微珠及其用途

背景技术

质谱流式细胞技术(Mass Cytometry)是一种基于元素分析的质谱技术，其已被用于测定细胞。在该方法中，细胞亲和分子(例如抗体)与元素缀合，并且这些细胞亲和分子进一步用于标记靶细胞，该靶细胞进一步进行质谱流式细胞技术，并基于元素的信号进行分析。与传统流式细胞术相比，该方法利用元素或同位素代替荧光作为报告系统，这提供了更宽的谱，同时维持了其高准确性和灵敏度。

生物分子的检测和/或鉴定在医学领域(包括诊断学、毒理学和病理学)中是必需的。生物分子检测和分析技术的发展在了解健康、疾病和治疗机制方面带来了前所未有的进步。然而，这些技术的不足主要与灵敏度、准确性、选择性以及同时测定多分析物的量的能力方面的限制有关。需要一种以更准确、成本有效且高通量的方式检测生物分子的方法。

发明内容

本文认识到，需要一种以准确、成本有效且高通量的方式同时检测多种生物分子的方法和组合物。本发明解决了这种需要，并且也提供了相关的优点。

在一方面，提供了一种微珠，其在微珠基底表面上包含多个官能团，其中多个官能团的第一子集附接至能够与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联。在一些实施方案中，微珠基底由聚合物形成，该聚合物选自聚苯乙烯(PS)、聚苯乙烯-甲基丙烯酸(PSMAA)、聚苯乙烯-二乙烯基苯(P[S/DVB])、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)及其任何组合。在一些实施方案中，微珠基底由聚苯乙烯(PS)形成。在一些实施方案中，微珠的直径在50nm-10μm之间。在一些实施方案中，微珠的直径在1-3μm之间。在一些实施方案中，官能团选自羧基、巯基、氨基、羟基、马来酰亚胺、叠氮、炔基、生物素及其任何组合。在一些实施方案中，官能团是羧基。

在一些实施方案中，微珠在其表面上包含10

在一些实施方案中，亲和部分选自肽、蛋白质、适体、抗体、酶、亲和素、链霉亲和素、碳水化合物、核酸、脱氧核糖核酸、寡核苷酸、多肽、重组蛋白、核糖核酸脂质及其衍生物。在一些实施方案中，抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、Fab片段、Fc片段、轻链、重链、免疫球蛋白和免疫球蛋白片段。在一些实施方案中，亲和部分直接与官能团偶联。在一些实施方案中，亲和部分经由间隔区(spacer)与官能团偶联。在一些实施方案中，间隔区包括至少2个不同的间隔区。在一些实施方案中，间隔区选自MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼)或NH

在一些实施方案中，微珠的螯合基团进一步与元素标签螯合。在一些实施方案中，元素标签包含元素或元素的组合。在一些实施方案中，元素的组合是两种或更多种元素的组合。在一些实施方案中，元素的组合是三种或更多种元素的组合。在一些实施方案中，元素是金属或其同位素。在一些实施方案中，金属选自Y、Ru、Rh、Pd、Cd、In、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Rn、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、Mt、Ds、Rg、Cn、Nh、Fl、Mc、Lv、Ts和Og。在一些实施方案中，同位素选自Y-89、Rh103、Pd-102、Pd-104、Pd-105、Pd106、Pd-108、Pd-110、Cd-106、Cd-108、Cd-110、Cd-111、Cd-112、Cd-113、Cd-114、Cd-116、In-115、La-139、Ce-140、Ce-142、Pr-141、Nd-142、Nd-143、Nd-144、Nd-145、Nd-146、Nd-148、Nd-150、Sm-144、Sm-147、Sm-148、Sm-149、Sm-150、Sm-152、Sm-154、Eu-151、Eu-153、Gd-154、Gd-155、Gd-156、Gd-157、Gd-158、Gd-160、Tb-159、Dy-160、Dy-161、Dy-162、Dy-163、Dy-164、Ho-165、Er-164、Er-166、Er-167、Er-168、Er-170、Tm-169、Yb-170、Yb-171、Yb-172、Yb-173、Yb-174、Yb-176、Lu-175、Lu-176和Bi-209。

在另一方面，提供了一种制备组合标记微珠的方法，其包括：(a)提供聚合物微珠基底；(b)使聚合物微珠基底官能化，以在聚合物微珠基底表面上提供多个官能团；(c)使螯合基团与(b)中的聚合物微珠基底反应，以使螯合基团附接至聚合物微珠基底表面上的官能团的第一子集；(d)使亲和部分与(b)中的聚合物微珠基底反应，以使亲和部分与聚合物微珠基底表面上的官能团的第二子集偶联。在一些实施方案中，该方法进一步包括将元素标签螯合至螯合基团。在一些实施方案中，元素标签包含元素或元素的组合。在一些实施方案中，元素的组合是两种或更多种元素的组合。在一些实施方案中，元素的组合是三种或更多种元素的组合。在一些实施方案中，元素是金属或其同位素。在一些实施方案中，聚合物微珠基底通过苯乙烯、苯乙烯-甲基丙烯酸(SMAA)、苯乙烯-二乙烯基苯(S/DVB)和甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的聚合来提供。

在一些实施方案中，在聚合物微珠基底表面上提供了10

在一些实施方案中，螯合基团经由间隔区附接至官能团。在一些实施方案中，间隔区选自MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼)或NH

在一些实施方案中，亲和部分经由间隔区与官能团偶联。在一些实施方案中，间隔区选自MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼)或NH

在另一方面，提供了一种微珠群体，其包含微珠的两个或更多个亚群，其中微珠中的至少一个在微珠基底表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联；其中微珠的至少一个亚群包含不同于微珠的至少另一个亚群的元素标签，并且微珠的至少一个亚群包含不同于微珠的另一个亚群的亲和部分。

在一些实施方案中，元素标签是元素的组合。在一些实施方案中，元素的组合是两种或更多种元素的组合。在一些实施方案中，元素的组合是三种或更多种元素的组合。在一些实施方案中，元素是金属或其同位素。在一些实施方案中，微珠的每个亚群的元素标签在元素分析中充当微珠的亲和部分的条形码。

在一些实施方案中，元素分析是MS。在一些实施方案中，MS选自ICP-MS、ICP-TOF-MS和质谱流式细胞技术。在一些实施方案中，微珠群体的可变直径系数(CVd)小于10％。在一些实施方案中，微珠群体的可变直径系数(CVd)小于5％。

在另一方面，提供了一种用于检测样品中的分析物的方法，其包括：(a)使样品与微珠接触，其中微珠在微珠基底表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至分析物的亲和部分偶联；(b)区分结合至分析物的微珠和未结合至分析物的微珠；(c)测定样品中的分析物。

在一些实施方案中，区分包括将微珠与固定试剂一起温育，其中固定试剂特异性结合至分析物并将结合至分析物的微珠固定。在一些实施方案中，该方法进一步包括分离结合至分析物的微珠。在一些实施方案中，区分包括将微珠与检测试剂一起温育，其中检测试剂特异性结合至分析物并允许检测结合至分析物的微珠。在一些实施方案中，该方法进一步包括从样品中分离微珠。在一些实施方案中，检测试剂选自肽、蛋白质、适体、抗体、酶、碳水化合物、核酸、脱氧核糖核酸、寡核苷酸、多肽、重组蛋白、核糖核酸脂质及其衍生物。在一些实施方案中，检测试剂是抗体。

在一些实施方案中，检测试剂用检测元素标签标记。在一些实施方案中，检测元素标签是金属或其同位素。在一些实施方案中，金属选自Y、Ru、Rh、Pd、Cd、In、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Rn、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、Mt、Ds、Rg、Cn、Nh、Fl、Mc、Lv、Ts和Og。在一些实施方案中，同位素选自Y-89、Rh103、Pd-102、Pd-104、Pd-105、Pd106、Pd-108、Pd-110、Cd-106、Cd-108、Cd-110、Cd-111、Cd-112、Cd-113、Cd-114、Cd-116、In-115、La-139、Ce-140、Ce-142、Pr-141、Nd-142、Nd-143、Nd-144、Nd-145、Nd-146、Nd-148、Nd-150、Sm-144、Sm-147、Sm-148、Sm-149、Sm-150、Sm-152、Sm-154、Eu-151、Eu-153、Gd-154、Gd-155、Gd-156、Gd-157、Gd-158、Gd-160、Tb-159、Dy-160、Dy-161、Dy-162、Dy-163、Dy-164、Ho-165、Er-164、Er-166、Er-167、Er-168、Er-170、Tm-169、Yb-170、Yb-171、Yb-172、Yb-173、Yb-174、Yb-176、Lu-175、Lu-176和Bi-209。

在一些实施方案中，测定分析物包括测定样品中分析物的身份。在一些实施方案中，测定分析物的身份通过分析元素标签的身份来进行。在一些实施方案中，测定分析物包括定量样品中分析物的量。在一些实施方案中，定量分析物的量通过分析检测元素标签来进行。在一些实施方案中，测定分析物通过元素分析来进行。在一些实施方案中，元素分析是MS。在一些实施方案中，MS选自ICP-MS、ICP-TOF-MS和质谱流式细胞技术。

在一些实施方案中，样品从对象获得。在某些实施方案中，样品是体液。在一些实施方案中，体液选自全血、血浆、血清、尿、渗出液、腹水、唾液、脑脊液、宫颈分泌物、阴道分泌物、子宫内膜分泌物、羊水、胃肠分泌物、包括痰的支气管分泌物、乳腺液和分泌物。在一些实施方案中，分析物是用于预测或诊断疾病的一种或多种生物标志物。在一些实施方案中，生物标志物选自细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白质、肽、核酸、寡核苷酸和代谢物。

在另一方面，提供了一种对样品中的两种或更多种分析物进行多重分析的方法，其包括：(a)使微珠群体与样品接触，其中微珠中的至少一个在微珠基底表面上包含多个官能团；多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团；多个官能团的第二子集与能够结合至两种或更多种分析物中的分析物的亲和部分偶联，其中微珠的至少一个亚群包含不同于微珠的至少另一个亚群的元素标签，并且微珠的至少一个亚群包含不同于微珠的另一个亚群的亲和部分；(b)将微珠群体与两种或更多种检测试剂一起温育，其中检测试剂中的每一种允许检测结合至分析物的微珠；(c)同时分析样品中的两种或更多种分析物。在一些实施方案中，元素标签是元素的组合。在一些实施方案中，元素的组合是两种或更多种元素的组合。在一些实施方案中，元素的组合是三种或更多种元素的组合。在一些实施方案中，该方法进一步包括从样品中分离微珠。在一些实施方案中，检测试剂用检测元素标签标记。

在一些实施方案中，分析两种或更多种分析物包括测定样品中两种或更多种分析物的身份。在一些实施方案中，测定两种或更多种分析物的身份通过分析元素标签的身份来进行。在一些实施方案中，分析两种或更多种分析物包括定量样品中两种或更多种分析物的量。在一些实施方案中，定量两种或更多种分析物的量通过分析检测元素标签来进行。在一些实施方案中，分析两种或更多种分析物通过元素分析来进行。在一些实施方案中，元素分析是MS。在一些实施方案中，MS选自ICP-MS、ICP-TOF-MS和质谱流式细胞技术。

在一些实施方案中，样品从对象获得。在某些实施方案中，样品是体液。在一些实施方案中，体液选自全血、血浆、血清、尿、渗出液、腹水、唾液、脑脊液、宫颈分泌物、阴道分泌物、子宫内膜分泌物、羊水、胃肠分泌物、包括痰的支气管分泌物、乳腺液和分泌物。在一些实施方案中，两种或更多种分析物中的每一种是用于预测或诊断疾病的生物标志物。在一些实施方案中，生物标志物选自细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白质、肽、核酸、寡核苷酸和代谢物。

在另一方面，提供了一种试剂盒，其包含：(1)说明书，用于通过使用试剂盒对两种或更多种分析物进行多重分析，(2)微珠群体，其包含微珠的两个或更多个亚群，其中微珠中的至少一个在微珠基底表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联，并且其中微珠的至少一个亚群包含不同于微珠的至少另一个亚群的元素标签，并且微珠的至少一个亚群包含不同于微珠的另一个亚群的亲和部分，以及(3)两种或更多种检测试剂，其中检测试剂中的每一种包括检测元素标签，并且特异性结合至两种或更多种分析物中的分析物。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确且单独地表明通过引用并入。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中特别阐述。通过参照以下阐述其中利用了本发明原理的说明性实施方案的详细描述和附图，将更好地理解本发明的特征和优点。在附图中：

图1示出了本发明的微珠的示意图。

图2A示出了用于将亲和部分与微珠表面上的官能团偶联的示例性过程。图2B示出了用于将螯合基团附接至微珠表面上的官能团的示例性过程。图2C示出了可用于将亲和部分缀合至微珠表面上的官能团的示例性间隔区。

图3示出了通过使用ICP-TOF-MS对具有组合元素标签(141Pr、159Tb和166Ho)的微珠进行分析。

图4示出了通过使用质谱流式细胞技术对具有组合元素标签(141Pr、159Tb和166Ho)和小鼠IgG(用169Tm标记)的微珠进行分析。

图5A示出了微珠与不同浓度的小鼠IgG的偶联效率。图5B示出了线性坐标中检测元素标签的定量。图5C示出了对数坐标中检测元素标签的定量。

图6A示出了通过质谱流式细胞技术使用微珠对样品中人TNFα的检测。图6B示出了通过质谱流式细胞技术使用微珠对样品中人TNFα的定量。

图7示出了通过质谱流式细胞技术对具有不同组合元素的微珠的检测，其中黄色箭头表示具有141Pr、159Tb、169Tm(无165Ho)组合的元素标签并与CD3引物偶联的微珠的信号，红色箭头表示具有141Pr、165Ho、169Tm(无159Tb)组合的元素标签并与CD4引物偶联的微珠的信号，绿色箭头表示具有141Pr、159Tb、165Ho(无169Tm)组合的元素标签并与CD19引物偶联的微珠的信号。

图8A-图8C示出了分别包含H

具体实施方式

在描述本发明的实施方案之前，应理解，这些实施方案仅作为实例提供，并且在实践本发明时，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的方法和材料相似或等同的那些，但下文描述了合适的方法和材料。在冲突的情况下，以专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而非限制性的。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。

除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“基团”包括多个这种基团，提及“单体”包括多个这种单体，提及“悬垂部分”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种悬垂部分(或多个悬垂部分)及其等效物等。

本文中的术语“约”或“近似”是指在本领域普通技术人员测定的特定值的可接受误差范围内，其将部分取决于如何测量或测定该值，即，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以指在1个或多于1个标准偏差内。可替代地，“约”可以指给定值的多达20％、多达10％、多达5％或多达1％的范围。在本申请和权利要求中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应假定术语“约”或“近似”是指在特定值的可接受误差范围内。

当范围在本文中用于物理特性(例如直径)或化学特性(例如官能团)时，范围的所有组合和子组合以及其中的具体实施方案都包括在内。在提供了值的范围的情况下，应理解，除非上下文另外明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的每一个中间值至下限单位的十分之一以及所述范围内的任何其他陈述或中间值被涵盖于本文提供的本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本发明内，在所述范围中受到任何明确排除的限制。在所述范围包括限制中的一个或两个的情况下，排除那些包括的限制中的任一个或两个的范围也包括在本文提供的本发明中。

如本文所用，术语“和/或”是功能词，以表示两个词或表达将一起或单独使用。例如，A和/或B涵盖单独的A、单独的B，以及A和B一起。

术语“包含(comprising)”(以及相关术语，例如包含(comprise、comprises)”、“具有(having)”或“包括(including)”)不旨在排除在其他实施方案(例如，本文所述的物质、组合物、方法或过程等的任何组合物的实施方案)中，可以“由所述特征组成”或“基本上由所述特征组成”。

如本文所用，术语“微珠”是指由有机聚合物组成的微米大小的单分散颗粒。它在元素分析中充当待分析的元素标签和靶分子的载体。大小在10nm-1mm之间的范围内的任何合适的颗粒可用作本发明的微珠。例如，本发明的微珠可以是大小在10nm-1mm之间、10nm-100μm之间、0.1μm-10μm之间或中间任何范围内的颗粒。

如本文可互换使用的，术语“官能团”、“反应性基团”和“反应性部分”是指分子内负责那些分子的特征性化学反应的特定取代基或部分。相同的官能团将经历相同或相似的化学反应，而与其一部分分子的大小无关。

如本文所用，术语“螯合基团”是指包含能够结合至原子或离子并且能够附接至本发明微珠表面上的官能团的官能部分的分子组成。螯合基团的官能部分的实例包括但不限于2-氨基甲基吡啶、亚氨基乙酸、亚氨基二乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、羰基亚氨基二乙酸、亚甲基亚氨基乙酸、亚甲基亚氨基二乙酸、亚乙基硫代亚乙基亚氨基乙酸、亚乙基硫代亚乙基亚氨基二乙酸、TMT、三联吡啶基团、包含三联吡啶基团和羧甲基氨基基团的螯合剂，或前述酸中任一种的盐。特别优选的螯合基团是DTPA、DTPA-BMA、DPDP、TMT、DOTA和HPDO3A。

如本文所用，术语“元素”是指能够与微珠表面上的螯合基团螯合的任何化学元素或同位素。元素的实例包括但不限于Y、Ru、Rh、Pd、Cd、In、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Rn、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、Mt、Ds、Rg、Cn、Nh、Fl、Mc、Lv、Ts、Og或其同位素。同位素的实例包括但不限于Y-89、Rh103、Pd-102、Pd-104、Pd-105、Pd106、Pd-108、Pd-110、Cd-106、Cd-108、Cd-110、Cd-111、Cd-112、Cd-113、Cd-114、Cd-116、In-115、La-139、Ce-140、Ce-142、Pr-141、Nd-142、Nd-143、Nd-144、Nd-145、Nd-146、Nd-148、Nd-150、Sm-144、Sm-147、Sm-148、Sm-149、Sm-150、Sm-152、Sm-154、Eu-151、Eu-153、Gd-154、Gd-155、Gd-156、Gd-157、Gd-158、Gd-160、Tb-159、Dy-160、Dy-161、Dy-162、Dy-163、Dy-164、Ho-165、Er-164、Er-166、Er-167、Er-168、Er-170、Tm-169、Yb-170、Yb-171、Yb-172、Yb-173、Yb-174、Yb-176、Lu-175、Lu-176和Bi-209。镧系金属是优选的，因为它们在环境中的丰度低。在一些实施方案中，金属是镧系金属，并且选自La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu或其同位素。

如本文所用，术语“标签”是指用于鉴定和/或定量靶分子的分子或其部分。标签可以直接或间接附接至靶分子。标签可以通过接头或本文的微珠附接至靶分子。标签可以直接或间接附接至本文公开的微珠。标签可以通过本文公开的官能团附接至微珠。本发明的标签可以包含允许对其所附接的靶分子进行鉴定、识别和/或定量的元素或元素的组合。在一些实施方案中，标签可以进一步包含其他指示剂，例如荧光指示剂，例如，荧光染料。将标签附接至靶分子或微珠的过程有时在本文中称为“标记”，并且经历标记或含有标签的分子或微珠称为“标记的”(例如，“标记的微珠”)。当本发明的标签由用于同时检测样品中多个靶分子的元素的组合组成时，该标签也可称为“条形码”。

如本文所用，术语“条形码”是指包含允许同时鉴定多于一种分析物的多个元素标签的组合的标签。元素标签的预定组合以及一个或多个特定元素标签的存在或不存在可用于鉴定某一分析物的存在或不存在。与分析物结合的每个元素标签的相对丰度也可用于测定分析物的绝对或相对丰度。在一些实施方案中，使用某一条形码来区分标记微珠群体中的微珠亚群。在一些实施方案中，标记微珠亚群的条形码不同于微珠另一个亚群上的至少另一个条形码。在一些实施方案中，微珠群体中微珠的每个亚群的条形码可以彼此不同。

如本文所用，术语“亲和部分”是指可以与微珠表面上的官能团偶联并且能够结合至靶分子以从样品中捕获靶分子的任何分子组成。亲和部分的实例包括但不限于肽、蛋白质、适体、抗体、酶、亲和素、链霉亲和素、碳水化合物、核酸、脱氧核糖核酸、寡核苷酸、多肽、重组蛋白、核糖核酸脂质及其衍生物。

如本文所用，术语“间隔区”是指可用于使亲和部分或螯合基团与微珠表面上的官能团缀合的分子片段。在一些实施方案中，间隔区可以在亲和部分(例如抗体)和微珠之间提供合适的距离，以克服它们之间的空间位阻并降低对亲和部分活性的影响。

术语“MS”(质谱)是分析技术，其电离化学物种并基于它们的质荷比对离子进行分类。本发明可以使用各种类型的MS，包括但不限于带飞行时间质量分析仪的基质辅助激光解吸/电离源(MALDI-TOF)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、加速器质谱(AMS)、原子吸收光谱(AAS)、热电离质谱(TIMS)、四极质谱分析仪、离子阱分析仪、轨道阱分析仪、电喷雾电离质谱(ESI)、傅里叶变换质谱(例如，傅里叶变换离子回旋共振)、串联质谱(MS/MS)、液相色谱质谱(LC/MS)、火花源质谱(SSMS)以及质谱流式细胞技术。

“ICP-MS”(电感耦合等离子体质谱)是一种能够在无干扰低背景同位素上检测浓度低至1015分之一(百万分之一，ppq)的元素(例如金属和非金属)的质谱。这通过用电感耦合等离子体电离样品，然后使用质谱仪分离和定量那些离子来实现。

“ICP-TOF-MS”(飞行时间电感耦合等离子体质谱)也提供高精度和可靠的元素痕量分析检测。为了研究与开发的目的，该方法的检测极限范围为百万分之几(ppm)(用于工业生产应用的常规分析)至十亿分之几(ppb)或万亿分之几(ppt)水平。它还可以鉴定痕量污染和未知化学品。

“质谱流式细胞技术”是下一代流式细胞术平台，其利用元素质谱来检测细胞内或细胞外结合至单细胞上的目的抗原的元素缀合抗体。质谱流式细胞技术可以准确区分不同原子质量的元素(例如金属和同位素)，而无需通道重叠，其改善了对复杂补偿矩阵的需求，并能够同时分析比荧光流式细胞术多得多的细胞特征。

如本文所用，术语“靶分子”是指待分析的多种生物分子中的任一种。靶分子的实例包括但不限于肽、蛋白质、适体、抗体、酶、碳水化合物、核酸、脱氧核糖核酸、寡核苷酸、多肽、重组蛋白、核糖核酸脂质及其衍生物。在一些实施方案中，靶分子的实例包括但不限于RNA、DNA、寡核苷酸、修饰的或衍生的核苷酸、酶、受体、受体配体(例如激素)、抗体、抗原和毒素，以及细胞(包括血细胞和组织细胞)。

如本文所用，术语“分析物”是指样品中存在的目的物质。本发明中可检测的分析物是可由本发明的微珠的亲和部分捕获的那些。分析物的实例包括但不限于细胞因子、激素、生长因子、蛋白质、肽、CD抗原、病毒抗原、抗体、神经营养蛋白、核酸、寡核苷酸以及代谢物。

如本文所用，术语“生物标志物”是指与生物学变化定量或定性相关的分子。临床上，生物标志物可用于预测、诊断疾病或评估对治疗性干预的反应。本发明的生物标志物的实例包括但不限于细胞因子、激素、生长因子、蛋白质、肽、CD抗原、病毒抗原、抗体、神经营养蛋白、核酸、寡核苷酸以及代谢物。

术语“预防(prevention或preventing)”、“治疗(treatment或treating)”或“减轻(palliating)”或“改善(ameliorating)”在本文中可互换使用，并且是指用于获得有益或所需结果(包括但不限于治疗性益处和/或预防性益处)的方法。所述治疗性益处是指根除或改善所治疗的潜在病症。在一些实施方案中，治疗性益处通过根除或改善与潜在病症相关的生理症状中的一种或多种来实现，使得在对象中观察到改善，尽管对象仍患有潜在病症。在一些实施方案中，为了实现预防性益处，组合物可以施用至处于发展中疾病风险的对象或报告疾病生理症状中的一种或多种的对象，即使可能尚未对该疾病作出诊断。

如本文所用，术语“对象”、“个体”或“患者”是指可用于本发明的任何动物，包括但不限于人、灵长类动物、啮齿动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、绵羊、猪等。

如本文所用，术语“体内”是指在对象身体里发生的事件。

如本文所用，术语“体外”是指在对象身体外发生的事件。在一些实施方案中，体外试验涵盖对象试验以外进行的任何试验。体外试验涵盖基于细胞的试验，其中使用活的或死的细胞。体外试验也涵盖无细胞试验，其中不使用完整细胞。

在单个试验中同时检测和定量多个生物分子可显著提高生物分析的效率。然而，检测的重大挑战包括从少量样品中捕获足够的分析物以及用具有高灵敏度和准确性的方法检测分析物。

在一方面，本文提供了一种用于检测和定量样品中的分析物或靶分子的微珠。微珠的结构使得能够准确、成本有效且高通量地检测和定量样品中的分析物或靶分子。

在一些实施方案中，本发明的微珠在微珠基底表面上包含多个官能团，其中多个官能团的第一子集附接至能够与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联。微珠的亲和部分允许捕获待分析的靶分子，而微珠的螯合基团允许微珠与元素标签螯合，用于元素分析。

任何合适的聚合物可用于形成本发明的微珠基底。在一些实施方案中，可用于形成微珠基底的聚合物是均聚物。在一些实施方案中，可用于形成微珠基底的聚合物是共聚物。可用于微珠基底的聚合物的实例包括但不限于聚苯乙烯(PS)、聚苯乙烯-甲基丙烯酸(PSMAA)、聚苯乙烯-二乙烯基苯(P[S/DVB])、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)及其任何组合。在一些实施方案中，微珠基底通过聚苯乙烯(PS)的聚合形成。

在一些实施方案中，微珠基底可以在进行官能化之前预制造。在本发明的一些实施方案中，微珠基底可以从商业供应商获得。

在一些实施方案中，微珠的形状可以是不规则的，或基本上是球形、立方体、长菱形、四角形、十二面体、卵形、圆柱形等。在一些实施方案中，微珠的形状基本上是球形。

在一些实施方案中，微珠的大小可以在10nm-1mm之间的范围或中间任何范围内。在一些实施方案中，微珠的大小可以在50nm-100μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的大小可以在50nm-10μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的大小可以在100nm-10μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的大小可以在300nm-10μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的大小可以在500nm-10μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的大小可以在100nm-5μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的大小可以在300nm-5μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的大小可以在500nm-5μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的大小可以在100nm-3μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的大小可以在300nm-3μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的大小可以在500nm-3μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的大小可以在1μm-3μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的大小可以在1μm-10μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的大小可以在1μm-5μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的大小可以在5μm-10μm之间的范围内。

在一些实施方案中，微珠的直径可以在10nm-1mm之间的范围或中间任何范围内。在一些实施方案中，微珠的直径可以在50nm-100μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的直径可以在50nm-10μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的直径可以在100nm-10μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的直径可以在300nm-10μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的直径可以在500nm-10μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的直径可以在100nm-5μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的直径可以在300nm-5μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的直径可以在500nm-5μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的直径可以在100nm-3μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的直径可以在300nm-3μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的直径可以在500nm-3μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的直径可以在1μm-3μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的直径可以在1μm-10μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的直径可以在1μm-5μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠的直径可以在5μm-10μm之间的范围内。

在一些实施方案中，微珠可以基本上是球形，直径在10nm-1mm之间或中间任何范围内。在一些实施方案中，微珠可以基本上是球形，直径在50nm-100μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠可以基本上是球形，直径在50nm-10μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠可以基本上是球形，直径在100nm-10μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠可以基本上是球形，直径在300nm-10μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠可以基本上是球形，直径在500nm-10μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠可以基本上是球形，直径在100nm-5μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠可以基本上是球形，直径在300nm-5μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠可以基本上是球形，直径在500nm-5μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠可以基本上是球形，直径在100nm-3μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠可以基本上是球形，直径在300nm-3μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠可以基本上是球形，直径在500nm-3μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠可以基本上是球形，直径在1μm-3μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠可以基本上是球形，直径在1μm-10μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠可以基本上是球形，直径在1μm-5μm之间的范围内。在一些实施方案中，微珠可以基本上是球形，直径在5μm-10μm之间的范围内。

在一些实施方案中，微珠在表面上包含多个官能团。在一些实施方案中，微珠在其表面上包含10

微珠表面上的官能团可以是能够附接至螯合基团、与亲和部分和/或间隔区偶联的任何合适的官能团。在一些实施方案中，官能团的实例包括但不限于羧基、巯基、氨基、羟基、马来酰亚胺、叠氮、炔基、生物素及其任何组合。在一些实施方案中，微珠表面上所用的官能团是羧基。

在一些实施方案中，本发明的微珠基本上是由聚苯乙烯形成的球形，并且包含10

在一些实施方案中，微珠表面上的多个官能团的第一子集附接至螯合基团。附接至微珠表面上的官能团的螯合基团可以是能够与元素标签螯合的任何合适的螯合基团。在一些实施方案中，螯合基团的实例包括但不限于EDTA(乙二胺四乙酸)、PDCA(2,6-吡啶二羧酸)、DTPA(二乙烯三胺五乙酸)、DCTA(二氨基环己烷四乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、TETA(N,N’-双(2-氨基乙基)乙烷-1,2-二胺)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N’,N”-三乙酸)及其衍生物。

在一些实施方案中，微珠包含10

在一些实施方案中，附接至微珠表面上的官能团的螯合基团可以是相同的螯合基团。在一些实施方案中，附接至微珠表面上的官能团的螯合基团可以是不同螯合基团的组合，例如EDTA(乙二胺四乙酸)、PDCA(2,6-吡啶二羧酸)、DTPA(二乙烯三胺五乙酸)、DCTA(二氨基环己烷四乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、TETA(N,N’-双(2-氨基乙基)乙烷-1,2-二胺)和NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N’,N”-三乙酸)中的两种、三种或更多种的任何组合。

在一些实施方案中，微珠包含10

在一些实施方案中，螯合基团直接附接至微珠表面上的官能团。在一些实施方案中，螯合基团经由间隔区附接至微珠表面上的官能团。任何合适的间隔区可用于将螯合基团连接至官能团。可用于将螯合基团连接至官能团的间隔区的实例包括但不限于MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼)、NH

在一些实施方案中，微珠的螯合基团进一步与元素标签螯合。适用于元素分析的任何元素标签可用于与本发明的微珠的螯合基团螯合。在一些实施方案中，元素是金属或其同位素。

可用于本发明的金属的实例包括但不限于Y、Ru、Rh、Pd、Cd、In、Ba、La、Lu、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Rn、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、Mt、Ds、Rg、Cn、Nh、Fl、Mc、Lv、Ts和Og。

可用于本发明的同位素的实例包括但不限于Y-89、Rh-103、Pd-102、Pd-104、Pd-105、Pd-106、Pd-108、Pd-110、Cd-106、Cd-108、Cd-110、Cd-111、Cd-112、Cd-113、Cd-114、Cd-116、In-115、La-139、Ce-140、Pr-141、Nd-142、Nd-143、Nd-144、Nd-145、Nd-146、Nd-148、Nd-150、Sm-147、Sm-149、Sm-152、Sm-154、Eu-151、Eu-153、Gd-155、Gd-156、Gd-157、Gd-158、Gd-160、Tb-159、Dy-161、Dy-162、Dy-163、Dy-164、Ho-165、Er-166、Er-167、Er-168、Er-170、Tm-169、Yb-171、Yb-172、Yb-173、Yb-174、Yb-176和Lu-175。

在一些实施方案中，本发明的元素标签包含两种或更多种元素或其同位素的组合。在一些实施方案中，本发明的元素标签包含两种元素或其同位素的组合。在一些实施方案中，本发明的元素标签包含三种元素或其同位素的组合。在一些实施方案中，本发明的元素标签包含四种元素或其同位素的组合。在一些实施方案中，本发明的元素标签包含五种元素或其同位素的组合。

在一些实施方案中，本发明的元素标签包含两种金属的组合，该金属选自Y、Ru、Rh、Pd、Cd、In、Ba、La、Lu、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Rn、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、Mt、Ds、Rg、Cn、Nh、Fl、Mc、Lv、Ts、Og。在一些实施方案中，本发明的元素标签包含两种同位素的组合，该同位素选自Y-89、Rh-103、Pd-102、Pd-104、Pd-105、Pd-106、Pd-108、Pd-110、Cd-106、Cd-108、Cd-110、Cd-111、Cd-112、Cd-113、Cd-114、Cd-116、In-115、La-139、Ce-140、Pr-141、Nd-142、Nd-143、Nd-144、Nd-145、Nd-146、Nd-148、Nd-150、Sm-147、Sm-149、Sm-152、Sm-154、Eu-151、Eu-153、Gd-155、Gd-156、Gd-157、Gd-158、Gd-160、Tb-159、Dy-161、Dy-162、Dy-163、Dy-164、Ho-165、Er-166、Er-167、Er-168、Er-170、Tm-169、Yb-171、Yb-172、Yb-173、Yb-174、Yb-176和Lu-175。

在一些实施方案中，本发明的元素标签包含三种金属的组合，该金属选自Y、Ru、Rh、Pd、Cd、In、Ba、La、Lu、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Rn、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、Mt、Ds、Rg、Cn、Nh、Fl、Mc、Lv、Ts、Og。在一些实施方案中，本发明的元素标签包含三种同位素的组合，该同位素选自Y-89、Rh-103、Pd-102、Pd-104、Pd-105、Pd-106、Pd-108、Pd-110、Cd-106、Cd-108、Cd-110、Cd-111、Cd-112、Cd-113、Cd-114、Cd-116、In-115、La-139、Ce-140、Pr-141、Nd-142、Nd-143、Nd-144、Nd-145、Nd-146、Nd-148、Nd-150、Sm-147、Sm-149、Sm-152、Sm-154、Eu-151、Eu-153、Gd-155、Gd-156、Gd-157、Gd-158、Gd-160、Tb-159、Dy-161、Dy-162、Dy-163、Dy-164、Ho-165、Er-166、Er-167、Er-168、Er-170、Tm-169、Yb-171、Yb-172、Yb-173、Yb-174、Yb-176和Lu-175。

在一些实施方案中，本发明的元素标签包含四种金属的组合，该金属选自Y、Ru、Rh、Pd、Cd、In、Ba、La、Lu、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Rn、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、Mt、Ds、Rg、Cn、Nh、Fl、Mc、Lv、Ts、Og。在一些实施方案中，本发明的元素标签包含四种同位素的组合，该同位素选自Y-89、Rh-103、Pd-102、Pd-104、Pd-105、Pd-106、Pd-108、Pd-110、Cd-106、Cd-108、Cd-110、Cd-111、Cd-112、Cd-113、Cd-114、Cd-116、In-115、La-139、Ce-140、Pr-141、Nd-142、Nd-143、Nd-144、Nd-145、Nd-146、Nd-148、Nd-150、Sm-147、Sm-149、Sm-152、Sm-154、Eu-151、Eu-153、Gd-155、Gd-156、Gd-157、Gd-158、Gd-160、Tb-159、Dy-161、Dy-162、Dy-163、Dy-164、Ho-165、Er-166、Er-167、Er-168、Er-170、Tm-169、Yb-171、Yb-172、Yb-173、Yb-174、Yb-176和Lu-175。

在一些实施方案中，微珠表面上的多个官能团的第二子集与亲和部分偶联。亲和部分可以是能够结合至靶分子的任何合适的部分。亲和部分的实例包括但不限于肽、蛋白质、适体、抗体、酶、亲和素、链霉亲和素、碳水化合物、核酸、脱氧核糖核酸、寡核苷酸、多肽、重组蛋白、核糖核酸脂质及其衍生物。在一些实施方案中，亲和部分是抗体，并且抗体可以选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、Fab片段、Fc片段、轻链、重链、免疫球蛋白和免疫球蛋白片段。

在一些实施方案中，与微珠表面上的官能团偶联的亲和部分可以是相同的亲和部分。在一些实施方案中，与微珠表面上的官能团偶联的亲和部分可以是不同亲和部分的组合，例如不同亲和部分中的两种、三种或更多种的组合。

在一些实施方案中，微珠包含10

在一些实施方案中，微珠包含10

在一些实施方案中，亲和部分直接与微珠表面上的官能团偶联。在一些实施方案中，亲和部分经由间隔区与微珠表面上的官能团偶联。在一些实施方案中，间隔区在亲和部分(例如抗体)和微珠之间提供合适的距离，以克服它们之间的空间位阻并降低对亲和部分活性的影响。

任何合适的间隔区可用于将亲和部分连接至官能团。可用于将亲和部分连接至官能团的间隔区的实例包括但不限于MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼)、NH

在一些实施方案中，间隔区包括两个或更多个间隔区。在一些实施方案中，间隔区包括两个或更多个相同的间隔区。在一些实施方案中，间隔区包括两个或更多个不同的间隔区。

在一些实施方案中，微珠基本上是由聚苯乙烯形成的球形，并且包含10

在另一方面，本文提供了一种微珠群体，其包含微珠的两个或更多个亚群，其中微珠中的至少一个在微珠基底表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联；其中微珠的至少一个亚群包含不同于微珠的至少另一个亚群的元素标签，并且微珠的至少一个亚群包含不同于微珠的另一个亚群的亲和部分。微珠的每个亚群可以捕获相应的靶分子，这允许微珠群体能够在单个试验中同时检测样品的多个靶分子。

在一些实施方案中，微珠的一个亚群的亲和部分结合至不同于微珠另一个亚群的亲和部分的靶分子。在一些实施方案中，微珠的一个亚群的亲和部分结合至不同于微珠另一个亚群的亲和部分的表位。

在一些实施方案中，微珠群体中微珠的每个亚群的元素标签包含元素的组合，并且该元素可以是金属或其同位素。在一些实施方案中，微珠群体中的微珠的元素标签包含两种元素的组合。在一些实施方案中，微珠群体中的微珠的元素标签包含两种元素的组合，该元素选自Y、Ru、Rh、Pd、Cd、In、Ba、La、Lu、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Rn、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、Mt、Ds、Rg、Cn、Nh、Fl、Mc、Lv、Ts和Og。在一些实施方案中，微珠群体中的微珠的元素标签包含两种元素的组合，该元素选自Y-89、Rh-103、Pd-102、Pd-104、Pd-105、Pd-106、Pd-108、Pd-110、Cd-106、Cd-108、Cd-110、Cd-111、Cd-112、Cd-113、Cd-114、Cd-116、In-115、La-139、Ce-140、Pr-141、Nd-142、Nd-143、Nd-144、Nd-145、Nd-146、Nd-148、Nd-150、Sm-147、Sm-149、Sm-152、Sm-154、Eu-151、Eu-153、Gd-155、Gd-156、Gd-157、Gd-158、Gd-160、Tb-159、Dy-161、Dy-162、Dy-163、Dy-164、Ho-165、Er-166、Er-167、Er-168、Er-170、Tm-169、Yb-171、Yb-172、Yb-173、Yb-174、Yb-176和Lu-175。在一些实施方案中，微珠群体中的微珠的元素标签是三种元素的组合。在一些实施方案中，微珠群体中的微珠的元素标签包含三种元素的组合，该元素选自Y、Ru、Rh、Pd、Cd、In、Ba、La、Lu、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Rn、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、Mt、Ds、Rg、Cn、Nh、Fl、Mc、Lv、Ts和Og。在一些实施方案中，微珠群体中的微珠的元素标签包含三种元素的组合，该元素选自Y-89、Rh-103、Pd-102、Pd-104、Pd-105、Pd-106、Pd-108、Pd-110、Cd-106、Cd-108、Cd-110、Cd-111、Cd-112、Cd-113、Cd-114、Cd-116、In-115、La-139、Ce-140、Pr-141、Nd-142、Nd-143、Nd-144、Nd-145、Nd-146、Nd-148、Nd-150、Sm-147、Sm-149、Sm-152、Sm-154、Eu-151、Eu-153、Gd-155、Gd-156、Gd-157、Gd-158、Gd-160、Tb-159、Dy-161、Dy-162、Dy-163、Dy-164、Ho-165、Er-166、Er-167、Er-168、Er-170、Tm-169、Yb-171、Yb-172、Yb-173、Yb-174、Yb-176和Lu-175。

元素的组合可以充当条形码，以使得能够通过使用元素分析对微珠群体中的微珠亚群进行区分鉴定。使用这种元素的组合作为微珠亚群的条形码使得可以通过对微珠群体使用有限数量的元素来获得更多样的标签。例如，对微珠群体使用10种不同的元素并从10种不同元素中选择3种作为条形码，可以为微珠群体中多达120个亚群产生120个不同的条形码。使用组合元素的策略允许在单个元素分析中同时对样品中的大量分析物进行多重分析，这是显著成本有效且节省时间的。

在一些实施方案中，使用2种不同元素的组合充当微珠亚群的条形码。在一些实施方案中，使用3种不同元素的组合充当微珠亚群的条形码。在一些实施方案中，使用4种不同元素的组合充当微珠亚群的条形码。在一些实施方案中，使用5种不同元素的组合充当微珠亚群的条形码。在一些实施方案中，使用6种不同元素的组合充当微珠亚群的条形码。在一些实施方案中，使用7种不同元素的组合充当微珠亚群的条形码。在一些实施方案中，使用8种不同元素的组合充当微珠亚群的条形码。在一些实施方案中，使用9种不同元素的组合充当微珠亚群的条形码。在一些实施方案中，使用10种不同元素的组合充当微珠亚群的条形码。

在一些实施方案中，使用2种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用3种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用4种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用5种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用6种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用7种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用8种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用9种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用10种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用11种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用12种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用13种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用14种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用15种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用16种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用17种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用18种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用19种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用20种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用50种不同元素产生微珠群体的多样条形码。在一些实施方案中，使用100种不同元素产生微珠群体的多样条形码。

在一些实施方案中，提供了一种微珠群体，其包含微珠的多个亚群，其中微珠中的每一个在表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联；其中微珠的一个亚群包含具有作为其条形码的独特元素组合的元素标签，并且包含不同于微珠的至少另一个亚群的亲和部分。

在一些实施方案中，提供了一种微珠群体，其包含微珠的2个或更多个亚群，其中微珠中的每一个在表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联；其中微珠的一个亚群包含具有作为其条形码的独特元素组合的元素标签，并且包含不同于微珠其他亚群的亲和部分的亲和部分。在一些实施方案中，提供了一种微珠群体，其包含微珠的3个或更多个亚群，其中微珠中的每一个在表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联；其中微珠的一个亚群包含具有作为其条形码的独特元素组合的元素标签，并且包含不同于微珠其他两个亚群的亲和部分的亲和部分。在一些实施方案中，提供了一种微珠群体，其包含微珠的4个或更多个亚群，其中微珠中的每一个在表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联；其中微珠的一个亚群包含具有作为其条形码的独特元素组合的元素标签，并且包含不同于微珠其他亚群的亲和部分的亲和部分。在一些实施方案中，提供了一种微珠群体，其包含微珠的5个或更多个亚群，其中微珠中的每一个在表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联；其中微珠的一个亚群包含具有作为其条形码的独特元素组合的元素标签，并且包含不同于微珠其他亚群的亲和部分的亲和部分。在一些实施方案中，提供了一种微珠群体，其包含微珠的10个或更多个亚群，其中微珠中的每一个在表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联；其中微珠的一个亚群包含具有作为其条形码的独特元素组合的元素标签，并且包含不同于微珠其他亚群的亲和部分的亲和部分。在一些实施方案中，提供了一种微珠群体，其包含微珠的20个或更多个亚群，其中微珠中的每一个在表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联；其中微珠的一个亚群包含具有作为其条形码的独特元素组合的元素标签，并且包含不同于微珠其他亚群的亲和部分的亲和部分。在一些实施方案中，提供了一种微珠群体，其包含微珠的50个或更多个亚群，其中微珠中的每一个在表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联；其中微珠的一个亚群包含具有作为其条形码的独特元素组合的元素标签，并且包含不同于微珠其他亚群的亲和部分的亲和部分。在一些实施方案中，提供了一种微珠群体，其包含微珠的100个或更多个亚群，其中微珠中的每一个在表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联；其中微珠的一个亚群包含具有作为其条形码的独特元素组合的元素标签，并且包含不同于微珠其他亚群的亲和部分的亲和部分。在一些实施方案中，提供了一种微珠群体，其包含微珠的200个或更多个亚群，其中微珠中的每一个在表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联；其中微珠的一个亚群包含具有作为其条形码的独特元素组合的元素标签，并且包含不同于微珠其他亚群的亲和部分的亲和部分。在一些实施方案中，提供了一种微珠群体，其包含微珠的500个或更多个亚群，其中微珠中的每一个在表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联；其中微珠的一个亚群包含具有作为其条形码的独特元素组合的元素标签，并且包含不同于微珠其他亚群的亲和部分的亲和部分。在一些实施方案中，提供了一种微珠群体，其包含微珠的1000个或更多个亚群，其中微珠中的每一个在表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联；其中微珠的一个亚群包含具有作为其条形码的独特元素组合的元素标签，并且包含不同于微珠其他亚群的亲和部分的亲和部分。

在一些实施方案中，微珠群体的可变直径系数(CVd)小于10％。在一些实施方案中，微珠群体的可变直径系数(CVd)小于9％。在一些实施方案中，微珠群体的可变直径系数(CVd)小于8％。在一些实施方案中，微珠群体的可变直径系数(CVd)小于7％。在一些实施方案中，微珠群体的可变直径系数(CVd)小于6％。在一些实施方案中，微珠群体的可变直径系数(CVd)小于5％。在一些实施方案中，微珠群体的可变直径系数(CVd)小于4％。在一些实施方案中，微珠群体的可变直径系数(CVd)小于3％。在一些实施方案中，微珠群体的可变直径系数(CVd)小于2％。在一些实施方案中，微珠群体的可变直径系数(CVd)小于1％。

在一些实施方案中，微珠群体基本上是球形，并且可变直径系数(CVd)小于10％。在一些实施方案中，微珠群体基本上是球形，并且可变直径系数(CVd)小于9％。在一些实施方案中，微珠群体基本上是球形，并且可变直径系数(CVd)小于8％。在一些实施方案中，微珠群体基本上是球形，并且可变直径系数(CVd)小于7％。在一些实施方案中，微珠群体基本上是球形，并且可变直径系数(CVd)小于6％。在一些实施方案中，微珠群体基本上是球形，并且可变直径系数(CVd)小于5％。在一些实施方案中，微珠群体基本上是球形，并且可变直径系数(CVd)小于4％。在一些实施方案中，微珠群体基本上是球形，并且可变直径系数(CVd)小于3％。在一些实施方案中，微珠群体基本上是球形，并且可变直径系数(CVd)小于2％。在一些实施方案中，微珠群体基本上是球形，并且可变直径系数(CVd)小于1％。

在一些实施方案中，微珠群体的多个亲和部分可用于同时捕获样品中的多个靶分子，并且充当亲和部分条形码的微珠的元素标签可用于在元素分析中鉴定亲和部分，以能够同时分析多个靶分子。微珠群体中微珠的每个亚群的亲和部分的实例包括但不限于肽、蛋白质、适体、抗体、酶、亲和素、链霉亲和素、碳水化合物、核酸、脱氧核糖核酸、寡核苷酸、多肽、重组蛋白、核糖核酸脂质及其衍生物。在一些实施方案中，微珠群体中微珠的每个亚群的亲和部分是抗体。

在一些实施方案中，在捕获靶分子之后，可对本发明的微珠或微珠群体进行元素分析。能够分析元素和同位素的任何方法可用作本发明的元素分析。在一些实施方案中，元素分析是质谱(MS)。可用于元素分析的MS的实例包括但不限于ICP-MS、ICP-TOF-MS和质谱流式细胞技术。

在另一方面，提供了一种制备本发明的微珠的方法，其包括提供聚合物微珠基底；使聚合物微珠基底官能化，以在聚合物微珠基底表面上提供多个官能团；使螯合基团与(b)中的聚合物微珠基底反应，以使螯合基团附接至聚合物微珠基底表面上的官能团的第一子集；使亲和部分与(b)中的聚合物微珠基底反应，以使亲和部分与聚合物微珠基底表面上的官能团的第二子集偶联。

微珠的聚合物微珠基底可以通过任何基底的聚合形成。在一些实施方案中，聚合物微珠基底通过苯乙烯、苯乙烯-甲基丙烯酸(SMAA)、苯乙烯-二乙烯基苯(S/DVB)和甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或其任何组合的聚合来提供。在一些实施方案中，聚合物微珠基底是聚苯乙烯(PS)，其通过苯乙烯的聚合来提供。在一些实施方案中，聚合物微珠基底是聚苯乙烯-甲基丙烯酸(PSMAA)，其通过苯乙烯-甲基丙烯酸(SMAA)的聚合来提供。在一些实施方案中，聚合物微珠基底是聚苯乙烯-二乙烯基苯(P[S/DVB])，其通过苯乙烯-二乙烯基苯(S/DVB)的聚合来提供。在一些实施方案中，聚合物微珠基底是聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，其通过甲基丙烯酸甲酯(MMA)的聚合来提供。

在一些实施方案中，使聚合物微珠基底官能化，以在聚合物微珠基底表面上提供多个官能团。可用于使聚合物微珠基底官能化的官能团的实例包括但不限于羧基、巯基、氨基、羟基、马来酰亚胺、叠氮、炔基、生物素及其任何组合。

在一些实施方案中，在聚合物微珠基底表面上提供了10

在一些实施方案中，在聚合物微珠基底表面上提供了10

在一些实施方案中，制备本发明的微珠的方法包括使螯合基团与聚合物微珠基底反应，以使螯合基团附接至聚合物微珠基底表面上的官能团的第一子集。能够螯合元素标签的任何合适的螯合基团可用于附接至微珠表面上的官能团。螯合基团的实例包括但不限于EDTA、DTPA、DCTA、DOTA、TETA、NOTA及其衍生物。

在一些实施方案中，螯合基团经由螯合基团的胺附接至官能团。在一些实施方案中，胺是伯胺。在一些实施方案中，螯合基团通过碳二亚胺交联附接至官能团。在一些实施方案中，碳二亚胺交联包括在将螯合基团附接至官能团之前，通过碳二亚胺化合物活化官能团。碳二亚胺化合物的实例包括但不限于EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)和DCC(二环己基碳二亚胺)。在一些实施方案中，碳二亚胺交联进一步包括在将螯合基团附接至官能团之前，形成NHS-酯中间体。在一些实施方案中，NHS-酯中间体由NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)形成。在一些实施方案中，NHS-酯中间体由磺基-NHS(N-羟基-磺基-琥珀酰亚胺)形成。

在一些实施方案中，螯合基团经由间隔区附接至官能团。可用于将螯合基团连接至官能团的间隔区的实例包括但不限于MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼)和NH

在一些实施方案中，该方法进一步包括将元素标签螯合至螯合基团。在一些实施方案中，元素标签包含元素。在一些实施方案中，元素是金属或其同位素。

可用于本发明的金属的实例包括但不限于Y、Ru、Rh、Pd、Cd、In、Ba、La、Lu、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Rn、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、Mt、Ds、Rg、Cn、Nh、Fl、Mc、Lv、Ts和Og。

可用于本发明的同位素的实例包括但不限于Y-89、Rh-103、Pd-102、Pd-104、Pd-105、Pd-106、Pd-108、Pd-110、Cd-106、Cd-108、Cd-110、Cd-111、Cd-112、Cd-113、Cd-114、Cd-116、In-115、La-139、Ce-140、Pr-141、Nd-142、Nd-143、Nd-144、Nd-145、Nd-146、Nd-148、Nd-150、Sm-147、Sm-149、Sm-152、Sm-154、Eu-151、Eu-153、Gd-155、Gd-156、Gd-157、Gd-158、Gd-160、Tb-159、Dy-161、Dy-162、Dy-163、Dy-164、Ho-165、Er-166、Er-167、Er-168、Er-170、Tm-169、Yb-171、Yb-172、Yb-173、Yb-174、Yb-176和Lu-175。

在一些实施方案中，元素标签包含元素的组合。在一些实施方案中，元素标签包含两种或更多种元素的组合。在一些实施方案中，元素标签包含三种或更多种元素的组合。在一些实施方案中，组合的元素以固定比螯合至螯合基团。在一些实施方案中，组合的元素以随机比螯合至螯合基团。在一些实施方案中，组合的元素以等比螯合至螯合基团。在一些实施方案中，组合的元素以非等比螯合至螯合基团。

在一些实施方案中，该方法包括使亲和部分与聚合物微珠基底反应，以使亲和部分与聚合物微珠基底表面上的官能团的第二子集偶联。能够结合至靶分子的任何合适的亲和部分可用于与微珠表面上的官能团偶联。亲和部分的实例包括但不限于肽、蛋白质、适体、抗体、酶、亲和素、链霉亲和素、碳水化合物、核酸、脱氧核糖核酸、寡核苷酸、多肽、重组蛋白、核糖核酸脂质及其衍生物。在一些实施方案中，抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、Fab片段、Fc片段、轻链、重链、免疫球蛋白和免疫球蛋白片段。

在一些实施方案中，亲和部分经由亲和部分的胺与官能团偶联。在一些实施方案中，胺是伯胺。在一些实施方案中，亲和部分通过碳二亚胺交联与官能团偶联。在一些实施方案中，碳二亚胺交联包括在将螯合基团附接至官能团之前，通过碳二亚胺化合物活化官能团。碳二亚胺化合物的实例包括但不限于EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)和DCC(二环己基碳二亚胺)。在一些实施方案中，碳二亚胺交联进一步包括在将亲和部分与官能团偶联之前，形成NHS-酯中间体。在一些实施方案中，NHS-酯中间体由NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)形成。在一些实施方案中，NHS-酯中间体由磺基-NHS(N-羟基-磺基-琥珀酰亚胺)形成。

在一些实施方案中，亲和部分经由间隔区与官能团偶联。可用于将亲和部分连接至官能团的间隔区的实例包括但不限于MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼)和NH

在一些实施方案中，在将螯合基团附接至官能团之前，亲和部分与官能团偶联。在一些实施方案中，在将螯合基团附接至官能团之后，亲和部分与官能团偶联。在一些实施方案中，在将元素标签螯合至螯合基团之前，亲和部分与官能团偶联。在一些实施方案中，在将元素标签螯合至螯合基团之后，亲和部分与官能团偶联。

在一些实施方案中，提供了一种制备包含微珠的两个或更多个亚群的微珠群体的方法。在一些实施方案中，制备微珠群体的方法包括首先制备包含独特元素条形码和亲和部分的微珠的每个亚群，然后将微珠的所有亚群混合在一起，以形成微珠群体。

在另一方面，提供了一种用于检测样品中的分析物的方法，其包括使样品与微珠接触，其中微珠在微珠基底表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至分析物的亲和部分偶联；区分结合至分析物的微珠和未结合至分析物的微珠；测定样品中的分析物。在一些实施方案中，分析物基于微珠的元素标签来测定。

在一些实施方案中，区分包括将微珠与固定试剂一起温育，其中固定试剂特异性结合至分析物并将结合至分析物的微珠固定。能够特异性结合至分析物的任何合适的固定试剂可用于区分结合至分析物的微珠。在一些实施方案中，固定试剂是表面，其包含表面上缀合的能够特异性结合至分析物的亲和组分。表面的实例包括但不限于基底、基质、颗粒、珠、板、芯片的表面，其包含表面上缀合的能够特异性结合至分析物的亲和组分。在一些实施方案中，亲和组分结合至分析物的分子表面，该分子表面不同于本发明的微珠的亲和部分。在一些实施方案中，亲和组分结合至分析物的表位，该表位不同于本发明的微珠的亲和部分。

在一些实施方案中，该方法进一步包括在通过元素分析测定分析物之前，分离结合至分析物的微珠。在一些实施方案中，结合至分析物的微珠如上所述由表面固定，未结合至分析物的微珠可被冲洗掉，以分离结合至分析物的微珠和未结合的微珠。在一些实施方案中，该方法进一步包括在通过元素分析测定分析物之前，释放由表面固定的微珠。

在一些实施方案中，区分包括将微珠与检测试剂一起温育，其中检测试剂特异性结合至分析物并允许检测结合至分析物的微珠。在一些实施方案中，该方法进一步包括从样品中分离微珠。在一些实施方案中，通过离心从样品中分离微珠。

检测试剂的实例包括但不限于肽、蛋白质、适体、抗体、酶、碳水化合物、核酸、脱氧核糖核酸、寡核苷酸、多肽、重组蛋白、核糖核酸脂质及其衍生物。在一些实施方案中，检测试剂是抗体。在一些实施方案中，检测抗体特异性结合至分析物的分子表面，该分子表面不同于本发明的微珠的亲和部分。在一些实施方案中，检测抗体特异性结合至分析物的表位，该表位不同于本发明的微珠的亲和部分。

在一些实施方案中，检测试剂用检测标签标记，其允许检测结合至分析物的微珠。检测标签可以是允许区分微珠的任何合适的标签。在一些实施方案中，检测标签是检测元素标签。在一些实施方案中，检测元素标签是金属或其同位素。

可用于检测元素标签的金属的实例包括但不限于Y、Ru、Rh、Pd、Cd、In、Ba、La、Lu、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Rn、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、Mt、Ds、Rg、Cn、Nh、Fl、Mc、Lv、Ts和Og。

可用于检测元素标签的同位素的实例包括但不限于Y-89、Rh-103、Pd-102、Pd-104、Pd-105、Pd-106、Pd-108、Pd-110、Cd-106、Cd-108、Cd-110、Cd-111、Cd-112、Cd-113、Cd-114、Cd-116、In-115、La-139、Ce-140、Pr-141、Nd-142、Nd-143、Nd-144、Nd-145、Nd-146、Nd-148、Nd-150、Sm-147、Sm-149、Sm-152、Sm-154、Eu-151、Eu-153、Gd-155、Gd-156、Gd-157、Gd-158、Gd-160、Tb-159、Dy-161、Dy-162、Dy-163、Dy-164、Ho-165、Er-166、Er-167、Er-168、Er-170、Tm-169、Yb-171、Yb-172、Yb-173、Yb-174、Yb-176和Lu-175。

在一些实施方案中，用于检测样品中的分析物的方法包括使样品与本发明的微珠接触，其中微珠的多个官能团附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且微珠的多个官能团与能够结合至分析物的亲和部分偶联；用能够特异性结合至分析物的检测试剂来区分结合至分析物的微珠和未结合至分析物的微珠，其中检测试剂包含检测元素标签，其允许通过元素分析检测结合至分析物的微珠。

在一些实施方案中，元素分析是质谱(MS)。可用于元素分析的MS的实例包括但不限于ICP-MS、ICP-TOF-MS和质谱流式细胞技术。

在一些实施方案中，用于检测分析物的方法包括测定样品中的分析物。在一些实施方案中，测定分析物包括测定样品中分析物的身份。在一些实施方案中，测定分析物的身份通过分析元素标签的身份来进行。在一些实施方案中，测定分析物通过分析经检测元素标签结合至分析物的微珠和通过微珠的元素标签鉴定样品中的分析物来进行。

在一些实施方案中，测定分析物包括定量样品中分析物的量。在一些实施方案中，定量分析物的量通过分析检测元素标签来进行。在一些实施方案中，定量分析物的量通过检测元素标签的相对量来进行。在一些实施方案中，定量分析物的量通过检测元素标签的绝对量来进行。

在一些实施方案中，该方法可用于分析从对象获得的样品。在一些实施方案中，样品是对象的体液。体液的实例包括但不限于全血、血浆、血清、尿、渗出液、腹水、唾液、脑脊液、宫颈分泌物、阴道分泌物、子宫内膜分泌物、羊水、胃肠分泌物、包括痰的支气管分泌物、乳腺液和分泌物。

在一些实施方案中，上述方法可用于分析样品中的一种或多种生物标志物。在一些实施方案中，生物标志物可用于预测或诊断疾病。生物标志物的实例包括但不限于细胞因子、趋化因子、激素、生长因子、蛋白质、肽、CD抗原、病毒抗原、抗体、神经营养蛋白、核酸、寡核苷酸以及代谢物。

在一些实施方案中，本发明的方法可用于分析液体中或固体基底上的样品中的核酸。在一些实施方案中，本发明的方法可用于分析细胞样品、RNA样品、DNA样品或其任何组合中的核酸。另外的酶可用于分析不同的样品。例如，Taq酶、其他DNA聚合酶及其变体可用于分析细胞或无细胞样品中的核酸。

在一些实施方案中，生物标志物的实例包括但不限于白介素，例如IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6至IL-36；干扰素，例如IFNα、IFNβ、IFNγ；生长因子，例如M-CSF、G-CSF、GM-CSF、EGF、VEGF、FGF、GDNF、HGF、IGF、TGF；以及受体配体，例如OX40L、CD40L、FASL、CD27L、CD30L、4-1BBL、TRAIL。

在一些实施方案中，可通过本发明的方法分析的细胞因子的实例包括但不限于IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-1α、IL-1β、CNTF、LIF、OSM、EPO、G-CSF、PRL、GM-CSF、M-CSF、SCF、aFGF、bFGF、INT-2、KGF、EGF、β细胞素、SCDGF、双调蛋白、HB-EGF、4-1BB、脂联素、AITRL、AIF1、血管生成素、载脂蛋白、B细胞活化因子、β防御素、β细胞素、骨形成蛋白、BST、B型利钠肽、心肌营养蛋白、CTLA4、EBI3、内皮糖蛋白、表皮调节素、FAS、Flt3配体、卵泡抑素、Hedgehog蛋白、干扰素、白介素、Otoraplin、抵抗素、血清淀粉样蛋白A、TPO、三叶因子、TSLP、肿瘤坏死因子、子宫珠蛋白、内脂素等。

在一些实施方案中，可通过本发明的方法分析的趋化因子的实例包括但不限于CCL14、CCL19、CCL20、CCL21、CCL25、CCL27、CXCL12、CXCL13、CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11、CXCL10、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR10A、CCR10B、CCR11、ECRF-3、EBI-1(EBV诱导基因-1)、US28、MCP-4、MIP-4、I-309、TECK、GCP-2、Mig、淋巴细胞趋化因子、MCP-2、MCP-3、嗜酸细胞活化趋化因子-1、MCIF、TARC、MDC、MPIF-2(嗜酸细胞活化趋化因子-2)、SDF-1以及曲动蛋白(神经趋化因子)等。

在一些实施方案中，可通过本发明的方法分析的可溶性CD抗原的实例包括但不限于sCD4、sCD8、sCD23、sCD25、sCD27、sCD30、sCD52等。

在一些实施方案中，可通过本发明的方法分析的生长因子的实例包括但不限于活化素、CSF、CTGF、Epigen、红细胞生成素、成纤维细胞生长因子、半乳糖凝集素、HDGF、肝细胞生长因子、IGFBP、胰岛素样生长因子、胰岛素、角质形成细胞生长因子、瘦素、巨噬细胞迁移抑制因子、黑色素瘤抑制活性肌生长抑制素、Noggin、NOV、网膜素、制瘤素M、骨桥蛋白、骨保护素、PDGF、骨膜蛋白、胎盘生长因子、胎盘催乳素、泌乳素PRL、RANK配体、视黄醇结合蛋白、干细胞因子、转化生长因子、VEGF、EGF、FGF、NGF、PDGF、VEGF、IGF、GMCSF、GCSF、TGF、红细胞生成素(Erythropieitn)、TPO、BMP、HGF、GDF、神经营养蛋白、MSF、SGF、GDF等。

在一些实施方案中，可通过本发明的方法分析的激素的实例包括但不限于内皮素、毒蜥外泌肽、FSH、GHRP、GLP、胰高血糖素、HCG、抑制素A、LHRH、ACTH、阿拉瑞林、安替肽、阿托西班、布舍瑞林、西曲瑞克、DDAVP、地洛瑞林、依降钙素、加尼瑞克、GHRL蛋白、戈舍瑞林、海沙瑞林、组氨瑞林、兰瑞肽、人亮丙瑞林、赖氨加压素、美拉诺坦I、美拉诺坦II、NAF、PMSG、普兰林肽、分泌素、辛卡利特、生长抑素、特利加压素、胸腺五肽、降钙素原、PTH、斯钙素、胸腺素、醋酸曲普瑞林、胸腺刺激素(Thyrostimulin)、TSH、加压素等。

在另一方面，提供了一种对样品中的两种或更多种分析物进行多重分析的方法，其包括：(a)使微珠群体与样品接触，其中微珠中的每一个在微珠基底表面上包含多个官能团；多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团；多个官能团的第二子集与能够结合至两种或更多种分析物中的分析物的亲和部分偶联，其中微珠的至少一个亚群包含不同于微珠的至少另一个亚群的元素标签，并且微珠的至少一个亚群包含不同于微珠的另一个亚群的亲和部分，(b)将微珠群体与两种或更多种检测试剂一起温育，其中检测试剂中的每一种允许检测结合至分析物的微珠；(c)同时分析样品中的两种或更多种分析物。

在一些实施方案中，微珠群体的每个微珠的元素标签是元素的组合。在一些实施方案中，元素的组合是两种或更多种元素的组合。在一些实施方案中，元素的组合是三种或更多种元素的组合。在一些实施方案中，元素的组合是四种或更多种元素的组合。在一些实施方案中，元素的组合是五种或更多种元素的组合。使用这种元素的组合使得可以通过使用有限数量的元素来获得更多样的标签。例如，从10种不同元素中选择3种可以产生120个不同的元素组合，即120个不同的元素标签。使用组合元素的策略允许在单个元素分析中同时对样品中的大量分析物进行多重分析，这是显著成本有效且节省时间的。

检测试剂的实例包括但不限于肽、蛋白质、适体、抗体、酶、碳水化合物、核酸、脱氧核糖核酸、寡核苷酸、多肽、重组蛋白、核糖核酸脂质及其衍生物。在一些实施方案中，检测试剂是抗体。在一些实施方案中，检测抗体特异性结合至分析物的分子表面，该分子表面不同于本发明的微珠的亲和部分。在一些实施方案中，检测抗体特异性结合至分析物的表位，该表位不同于本发明的微珠的亲和部分。

在一些实施方案中，检测试剂用检测元素标签标记。检测元素标签允许区分结合至分析物的微珠和未结合至分析物的微珠。在一些实施方案中，检测元素标签是金属或其同位素。

可用于检测元素标签的金属的实例包括但不限于Y、Ru、Rh、Pd、Cd、In、Ba、La、Lu、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Po、At、Rn、Fr、Ra、Ac、Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No、Lr、Rf、Db、Sg、Bh、Hs、Mt、Ds、Rg、Cn、Nh、Fl、Mc、Lv、Ts和Og。

可用于检测元素标签的同位素的实例包括但不限于Y-89、Rh-103、Pd-102、Pd-104、Pd-105、Pd-106、Pd-108、Pd-110、Cd-106、Cd-108、Cd-110、Cd-111、Cd-112、Cd-113、Cd-114、Cd-116、In-115、La-139、Ce-140、Pr-141、Nd-142、Nd-143、Nd-144、Nd-145、Nd-146、Nd-148、Nd-150、Sm-147、Sm-149、Sm-152、Sm-154、Eu-151、Eu-153、Gd-155、Gd-156、Gd-157、Gd-158、Gd-160、Tb-159、Dy-161、Dy-162、Dy-163、Dy-164、Ho-165、Er-166、Er-167、Er-168、Er-170、Tm-169、Yb-171、Yb-172、Yb-173、Yb-174、Yb-176和Lu-175。

在一些实施方案中，用于多重分析的元素分析可以是质谱(MS)。MS的实例包括但不限于ICP-MS、ICP-TOF-MS和质谱流式细胞技术。

在一些实施方案中，多重分析包括测定样品中两种或更多种分析物的身份。在一些实施方案中，两种或更多种分析物的身份通过分析微珠的元素标签来测定。在一些实施方案中，两种或更多种分析物的身份通过分析微珠的元素标签和检测元素标签来测定。在一些实施方案中，多重分析包括定量样品中两种或更多种分析物的量。在一些实施方案中，定量通过分析检测元素标签来测定。

在一些实施方案中，用于进行多重分析的方法进一步包括从样品中分离微珠。在一些实施方案中，分离通过离心来进行。

在一些实施方案中，多重分析可用于分析从对象获得的样品。在一些实施方案中，样品是对象的体液。体液的实例包括但不限于全血、血浆、血清、尿、渗出液、腹水、唾液、脑脊液、宫颈分泌物、阴道分泌物、子宫内膜分泌物、羊水、胃肠分泌物、包括痰的支气管分泌物、乳腺液和分泌物。

在一些实施方案中，上述多重分析可用于同时分析样品中的多种生物标志物。在一些实施方案中，生物标志物可用于预测、诊断疾病或评估对治疗性干预的反应。生物标志物的实例包括但不限于细胞因子、激素、生长因子、蛋白质、肽、CD抗原、病毒抗原、抗体、神经营养蛋白、核酸、寡核苷酸以及代谢物。在一些实施方案中，生物标志物的实例包括但不限于白介素，例如IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6至IL-36；干扰素，例如IFNα、IFNβ、IFNγ；生长因子，例如M-CSF、G-CSF、GM-CSF、EGF、VEGF、FGF、GDNF、HGF、IGF、TGF；以及受体配体，例如OX40L、CD40L、FASL、CD27L、CD30L、4-1BBL、TRAIL。

可通过本发明的多重分析进行分析的细胞因子的实例包括但不限于IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-1α、IL-1β、CNTF、LIF、OSM、EPO、G-CSF、PRL、GM-CSF、M-CSF、SCF、aFGF、bFGF、INT-2、KGF、EGF、β细胞素、SCDGF、双调蛋白、HB-EGF、4-1BB、脂联素、AITRL、AIF1、血管生成素、载脂蛋白、B细胞活化因子、β防御素、β细胞素、骨形成蛋白、BST、B型利钠肽、心肌营养蛋白、CTLA4、EBI3、内皮糖蛋白、表皮调节素、FAS、Flt3配体、卵泡抑素、Hedgehog蛋白、干扰素、白介素、Otoraplin、抵抗素、血清淀粉样蛋白A、TPO、三叶因子、TSLP、肿瘤坏死因子、子宫珠蛋白、内脂素等。

可通过本发明的多重分析进行分析的趋化因子的实例包括但不限于CCL14、CCL19、CCL20、CCL21、CCL25、CCL27、CXCL12、CXCL13、CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11、CXCL10、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR10A、CCR10B、CCR11、ECRF-3、EBI-1(EBV诱导基因-1)、US28、MCP-4、MIP-4、I-309、TECK、GCP-2、Mig、淋巴细胞趋化因子、MCP-2、MCP-3、嗜酸细胞活化趋化因子-1、MCIF、TARC、MDC、MPIF-2(嗜酸细胞活化趋化因子-2)、SDF-1以及曲动蛋白(神经趋化因子)等。

可通过本发明的多重分析进行分析的生长因子的实例包括但不限于活化素、CSF、CTGF、Epigen、红细胞生成素、成纤维细胞生长因子、半乳糖凝集素、HDGF、肝细胞生长因子、IGFBP、胰岛素样生长因子、胰岛素、角质形成细胞生长因子、瘦素、巨噬细胞迁移抑制因子、黑色素瘤抑制活性肌生长抑制素、Noggin、NOV、网膜素、制瘤素M、骨桥蛋白、骨保护素、PDGF、骨膜蛋白、胎盘生长因子、胎盘催乳素、泌乳素PRL、RANK配体、视黄醇结合蛋白、干细胞因子、转化生长因子、VEGF、EGF、FGF、NGF、PDGF、VEGF、IGF、GMCSF、GCSF、TGF、红细胞生成素、TPO、BMP、HGF、GDF、神经营养蛋白、MSF、SGF、GDF等。

可通过本发明的多重分析进行分析的激素的实例包括但不限于内皮素、毒蜥外泌肽、FSH、GHRP、GLP、胰高血糖素、HCG、抑制素A、LHRH、ACTH、阿拉瑞林、安替肽、阿托西班、布舍瑞林、西曲瑞克、DDAVP、地洛瑞林、依降钙素、加尼瑞克、GHRL蛋白、戈舍瑞林、海沙瑞林、组氨瑞林、兰瑞肽、人亮丙瑞林、赖氨加压素、美拉诺坦I、美拉诺坦II、NAF、PMSG、普兰林肽、分泌素、辛卡利特、生长抑素、特利加压素、胸腺五肽、降钙素原、PTH、斯钙素、胸腺素、醋酸曲普瑞林、胸腺刺激素、TSH、加压素等。

在另一方面，提供了一种试剂盒，其包含说明书，用于通过使用试剂盒对两种或更多种分析物进行多重分析；微珠群体，其包含微珠的两个或更多个亚群，其中微珠中的至少一个在微珠基底表面上包含多个官能团，多个官能团的第一子集附接至与元素标签螯合的螯合基团，并且多个官能团的第二子集与能够结合至靶分子的亲和部分偶联，其中微珠的至少一个亚群包含不同于微珠的至少另一个亚群的元素标签，并且微珠的至少一个亚群包含不同于微珠的另一个亚群的亲和部分；以及两种或更多种检测试剂，其中检测试剂中的每一种包括检测元素标签，并且特异性结合至两种或更多种分析物中的分析物。

在一些实施方案中，试剂盒包含微珠的两个或更多个亚群，用于捕获样品中的两种或更多种分析物。在一些实施方案中，试剂盒包含微珠的三个或更多个亚群，用于捕获样品中的三种或更多种分析物。在一些实施方案中，试剂盒包含微珠的四个或更多个亚群，用于捕获样品中的四种或更多种分析物。在一些实施方案中，试剂盒包含微珠的五个或更多个亚群，用于捕获样品中的五种或更多种分析物。在一些实施方案中，试剂盒包含微珠的十个或更多个亚群，用于捕获样品中的十种或更多种分析物。在一些实施方案中，试剂盒包含微珠的二十个或更多个亚群，用于捕获样品中的二十种或更多种分析物。在一些实施方案中，试剂盒包含微珠的五十个或更多个亚群，用于捕获样品中的五十种或更多种分析物。在一些实施方案中，试剂盒包含微珠的一百个或更多个亚群，用于捕获样品中的一百种或更多种分析物。在一些实施方案中，试剂盒包含微珠的两百个或更多个亚群，用于捕获样品中的两百种或更多种分析物。

在一些实施方案中，试剂盒包含两种或更多种检测试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含三种或更多种检测试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含四种或更多种检测试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含五种或更多种检测试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含十种或更多种检测试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含二十种或更多种检测试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含五十种或更多种检测试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含一百种或更多种检测试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含两百种或更多种检测试剂。

在一些实施方案中，本发明的试剂盒进一步包含用于进行分析的药物赋形剂。赋形剂的实例包括但不限于稳定剂、缓冲液、防腐剂、张度剂以及抗氧化剂。

在一些实施方案中，可包括在本发明试剂盒中的缓冲液的实例包括但不限于硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液以及Tris-HCl缓冲液(包含三(羟甲基)氨基甲烷和HCl)。

尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅作为实例提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应理解，在实践本发明时，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且因此涵盖这些权利要求及其等效物的范围内的方法和结构。

实施例1：微珠的制备

通过聚苯乙烯(PS)的聚合制备微珠基底，以产生平均直径为约1.9μm的球形微珠基底。用羧基基团进一步使微珠基底表面官能化，每个微珠约10

图1示出了制备微珠的过程。在过程中，通过聚苯乙烯(PS)的聚合制备微珠基底[1]，并用多个羧基基团[2]使微珠基底表面官能化，然后将能够与元素标签螯合的螯合基团[3]附接至羧基基团的第一子集，并将能够结合靶分子的亲和部分[4]与羧基基团的第二子集偶联。

图2A示出了用于将亲和部分与微珠表面上的官能团偶联的示例性过程。在这些过程中，采用碳二亚胺化合物EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)[6]活化微珠[5]表面上的羧基基团，以形成能够与亲和部分的伯胺反应的反应性中间体[7]。该反应性中间体[7]进一步与亲和部分[8]反应，以获得与亲和部分偶联的微珠[9]。

在替代过程中，在通过使用EDC形成反应性中间体[7]之后，加入NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)[10]，以形成能够与亲和部分的伯胺反应的NHS-酯中间体[11]。NHS-酯中间体[11]进一步与亲和部分[8]反应，以获得与亲和部分偶联的微珠[9]。

在另一过程中，在通过使用EDC形成反应性中间体[7]之后，加入磺基-NHS(N-羟基-磺基-琥珀酰亚胺)[12]，以形成能够与亲和部分的伯胺反应的磺基-NHS-酯中间体[13]。磺基-NHS-酯中间体[13]进一步与亲和部分[8]反应，以获得与亲和部分偶联的微珠[9]。

图2B示出了用于将螯合基团附接至微珠表面上的官能团的示例性过程。采用双官能团螯合剂[14]作为螯合基团。所述双官能团螯合剂包含用于与微珠表面上的羧基基团偶联的氨基基团以及能够结合至元素标签的阳离子螯合基团，例如Ln3+阳离子或元素的组合[15]。在该过程中，首先使双官能团螯合剂与Ln3+反应，以形成与金属阳离子结合的螯合剂[16]，然后使与金属阳离子结合的螯合剂通过螯合剂的氨基基团与微珠表面上的羧基基团反应，以获得具有螯合基团的微珠[17]。可替代地，首先可以使双官能团螯合剂[14]与微珠表面上的羧基基团反应，然后与元素标签(例如Ln3+阳离子或元素的组合[15])进行反应，以获得具有螯合基团的微珠[17]。

图2C示出了可用于将亲和部分缀合至微珠表面上的官能团的示例性间隔区。间隔区[20]可以在微珠[18]和亲和部分[19]之间形成共价键。该间隔区可以在亲和部分(例如生物分子)和微珠之间提供合适的距离，以克服它们之间的空间位阻并降低对亲和部分活性的影响。间隔区可以是化合物MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼)[21]或官能化寡聚物NH2-(PEG)

实施例2：通过使用ICP-TOF-MS对具有组合元素标签的微珠进行分析

通过如实施例1所述的过程制备用包含元素组合(141Pr、159Tb、165Ho)的元素标签标记的羧基修饰微珠，而不与亲和部分偶联。制备的微珠的特征如表1所示。

表1微珠的特征

将上述制备的微珠以1×10

表2.元素的定量

实施例3：通过质谱流式细胞技术对具有组合元素标签和小鼠IgG的微珠进行分析。

通过如实施例1所述的过程制备用包含元素组合(141Pr、159Tb、165Ho)的元素标签标记的羧基修饰微珠，并将微珠进一步与小鼠IgG偶联。然后将微珠与生物素标记的抗小鼠IgG抗体和169Tm标记的链霉亲和素一起温育，以获得结合至具有检测元素标签169Tm的抗小鼠IgG的微珠。然后将该微珠(图4的下图)与作为对照的实施例2中制备的微珠(图4的上图)一起进行质谱流式细胞技术，实施例2中制备的微珠仅具有组合元素标签而不与小鼠IgG偶联。

图4示出了质谱流式细胞技术的结果。从图4可以看出，可以通过检测元素标签169Tm，将与小鼠IgG偶联并与具有检测元素标签169Tm的抗小鼠IgG一起温育的微珠和无小鼠IgG的微珠区分开，这证实了检测元素标签在区分结合至分析物的微珠和未结合至分析物的微珠方面的功能。

元素(包括141Pr、159Tb、165Ho和169Tm)中的每一种基于图4中每一种元素的中位数和平均值强度来进一步定量。定量的结果如表3A和表3B所示。

表3A仅具有组合元素标签的微珠上元素的定量。

表3B具有组合元素标签和小鼠IgG的微珠上元素的定量。

实施例4：亲和部分与微珠的偶联效率

如上所述，制备用包含元素组合(141Pr、159Tb、165Ho)的元素标签标记并与小鼠IgG偶联的羧基修饰微珠。然后将微珠分别与梯度浓度的169Tm标记的抗小鼠IgG抗体(2、4和8μg/mL)一起温育。温育之后，将微珠以1×10

如图5B和图5C所示，分别在线性坐标和对数坐标中进一步定量每组中的检测元素标签169Tm。

实施例5：通过使用本发明的方法对人TNFα进行分析

如实施例1所述，制备用包含元素组合(141Pr、159Tb、165Ho)的元素标签标记并与抗人TNFα抗体偶联的羧基修饰微珠。然后将微珠与包含梯度浓度的人TNFα(0、3.13、6.25、12.5、25.0、50.0ng/mL)的样品一起温育。将生物素标记的抗人TNFα抗体和169Tm标记的链霉亲和素(作为检测元素标签)进一步加入至微珠悬浮液中。然后对微珠进行质谱流式细胞技术。图6A示出了通过使用质谱流式细胞技术对人TNFα进行分析。从图6A可以看出，本申请的方法可以检测样品中浓度低至3.13ng/mL的人TNFα，这证明了本申请方法的高灵敏度。

如图6B所示，检测元素标签169Tm基于图6A中的中位数强度来进一步定量。

实施例6：通过使用本发明的方法对核酸进行分析

如实施例1所述，将包含选自141Pr、159Tb、165Ho和169Tm的元素组合的元素标签与羧基修饰微珠偶联。然后用141Pr、159Tb、169Tm标记的微珠进一步与用于靶向CD3的NH

如图7所示，上述三种微珠中141Pr、159Tb、165Ho、169Tm的元素信号通过质谱流式细胞仪来定量。在图7中，黄色箭头表示具有141Pr、159Tb、169Tm(无165Ho)组合的元素标签并与CD3引物偶联的微珠的信号，红色箭头表示具有141Pr、165Ho、169Tm(无159Tb)组合的元素标签并与CD4引物偶联的微珠的信号，绿色箭头表示具有141Pr、159Tb、165Ho(无169Tm)组合的元素标签并与CD19引物偶联的微珠的信号。从图7可以看出，具有不同元素组合并与靶向不同基因的引物偶联的微珠可以通过质谱流式细胞技术分析来区分。

然后将包含不同组合元素和引物的上述三种微珠的混合物分别与包括H

PCR之后，通过0.25μm柱纯化样品中的微珠，然后重悬于含有SA-Eu151检测元素标签的缓冲液中并温育数分钟，随后通过质谱流式细胞仪进行分析。

图8A-图8C示出了通过质谱流式细胞技术分析从包含H

表4具有组合元素标签的微珠上Eu151的定量

图8A-图8C和表4表明CD3、CD4和CD19在PBMC中均高表达，然而，CD3、CD4和CD19在HEK293细胞中的表达水平均相对较低。这些发现与这些细胞的已知特征一致，表明本申请的方法在定量核酸样品方面的准确性和灵敏度。