结构的任何附加损害。可以基于许多因素来选择植入物的类型(包括大小和形状)，所述因素包括但不限于要植入植入物的骨的形状和/或大小；骨密度百分比(即，剩余骨的多孔性)；以及/或者支架或植入物向骨中扩散的期望速率和分布；或此类因素的组合。在一些方面中，植入物的形状可以被构造成与骨或椎骨体的形状匹配，并且因此允许支架，植入物或离体血肿或存在于支架、植入物或离体血肿中的组分的更均匀分布。植入物或离体血肿的施加可以在手术时或以任何其他合适的方式发生。

本文公开了构建植入物的方法。在一些方面中，所述构建植入物的方法包括：a)将贮库植入物的尺寸确定为可有助于将所述贮库植入物植入骨缺损中的形状和大小中的至少一者；以及b)通过如下方式来将所述贮库植入物结构化为具有支架：引入(i)分离的全血和柠檬酸钠，或富血小板血浆、单独的血浆，或具有红血细胞的血浆(不含血小板)；以及(ii)蛇静脉酶；氯化钙；oscutarin和氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙以创建支架。在一些方面中，所述支架可具有55％至75％的孔隙率。在一些方面中，所述支架可包括厚度为至少150-300nm±10％的血纤蛋白纤维。在一些方面中，所述支架中存在的蛇静脉酶的量可以为至少0.05U/mL；并且所述支架中存在的BMP-2的量可以为至少0.01mg。在一些方面中，所述支架中存在的蛇静脉酶的量可以为至少0.05U/mL；并且所述支架中存在的BMP-2的量可以为至少0.01μg。在一些方面中，所述支架可包含至少一种能存活血细胞。在一些方面中，所述支架可包含适当的生物因子。

在一些方面中，贮库植入物的形状可以是球体或圆柱体的形状。在一些方面中，贮库植入物的形状可以是球体的形状，或如由临床紧急事件决定的任何其他患者特定的几何形状、形式或形状。在一些方面中，圆柱体形状的长度可以是至少5mm至约30cm(或更长)。在一些方面中，圆柱体形状的直径可为至少1mm至约60mm(或更大)。在一些方面中，圆柱体形状可以是直的和/或弯曲的。在一些方面中，圆柱体形状可以是直杆或弯曲杆。圆柱体或杆形状可以是具有沿一个方向比在其他方向上更长的纵轴的任何形状。贮库在纵轴上的横截面形状可以是任何形状。在一些方面中，横截面形状可以是椭圆形、圆形、三叶形、或任何其他形状。在一些方面中，植入物可在此种纵向方向上是直的或弯曲的。植入物的末端表面可以被成形为使得其在形状上是平坦的、圆形的或卷曲的。

植入物的尺寸可以取决于骨缺损的大小和受治疗的解剖部位。在一些方面中，所述支架可以比缺损的实际大小长约20％，从而使所述支架紧密贴合并完全填充缺失骨的体积。例如，如果骨缺损的大小为3cm，并且其是成人的中段股骨，则可能需要将植入物构建为例如具有约3-4cm直径和约3.6cm长度的尺寸。在一些方面中，支架可以类似于给定骨缺损的大小和形状。在一些方面中，支架可以是趋化性的。

如本文所公开的是构建植入物的方法。所述构建植入物的方法包括：a)将贮库植入物的尺寸确定为可有助于将所述贮库植入物插入或植入骨缺损中的形状和大小中的至少一者；b)通过如下方式来将所述贮库植入物结构化为具有支架：引入(i)分离的全血和柠檬酸钠，或富血小板血浆、血浆，或具有红血细胞的血浆；以及(ii)蛇静脉酶；oscutarin和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙以创建支架。在一些方面中，所述支架可具有55％至75％的孔隙率。在一些方面中，所述支架可以被构建为凝块的形式。在一些方面中，离体血肿可进一步包含一种或多种生长因子。在一些方面中，所述一种或多种生长因子可以是骨形态发生蛋白2(BMP-2)、BMP-7、BMP-4、BMP-6、BMP-9、BMP-14、血小板源性生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子2，或它们的组合。在一些方面中，可以将BMP-2引入支架或离体血肿中。另外，所述支架或凝块或离体血肿可以是生物可降解的，使得其无需手术去除即可降解。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物来引发或增强骨愈合的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物来重建节段性骨缺损的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建仿生血肿,12q来重建因肿瘤、创伤，或感染引起的节段性骨缺损的方法，所述仿生血肿通过递送催化量的随后局部超活化内源性生长因子的BMP来引发正常骨折愈合级联。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物治疗(例如，骨质疏松患者、糖尿病患者、老年人或吸烟者中的)骨折风险的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建仿生血肿来治疗骨折风险的方法，所述仿生血肿通过递送催化量的随后局部超活化内源性生长因子的BMP来引发正常骨折愈合级联。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物治疗非典型股骨骨折的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建仿生血肿来经皮地治疗非典型股骨骨折的方法，所述仿生血肿通过递送催化量的随后局部超活化内源性生长因子的BMP来引发正常骨折愈合级联。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物治疗最低限度地移位的股骨颈骨折的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建仿生血肿来经皮地治疗最低程度地移位的股骨颈骨折的方法，所述仿生血肿通过递送催化量的随后局部超活化内源性生长因子的BMP来引发正常骨折愈合级联。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物治疗骨质疏松性不全骨折(骨盆、脊柱)的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建仿生血肿来经皮地治疗骨质疏松性不全骨折(例如骨盆、脊柱)的方法，所述仿生血肿通过递送催化量的随后局部超活化内源性生长因子的BMP来引发正常骨折愈合级联。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物来结合脊柱笼(陶瓷、PEEK或金属合金)增强脊柱融合程序的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶诱导包埋在包含脊柱笼(陶瓷、PEEK或金属合金)的基板上的仿生血肿局部形成来结合所述脊柱笼增强脊柱融合程序的方法，所述脊椎笼允许完全立即承重，提供更稳定的固定，并增强术后恢复，所述仿生血肿通过递送催化量的随后局部超活化内源性生长因子的BMP来引发骨愈合级联。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物来(经皮或开放地)治疗长骨骨折的延迟愈合的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建仿生血肿来(经皮或开放地)治疗长骨骨折的延迟愈合的方法，所述仿生血肿通过递送催化量的随后局部超活化内源性生长因子的BMP来引发骨折愈合级联。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物来(经皮或开放地)治疗确定的长骨骨折不愈合的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建仿生血肿来(经皮或开放地)治疗确定的长骨骨折不愈合的方法，所述仿生血肿通过递送催化量的随后局部超活化内源性生长因子的BMP来引发骨折愈合级联。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物来改善(例如加速)长骨骨折愈合的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建仿生血肿来改善(例如加速)选定候选者(例如高水平运动员)的长骨骨折愈合以促进更快速恢复的方法，所述仿生血肿通过递送催化量的随后局部超活化内源性生长因子的BMP来引发骨折愈合级联。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物来加速选定兽医候选者(诸如纯种赛马)的长骨骨折愈合的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建仿生血肿来加速选定兽医候选者(诸如纯种赛马)的长骨骨折愈合以促进更快速恢复的方法，所述仿生血肿通过递送催化量的随后局部超活化内源性生长因子的BMP来引发骨折愈合级联。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物促进更快速且可预测的牙齿和颌面重建的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建仿生血肿来促进更快速且可预测的牙齿和颌面重建的方法，所述仿生血肿通过递送催化量的随后局部超活化内源性生长因子的BMP来引发骨形成级联。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物来逆转导致自发性颌骨再吸收的疾患的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建仿生血肿以使骨局部再生来逆转导致自发性颌骨再吸收的疾患的方法。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物来治疗和/或逆转导致自发性骨坏死的疾患的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建经皮或开放递送的仿生血肿来逆转导致自发性骨坏死的疾患(诸如金伯克病(

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物来治疗和/或逆转导致股骨头已塌陷的股骨头自发性缺血性坏死的疾患的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建仿生血肿来治疗和/或逆转导致股骨头已塌陷的股骨头自发性缺血性坏死的疾患的方法，所述仿生性血肿是在手术髋部脱位后以开放程序递送的。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物治疗由化学疗法、酒精中毒、吸烟或其他外源性剂引起的骨坏死的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建经皮或开放递送的仿生血肿来治疗由化学疗法、酒精中毒、吸烟或其他外源性剂引起的骨坏死的方法。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物来增强任何标准融合程序的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建仿生血肿来增强任何标准融合程序(例如，髋部、膝盖、踝部、腕部、肘部、肩膀、距下关节，腕骨或足中段中的任何有限融合，较小关节(诸如后趾(hallux)、拇指(pollex)，或较小的指/趾(脚趾或手指))中的任一者中的融合)的方法，所述仿生血肿通过递送催化量的随后局部超活化内源性生长因子的BMP来引发骨形成级联。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物来加速舟状骨腰骨折的愈合的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建仿生血肿来加速舟状骨腰骨折的愈合以促进更快速恢复的方法，所述仿生血肿通过递送催化量的随后局部超活化内源性生长因子的BMP来引发骨折愈合级联。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物来重建复杂骨骼缺损的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建仿生血肿来重建颅骨中由创伤、肿瘤或感染引起的复杂骨骼缺损的方法，所述仿生血肿通过递送催化量的随后局部超活化内源性生长因子的BMP来引发骨形成级联。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物来加速胸骨切开术的愈合的方法。本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物以通过使用蛇静脉酶创建仿生血肿来加速与心脏直视手术相关的胸骨切开术的愈合以促进更快速恢复的方法，所述仿生血肿通过递送催化量的随后局部超活化内源性生长因子的BMP来引发骨折愈合级联。

本文还公开了在关节置换术部件中使用本文所述的组合物中的任何组合物的方法，所述关节置换部件具有经专门改装的骨向内生长表面，所述经专门改装的骨向内生长表面用蛇静脉酶进行了增强以诱导包埋在结构基板上的仿生血肿的局部形成，所述仿生血肿的局部形成更迅速地引发骨愈合级联。

本文还公开了将本文所述的组合物中的任何组合物与骨整合茎(osseointegration stem)和具有经专门改装的骨向内生长表面的部件一起使用的方法，所述经专门改装的骨向内生长表面用蛇静脉酶进行了增强以诱导包埋在结构基板上的仿生血肿的局部形成，所述仿生血肿的局部形成更迅速地引发骨愈合级联。

如本文所用，术语“仿生血肿”可用于指“离体血肿”。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物减少出血或管理出血的方法。

本文还公开了在外科手术程序期间使用本文所述的组合物中的任何组合物来管理广泛的静脉出血/渗血的方法。在一些方面中，在本文所公开的方法中，本文所述的组合物中的任何组合物均可被配制成以水性气溶胶形式局部喷洒(使用雾化器将蛇静脉酶分配到受累区域)。

本文还公开了在手术进行中或在紧急伤亡情况下使用本文所述的组合物中的任何组合物来管理各个损伤血管(例如，大量出血者)的出血或终止所述各个损伤血管的出血的方法。在一些方面中，在本文所公开的方法中，本文所述的组合物中的任何组合物均可以在珠粒(例如，磁性珠粒)上施用。在一些方面中，在本文所公开的方法中，本文所述的组合物中的任何组合物可以在血管的端部作为夹钳/蛤壳(clamshell)施加，以同时局部夹持和递送蛇静脉酶，从而限制至特定受损血管端的施用。夹具或夹具元件可以束紧相邻的受伤血管，并且可以消除或最小化全身施用组合物的风险。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物作为选择性栓塞的方法。在一些方面中，在本文所公开的方法中，本文所述的组合物中的任何组合物均可以由介入放射科医生使用放射照相引导的长导管递送至一个或多个靶血管以控制或终止骨盆内/腹内/食道/颅内出血，所述长导管随后允许局限于如所指示的离散病理部位(discretepathology)选择性地且高度特异地施用蛇静脉酶(例如，类似于使用血管造影线圈进行的方法)。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物治疗月经过多的方法。在一些方面中，本文所公开的方法可用于指导将本文所述的组合物中的任何组合物安装或放置到受累女性的子宫中。在一些方面中，蛇静脉酶可以被配制成作为一个或多个可生物降解的胶原珠粒的一部分递送。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物治疗血友病相关的自发性关节血肿的方法。在一些方面中，蛇静脉酶可以被配制成作为一个或多个可生物降解的胶原珠粒的一部分递送。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物治疗与抗凝药(例如，华法林、香豆素等)过量有关的自发性关节血肿的方法。在一些方面中，蛇静脉酶可以被配制成作为一个或多个可生物降解的胶原珠粒的一部分递送。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物治疗与抗凝药(例如，华法林、香豆素等)过量有关的自发性肌肉内出血的方法。在一些方面中，在本文所公开的方法中，本文所述的组合物中的任何组合物均可以用作选择性栓塞剂。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物治疗与血友病有关的自发性肌内出血的方法。在一些方面中，在本文所公开的方法中，本文所述的组合物中的任何组合物均可以用作选择性栓塞剂。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物来以任何选择性全膝关节置换术治疗术后关节血肿的方法。在一些方面中，蛇静脉酶可以被配制成作为一个或多个可生物降解的胶原珠粒或纳米粒子的一部分递送。在一些方面中，可以紧接在伤口闭合之前将一个或多个可生物降解的胶原珠粒或纳米粒子大面积地(liberally)递送或撒到关节中。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物治疗鼻衄的方法。在一些方面中，蛇静脉酶可以被配制成作为一个或多个可生物降解的胶原珠粒的一部分递送。在一些方面中，所述可生物降解的胶原珠粒可被包埋在织物包装材料中或者被封装在织物护套内以限制它们的分布并局部牵制它们。在一些方面中，蛇静脉酶可以鼻孔填塞物的形式递送，使得蛇静脉酶被配制为包埋在织物包装材料中或者封装在织物护套内的一个或多个可生物降解的胶原珠粒的一部分。

本文还公开了使用本文所述的组合物中的任何组合物治疗视网膜出血的方法。在一些方面中，在本文所公开的方法中，本文所述的组合物中的任何组合物均可以用作选择性栓塞剂。在一些方面中，蛇静脉酶可以被配制成作为一个或多个可生物降解的胶原珠粒或纳米粒子的一部分递送。在一些方面中，可生物降解的胶原珠粒或纳米离子制剂可用于通过创建自粘的几何形状来创建维可牢(Velcro)型效果，以最小化复发的风险并主动解决视网膜脱离。

在一些方面中，“出血(bleeding)”可能是内出血(hemorrhage)。在一些方面中，血液可从一个或多个受损的血管逸出循环系统。在一些方面中，出血可以是内部的或外部的。

制品

可将本文所述的组合物和离体血肿包装在被标记为例如用于治疗骨缺损的疗法或本文所公开的任何方法的合适容器中。因此，包装的产品(例如，含有本文所述的组合物或离体血肿并以浓缩或即用型浓度包装以供储存、运输、或出售的无菌容器)和试剂盒也在本公开的范围内，所述试剂盒包含如本文所述的至少分离的全血和柠檬酸钠；或富血小板血浆、血浆，或具有红血细胞的血浆；和蛇静脉酶；oscutarin和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙以及使用说明书。产品可以包括含有本文所述的组合物或离体血肿的容器(例如，小瓶、广口瓶、瓶子、袋子等)。另外，制品可进一步包括例如包装材料、使用说明书、注射器、缓冲液，或其他用于治疗或监测需要预防或治疗的疾患的对照试剂。所述产品还可以包括图例(例如，印刷的标签或插入物或描述产品用途的其他介质(例如，录音带或录像带))。该图例可与容器相关联(例如，粘附在容器上)，并且可描述组合物或离体血肿应被施用的方式(例如，施用的频率和路径)、由此导致的适应症，和其他用途。所述组合物或离体血肿可以已准备好用于施用(例如，以剂量合适的单位存在)，并且可包含药学上可接受的佐剂、载体或其他稀释剂。替代地，所述化合物可以以浓缩形式与稀释剂一起提供，并附有稀释使用说明。

实施例

实施例1：血肿的结构和生物学特性。

治疗大节段性骨缺损的途径。公认的是，在骨折部位形成的血肿显著地影响骨折愈合的方式。例如，研究已表明血肿的去除会延迟骨折愈合(Schell H,Peters A,DudaGN.Removal of fracture hematoma and replacement with fresh hematoma delaysbone healing in sheep.Bone.2012)。此外，有报告表明形成的血纤蛋白凝块的结构特性(诸如血纤蛋白纤维的孔隙率和厚度)会影响骨修复(Wang X,Friis TE,Masci PP,Crawford RW,Liao W,Xiao Y.Alteration of blood clot structures by interleukin-1beta in association with bone defects healing.Sci Rep.Nature PublishingGroup；2016；6:35645；和Wang X,Friis T,Glatt V,Crawford R,Xiao Y.J Tissue EngRegen Med.2017；11:2864-2875.)。本文所述的结果证明，在手术后3天，与5mm节段性骨缺损(不经干预不会愈合；320±64nm)相比，从0.5mm大鼠股骨缺损(正常愈合的骨折)中分离出的体内血肿具有35％的更细的血纤蛋白纤维(209±20nm)(图2、图7、图8和图9)。此外，还观察到5mm缺损中的多孔网络与0.5mm缺损中的多孔网络相比较少(42.56％对比50.03％)，从而导致所述组之间的差异为16％。为了研究在大骨缺损(5mm)和正常愈合的骨折(0.5mm)中形成的血肿之间是否存在生物学特性差异，使用RNA测序分析执行体内研究(表1)。

发现介导炎症反应的基因(例如，由活化的巨噬细胞产生的Il1b；在炎症性骨破坏区域中表达的Sdf1，在所述区域中所述基因介导其对破骨细胞生成的抑制效应)存在重大差异，所述介导炎症反应的基因与0.5mm缺损相比在5mm缺损中显著上调。对细胞外基质(ECM)结构成分(例如Col1a1、Col2a1、Col3a1)以及ECM蛋白酶(例如Mmp2)和它们的抑制剂(例如Timp1)重要的基因大部分被下调。相反，调节细胞粘附分子的基因(例如Thbs1)被上调。对参与血管生成过程的基因的分析表明，新血管形成的高效刺激剂血管生成素(Ang)被下调，而血管生成细胞因子内皮素(Edn1)则被上调，所述内皮素是一种强效的血管收缩剂，其还刺激成骨细胞系中的细胞。与骨生成有关的基因的表达表明下调基因中有很大一部分参与成骨细胞分化(例如Bglap，也称为骨钙素，由成骨细胞分泌以引发骨修复)和骨形成(例如Bmp7在间充质细胞向骨和软骨的转化中起关键作用)。

表1.基因调控。

这些结果首次证明了正常愈合的骨折与骨愈合的最早阶段的大骨缺损之间的重要基因表达差异。在参与炎症反应的基因集合中发现了最显著的差异，炎症反应是骨折后的关键事件。炎性基因与0.5mm缺损相比在5mm缺损中上调表明，大骨缺损引起的炎性反应比正常骨折引起的炎性反应强，这导致巨噬细胞、成纤维细胞、MSC和骨祖细胞的募集增加。入侵的炎性细胞还产生促血管生成的细胞因子，这解释了当比较5mm缺损与0.5mm缺损时观察到的上调。同时，许多对骨骼发育、骨矿物质代谢和ECM形成重要的基因的下调揭示大骨缺损中的成骨反应减少。

还进行了体外研究，以确定是否可以使用SVCE、蛇静脉酶产生具有特定结构特性的离体血凝块，并确定蛇静脉酶对干细胞是否有毒性。结果令人信服地表明，血凝块的结构特性根据蛇静脉酶浓度化而变化(图11)。例如，较高浓度的蛇静脉酶导致血纤蛋白纤维变薄，平均厚度为93±3nm，而在最低浓度下，血纤蛋白纤维的厚度为173±9nm。1至7天的细胞增殖速率随着蛇静脉酶浓度的不断增加而降低(图12)。例如，在最高浓度下增加了4.3±0.7倍，而在最低浓度下增加了13.7±3.1倍，相比之下在不存在蛇静脉酶时增加了14.8±2.6倍。在离体血肿内培养的细胞在7天时段内具有稳定的细胞数目。因此，这些结果表明蛇静脉酶不会引起毒性，然而，较高浓度可能导致细胞增殖率较低(图13)。

基于这些观察结果，将进行附加实验以确定愈合的正常骨折中形成的血肿的结构和生物学特性，并将它们与大骨缺损进行比较，所述大骨缺损如果不经干预不会愈合(参见以下实施例)。例如，将研究组织良好的血纤蛋白凝块通过用作供生长因子持续释放用的暂时储存器以及通过提供足够的空间以帮助细胞浸润、增殖和分化来增强骨愈合的能力。因此，增强修复过程的主要机会在于产生模仿愈合骨折血肿的内在特性的血凝块。可以使用SVCE来改变离体产生的血肿的结构特性，从而模仿内在的骨折血肿，所述内在的骨折血肿当植入节段性骨缺损中时将增强并加速骨愈合。各种蛇毒液已成功用于患有心脏病、癌症和中风的患者，以及用于诊断诸如狼疮的疾病。因此，这些实验还首次检查了与添加已经被证明在临床上使用时具有副作用的牛凝血酶相比，蛇毒液酶蛇静脉酶作为替代凝结剂的用途(Diesen DL,Lawson JH.Vascular.2008；16:S29-36；Ofosu FA,Crean S,ReynoldsMW.Clin Ther.2009；31:679–691；以及Sands JJ,Nudo SA,Ashford RG,Moore KD,OrtelTL.Am J Kidney Dis.2000；35:796-801)。这种途径将作为改进的治疗策略进行探索，因为它是一种生物支架，所述生物支架可用于通过完全消除生长因子(诸如BMP)的需要或显著最小化增强骨修复过程所需的剂量来更可靠地增强骨愈合。结果是比目前可用的治疗策略更先天的治疗策略；它将提供显著的成本节省，并且最重要的是，消除许多与高剂量BMP相关联的不良副作用。此外，本文所述的结果可能对公众以及服务人员的骨损伤治疗具有重要意义。

实施例2：体内骨折血肿的结构和生物学特性。

在雄性SAS Fischer大鼠组(10-12周龄，n＝38；n＝5-8只/组)中创建骨缺损，并将其用外固定器稳定化(RISystem AG；Glatt V,Evans CH,Matthys R.Eur CellMater.2012；23:289-98；discussion 299；和Glatt V、Miller M、Ivkovic A、Liu F、ParryN、Griffin D等人，J Bone Joint Surg Am.2012年11月21日；94(22):2063-73)，以表征和比较在正常骨愈合(0.5mm；图3A)和大节段性骨缺损(5mm；图3B)期间形成的血肿的结构和生物学特性。为了评估骨折愈合的过程，执行0.5mm截骨术，所述截骨术也可以使用相同的外部固定装置进行。使用截骨术的原因是它们是可重现的，并且允许血肿形成物的大小更一致，这对于血肿结构特性的表征很重要。在手术后第3天处死动物以评估血凝块成熟后骨折血肿的结构特性(图3A、图3B)。使用扫描电子显微镜(SEM；n＝8只/组)和ImageJ软件评定血肿的结构特性，诸如血纤蛋白纤维的厚度、密度和孔隙率。此外，使用不同的一组样品来使用RNA测序分析参与引发骨修复过程的差异化表达的基因(n＝6只/组)。还将执行组织学和免疫组织化学(IHC)检查(n＝5只/组)，以表征组织并确认参与引发修复过程的关键蛋白(诸如巨噬细胞(CD68、CD40和、CD206)、osterix、PECAM1、vWF、VEGF、I型胶原蛋白)的存在，并执行H&E染色以了解整体组织形态。所述结果用于确定3天大的血肿中的结构特性与特定基因和蛋白质的表达之间是否存在相关性。

扫描电子显微镜。对体内骨折血肿和离体血凝块进行类似的处理。将样本在4％多聚甲醛中固定过夜。使用Hitachi SU1510 VP-SEM以100-1,000倍的放大倍数捕获总体形态。为了分析纤维直径和密度，将样品用4％的四氧化锇后固定，并通过某一梯度的乙醇溶液(25-100％)进行脱水。然后使用Leica EM临界点干燥器干燥血肿和血凝块的切片，将其安装在硅片试样支座上，并用金-钯溅射涂覆，然后以10,000倍成像(Hitachi S5500 SEM/STEM)以便以高分辨率显露结构特性。使用ImageJ分析图像。

RNA测序。RNA并行测序(RNA-Seq)是一种高通量方法，其允许全局测量基因转录本的丰度(Wang Z,Gerstein M,Snyder M.RNA-Seq:A revolutionary tool fortranscriptomics.2009.，第57-63页)。为了确定骨折血肿中基因的差异表达，将样品收集到微量离心管中，立即在液氮中速冻并在-80℃下储存。按照制造商的方案，使用QiagenRNeasy Plus Universal Tissue Mini(Qiagen,Inc.,Germantown,MD,USA)执行RNA提取。使用纳滴分光光度计(ND-1000,Thermo Fisher Scientific,Inc.)测定RNA的浓度和质量，并根据制造商的方案使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies,Inc.,SantaClara,CA,USA)评定RNA完整性。将被取出以创建5mm骨缺损的骨圆柱体用作对照，从而代表健康骨的基因表达状态。使用全局转录组分析来鉴定在骨修复引发过程中有重要影响的上调和/或下调基因。这项工作是使用llumina HiSeq 3000执行的。

组织学和免疫组织化学。样品将用苏木精和曙红染色以观察总体组织形态。将标准免疫组织化学方案应用于石蜡包埋的切片(5μm)。将用一组抗体标记所述切片以确定诸如以下的蛋白质的空间表达：巨噬细胞(CD68和CD206)、osterix、PECAM1，II型胶原、X型胶原(Maes C、Kobayashi T、Selig MK、Torrekens S、Roth SI、Mackem S等人，Osteoblastprecursors,but not mature osteoblasts,move into developing and fracturedbones along with invading blood vessels.Dev Cell.Elsevier Ltd；2010；19:329-344)。

为了进行这些实验，使用5mm和0.5mm的股骨缺损模型，并用所描述的外部固定装置稳定化。这是完善确立的研究模型。所使用的主要结局度量是扫描电子显微镜、RNA测序和组织学/免疫组织化学，这些是常规程序。如本文所公开，使用SEM的数据(图2、图7、图8和图9)和RNA测序分析表明，与5mm缺损相比，0.5mm缺损中形成的血肿在结构和生物学特性上存在明显差异(表1)。

图7至图9示出了扫描电子显微镜图像，其描述了骨折血肿的结构特性。这些数据显示了正常愈合的骨折(0.5mm)与大骨缺损(5mm)之间存在明显的结构差异。正常骨折(0.5mm)显示出多孔性更高、密度较低并且厚度更薄的血纤蛋白纤维，以及更粗糙的表面。较大的骨缺损(5mm)显示出多孔性更低、密度更低并且厚度更厚的血纤蛋白纤维，以及光滑的表面。

实施例3：使用蛇毒液凝血酶的离体形成的血凝块/血肿的结构特性。

使用SVCE、蛇静脉酶改变血凝块的结构特性，以试图模仿使用各种浓度的蛇静脉酶在0.5mm截骨术模型中形成的自然血肿的特性。在安乐死时，使用21号针头通过心脏穿刺从实施例2中使用的相同动物中收集全血。每只动物的预期血液产量为约5-10mL。将所述血液以一份4％柠檬酸钠溶液比九份血液混合，以预防凝固。从锯鳞蝰毒液纯化的酶，即蛇静脉酶，购自Sigma(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO,USA)。诸如pH、离子强度和钙的变量保持恒定，而对于最终浓度，促血栓形成酶的施加范围为从皮克到纳摩尔。将氯化钙(CaCl

离体血凝块的制备。为了创建离体血凝块，在安乐死时通过心脏穿刺从麻醉的大鼠中收集5-10mL全血。收集后立即将血液与4％柠檬酸钠溶液9:1混合以防止凝固。使用一系列不同浓度的蛇静脉酶来诱导血液凝结。将样本在室温下放置2小时以允许完全凝固。随后，将离体血凝块在4％PFA中于4℃固定过夜，然后进行处理以供用于扫描电子显微镜。

扫描电子显微镜。体内骨折血肿和离体血凝块基本上以相同的方式加以处理。将样本在4％多聚甲醛中固定过夜。使用Hitachi SU1510VP-SEM以100-1,000倍的放大倍数捕获总体形态。为了分析纤维直径和密度，将样品用4％的四氧化锇后固定，并通过某一梯度的乙醇溶液(25-100％)进行脱水。然后使用Leica EM临界点干燥器干燥血肿和血凝块的切片，将其安装在硅片试样支座上，并用金-钯溅射涂覆，然后以10,000倍成像(HitachiS5500 SEM/STEM)以便以高分辨率显露结构特性。使用ImageJ分析图像。如本文所公开的，使用SVCE、各种浓度的蛇静脉酶来改变血凝块(离体血肿)的结构特性，其中使用全血或富血小板血浆(PRP)来试图模仿在0.5mm截骨模型中形成的血肿的特性。将Ecarin(0.1U/mL和0.5U/mL)或CaCl

图10至图11示出了扫描电子显微镜图像，其描绘了离体蛇液毒诱导的离体血肿的结构特性。这些结果表明，血凝块的形态可以使用影响血纤蛋白纤维的厚度和密度的蛇毒液酶或氯化钙来操纵(图11)，并且离体血肿的结构特性在利用全血创建的离体血肿与利用PRP创建的离体血肿(图10)之间是不同的。

实施例4：确定这种离体血肿是否为间充质干细胞(MSC)提供可行的环境。

将执行这些实验以确定在蛇静脉酶存在下以及当接种在蛇静脉酶诱导的血凝块内时MSC存活的能力，以评定这些支架的生物相容性。将在2D和3D测定中测量各种浓度的蛇静脉酶的细胞活力和潜在细胞毒性。将在不同浓度的蛇静脉酶存在下培养大鼠骨MSC，以确定细胞活力。将在第1天、第7天、第14天和第21天测量细胞增殖(例如，CyQUANT

为了测试蛇静脉酶诱导的血凝块的生物相容性，将在第1天、第7天、第14天和第21天从培养物中取出样本(n＝3个/组)以研究接种的细胞的存活率和分化潜能，以及它们形成细胞外基质的能力。此外，将确定血凝块中使骨组织的再生能力最大化所需的细胞数目。将使用

为了测试细胞的分化能力，将在脂肪形成、软骨形成和成骨分化培养基中培养细胞。将使用qRT-PCR来确定在选定时间点处的基因差异表达。一旦确定了细胞活力，就将在0.5mm缺损/截骨术骨愈合期间最类似于自然血肿的结构和生物学特性的血肿植入大鼠体内5mm股骨缺损模型中，以研究其修复大节段性骨缺损的能力。基于图5A、图B中的结果，预期使用较低浓度的凝固酶(＜0.5U/mL)蛇静脉酶将对细胞无毒。

细胞培养。将根据标准方案培养大鼠骨髓干细胞。培养基将每3-4天更换一次。

2D细胞活力测定。在第1天、第3天和第7天将PrestoBlue

2D细胞毒性测定。将在96孔板中培养大鼠骨髓干细胞。在第1天、第3天和第7天，将收集上清液，并将其用来根据制造商的说明书(Pierce LDH细胞毒性测定试剂盒，ThermoFisher Scientific AG,Reinach BL,Switzerland)测定乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性。使用酶标仪，将在490nm处测量吸光度，并在680nm处进行背景扣除。

3D离体血凝块的活/死染色和共聚焦显微分析。将在3D血凝块内培养大鼠骨髓干细胞。在第1天、第3天和第7天时，将血凝块从培养基中取出并矢状地切成两半，然后将其浸入24孔板中含有10μM钙黄绿素AM储备液和1μM乙锭均二聚物-1(Thermo FisherScientific,Inc.)的无血清培养基中。在5％CO

3D细胞分化测定。将经细胞接种的血凝块根据制造商的方案在脂肪形成、软骨形成和成骨培养基(

实时定量PCR(qRT-PCR)。将离体血凝块收集到微量离心管中，立即在液氮中速冻并在-80℃下储存。将按照制造商的方案，使用Qiagen RNeasy Plus Universal TissueMini(Qiagen,Inc.,Germantown,MD,USA)执行RNA提取。将使用纳滴分光光度计(ND-1000,Thermo Fisher Scientific,Inc.)测定RNA的浓度和质量，并将根据制造商的方案使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA,USA)评定RNA完整性。将使用TaqMan

如本文所公开的，将进一步研究骨髓MSC在蛇静脉酶存在下存活的能力，以及在接种在蛇静脉酶诱导的血凝块内时存活的能力，以评定这些支架的生物相容性。使用各种浓度的来源于蛇毒液的凝固酶对添加至离体血凝块中的MSC没有毒性(图12至图13)。所述蛇静脉酶是高度纯化的。因此，可以预期，一旦将离体血肿植入体内，蛇静脉酶便对迁移细胞没有毒性。此外，在大鼠模型中执行了体内实验，所述实验证明了2种不同浓度(0.3U/ml和0.6U/ml)的蛇静脉酶不会引起毒性(图14D至图14F)。然而，如果蛇静脉酶被证明为由于创建人类受试者的具有特定结构和生物学特性的血凝块需要较高的浓度而对细胞具有毒性，则氯化钙或本文所述的其他凝固因子将被认为是凝结剂。如本文所提及，凝固酶先前已被用于激活富血小板血浆中的凝固级联；然而，该产品显示出不良的骨修复性能(Diesen DL,Lawson JH.Vascular.2008；和Sands JJ,Nudo SA,Ashford RG,Moore KD,Ortel TL.Am JKidney Dis.2000；35:796-801)。这可能与以下事实有关：添加到PRP中的凝血酶仅用作活化剂，而未考虑凝块的结构特性。在一些方面中，可以添加小剂量的生长因子，诸如VEGF、PDGF、hFGF-2或BMP-2(其他BMP)。

图12至图13示出了扫描电子显微镜图像，其描绘了离体蛇毒液诱导的离体血肿的结构特性。这些结果表明，蛇毒液酶的存在并未显著影响细胞活力，揭示了生物相容性。

实施例5：在大鼠股骨5mm大临界大小缺损模型中研究将离体产生的离体血肿插入到大骨缺损中是否可增强骨再生过程。

在雄性SAS Fischer大鼠组中创建5mm的股骨缺损(10-12周大，n＝8-16；初步研究n＝4；离体血肿，BMP-2，PRP)，并如本文所述的那样用外固定器稳定化。将离体血肿植入骨间隙中，以确定其增强大节段性骨缺损愈合的能力(图6)。使用两个对照组来与实验组进行骨愈合过程比较。使用在可吸收的胶原海绵上递送的重组人BMP-2增强了第一对照组中的愈合，所述可吸收的胶原蛋白海绵与目前临床上使用的产品(

手术。如本文所述的那样执行大鼠手术。

用于植入的离体血肿的制备。为了创建离体血凝块，在安乐死时通过心脏穿刺从麻醉的大鼠中收集5-10mL全血。收集后立即将血液与4％柠檬酸钠溶液9:1混合以防止凝固。将蛇静脉酶以先前确定的0.3U/ml和0.6U/ml的浓度与0.55μg的rhBMP-2组合使用以诱导血液凝结。让样本在22℃(室温)下凝结45分钟至1小时，然后将其植入到5mm大鼠骨缺损中。

富血小板血浆(PRP)的制备和BMP-2。为了从大鼠血液制备PRP，在安乐死时通过心脏穿刺从麻醉的大鼠中收集5-10mL全血。收集后立即将血液与4％柠檬酸钠溶液9:1混合以防止凝固。用软刹车(soft brake)将全血在室温下以150x g离心10分钟，以使血小板层与血浆和红血细胞分离。将下部红血细胞层弃去，与此同时收集中间血小板层和上部血浆层。使用细胞计数室确定全血和PRP中的血小板数量，以检查PRP的质量。添加氯化钙以创建PRP凝胶，然后将所述PRP凝胶植入缺损间隙中。将重组人BMP-2(5.5μg)施加到呈骨缺损形状的可吸收的胶原海绵载体(Infuse

骨愈合评定。每组十六只动物中的股骨将通过每周X射线进行体内评定，并在安乐死后通过μCT进行评定。使十二个样本经受生物力学测试，并且四个样本将用于组织学。为了进行初步研究，每组使用4只动物。

X射线。通过每周放射照相来监测骨愈合。在如在外科手术程序中所描述的全身麻醉下，将大鼠置于腹侧位置，并将后肢横向旋转以允许产生与缺损垂直的可再现并且标准的图像。

微型计算机断层扫描(μCT)。将使用配备有10mm焦点微聚焦X射线管的台式显微断层成像系统(Bruker Skyscan 1172,Belgium)对股骨进行扫描。将使用16μm的各向同性体素大小以75keV能量和250ms积分时间扫描股骨，其中每个标本约600μCT切片。将评估应用于4mm中央缺损区域中，以确保分析中不包括先前存在的皮质骨。为了评估感兴趣的区域，将评定以下变量：缺损的总横截面体积(TV，mm

机械测试。在进行非侵入性成像后，将对来自每组的12个标本进行扭转破坏测试。将每个标本的端部包埋在聚甲基丙烯酸甲酯中，以提供与测试模块的适当且可再现的夹持界面。将在常规变形控制下并以5rad/min的恒定变形速率对标本进行破坏测试。将在10Hz处获取角度变形和施加的载荷数据。将使用扭矩和旋转数据来计算愈合的缺损的扭转刚度和强度。

骨样本的组织学。将股骨(n＝4)在冰冷的4％多聚甲醛中固定48小时，然后在14％EDTA中脱钙长达4周。将销钉从骨上去除，然后进行包埋和切片。将经固定和脱钙的组织在至多100％的梯度乙醇中脱水，转移至二甲苯中，并包埋在石蜡中。将五微米的石蜡切片放置在聚L-赖氨酸包被的载玻片上，干燥过夜并立即染色，或在4℃下储存。将替代切片将用苏木精和曙红或番红花O和固绿染色，然后通过光学显微镜进行检查。番红花O被纳入软骨染色，作为监测软骨内骨化过程的一部分。

功效分析和统计。所有各个组的样本量均基于所收集数据类型中15％的变异系数，并且使用0.05的α水平和80％的功效(β＝0.20)。功效分析显示，每组n＝8-16只动物将允许使用学生t检验，基于效应大小1.3，来针对每个结局参数检测各组之间的显著差异。使用这些大鼠模型的先前经验证实，n为10可以提供足够的统计力量。体外实验将一式三份执行，并使用ANOVA检验比较其统计显著性。使用nQuery Advice软件程序的4.0版本(Statistical Solutions,Boston,MA)来确定样本大小和功率计算。将使用SAS 6.12版软件(SAS Institute,Cary,NC)执行统计分析。双尾p<0.05将被视为具有统计学意义。

用于确定体外剂量反应的实验对于创建具有模仿自然愈合的骨折血肿的结构特性的特定结构特性的离体血肿很重要。如果仅使用离体血凝块无法实现愈合，则将离体血肿与大鼠骨髓间充质干细胞(与目前临床上使用的超生理剂量相比明显减少的量的rhBMP-2)，或其他生长因子组合。

如本文所公开的，来自8周和4周(具有0.6U/mL+0.55μg BMP-2的组)骨缺损愈合时间结束时的体内研究的体内结果(图14A至图14F)清楚地证明了在所测试的凝固因子浓度下，全血+蛇静脉酶(0.1U/mL)(图14A)和富血小板血浆(PRP)+CalCl

实施例6：仿生血肿：与rhBMP-2/ACS相比，凝固剂和rhBMP-2浓度对骨愈合的影响。

一系列浓度的凝固剂、蛇静脉酶和钙/凝血酶以及BMP-2被测试并且展示出引发大节段性骨缺损的愈合的能力。所测试的蛇静脉酶的浓度包括0.3U/mL、0.6U/mL和0.75U/mL，并且这些浓度成功地引发了愈合(图15，第4栏至第8栏)；然而，0.6U/mL浓度的蛇静脉酶显示出所测试剂量的最佳结果。同样地，凝固剂组合10mM CaCl