黄瓜白粉病菌胁迫相关基因CsRab11A及应用

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，涉及一种黄瓜白粉病菌胁迫相关基因CsRab11A及应用。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativus L.)是设施栽培的重要蔬菜作物。白粉病是黄瓜最严重的叶面病害之一，严重影响果实的产量和品质。目前，除应用化学防治方法外，主要依靠种植抗性品种，但长期种植及病菌的适应性变异，抗性水平逐渐下降。因此，明确黄瓜抗白粉病的分子机制也有利于黄瓜抗性新品种创制(Chen et al.,2021)。

Rab GTPase作为最大的小G蛋白家族，主要以GTP依赖性方式募集特定的效应蛋白来控制细胞内膜的转运(Stenmark,2009；Wandinger-Ness and Zerial,2014)。目前，关于Rab GTPase的研究仍主要集中在酵母和哺乳动物中，因其种类繁多及同亚族蛋白成员之间不同程度的功能冗余，在植物中的研究较少。近年来，植物Rab GTPase家族成员陆续被鉴定，通过囊泡运输在植物生长发育、细胞分裂、细胞壁沉积、细胞极性生长和应对外界环境胁迫中起重要作用(Ebine et al.,2011,2012a,2012b；Bottanelli et al.,2012；Goh etal.,2007；Cui et al.,2014；何铭，2018)。植物Rab蛋白在体内行使保守的细胞学功能，但也参与调控植物特异的细胞学过程，如光信号途径、多种环境胁迫和激素诱导胁迫等(Nicolas et al.,1998；Kang et al.,2001；Nahm et al.,2003；Bolte et al.,2000)。研究表明干旱、盐胁迫、冻害处理及外源ABA诱导下Rabs基因的表达显著上调(Nicolas etal.,1998；O'Mahony et al.,1999；Bolte et al.,2000)，表明这些Rabs参与以上胁迫应答反应。定位在拟南芥根尖细胞的高尔基体和质膜上的RabE1d主要参与调节分泌蛋白向质膜的转运，研究发现RabE1d还能够和抗病蛋白AvrPto发生相互作用，暗示RabE1d蛋白在植物的抗病反应中发挥重要作用(Speth et al.,2009)。

然而，Rab GTPase家族成员较多，植物中Rab GTPase序列多样性与其功能多样性之间的关系仍不明确。Rab GTPase对植物生长发育、胁迫响应及信号转导等的调节机制有待深入探索。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种黄瓜白粉病菌胁迫相关基因CsRab11A及应用，从黄瓜“新泰密刺”中分离得到CsRab11A基因，构建该基因的植物过表达载体、沉默表达载体。通过农杆菌介导法，将该基因转化黄瓜子叶中，以实现CsRab11A基因的功能分析。

本发明是这样实现的，提供一种黄瓜白粉病菌胁迫相关基因CsRab11A，基因CsRab11A的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供上述的黄瓜白粉病菌胁迫相关基因CsRab11A编码的蛋白质，基因CsRab11A编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供用于扩增上述的黄瓜白粉病菌胁迫相关基因CsRab11A的引物，包括CsRab11A-F和CsRab11A-R、TRV-CsRab11A-F和TRV-CsRab11A-R，核苷酸序列如下：

CsRab11A-F:5'-TTGATACATATGCCCGTCGACATGGCGAGCGGTGGTGG-3'

CsRab11A-R:5'-GCCCTTGCTCACCATGGATCCTGTTGAACAGCACATCTTGCTC-3'

TRV-CsRab11A-F:5'-GTAAGGTTACCGAATTCTAGACGTGATATCATAAACAAGCATTGC-3'

TRV-CsRab11A-R:5'-GGCCTCGAGACGCGTGAGCTCATGGCGAGCGGTGGTGG-3'

其中，引物5'端的前15个碱基是构建过表达载体所需，不属于CsRab11A的基因序列，紧接着的6个碱基是酶切位点；CsRab11A-F/CsRab11A-R用于构建过表达载体，其中CsRab11A-R去掉了终止密码子；TRV-CsRab11A-F/TRV-CsRab11A-R用于构建沉默表达载体，基因沉默选取CsRab11A基因编码区序列的前300bp设计引物。

本发明提供含有上述的黄瓜白粉病菌胁迫相关基因CsRab11A的植物过表达载体，为pRI101-GFP-CaMV35S-CsRab11A。

本发明提供含有上述的黄瓜白粉病菌胁迫相关基因CsRab11A的植物沉默表达载体，为TRV-CsRab11A。

本发明提供上述的黄瓜白粉病菌胁迫相关基因CsRab11A在提高植物抗白粉病菌胁迫中的应用。

本发明提供上述的黄瓜白粉病菌胁迫相关基因CsRab11A的植物过表达载体的应用，具体为pRI101-GFP-CaMV35S-CsRab11A在降低植物抗病性中的应用。

本发明提供上述的黄瓜白粉病菌胁迫相关基因CsRab11A的植物沉默表达载体的应用，具体为TRV-CsRab11A在提高植物抗病性中的应用。

优选的，根据上述的应用，所述植物为黄瓜“新泰密刺”。

进一步优选，根据上述的应用，采用农杆菌介导法，将基因CsRab11A转化到黄瓜子叶。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

利用现有植物基因工程技术，本发明克隆了黄瓜白粉病菌胁迫相关基因CsRab11A，并通过农杆菌介导的方法将该基因转入黄瓜子叶，经过比较分析证明，沉默转基因子叶抗白粉病菌胁迫的能力明显提高，过表达转基因子叶抗白粉病菌胁迫的能力降低。

附图说明

图l为CsRab11A基因全长681bp的cDNA序列的扩增结果及CsRab11A基因cDNA前300bp序列，其中M为DL 2000；

图2为pRI101-GFP-CaMV35S-CsRab11A和TRV-CsRab11A重组载体测序比对结果；

图3为转化pRI101-GFP-CaMV35S-CsRab11A和TRV-CsRab11A的农杆菌的菌落PCR结果；

图4为转基因黄瓜子叶表型鉴定及qRT-PCR检测结果；

图5为pRI101-GFP-CaMV35S-CsRab11A在黄瓜原生质体表达情况；

图6为对照组与转基因黄瓜子叶病原菌处理比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1、黄瓜CsRab11A基因的克隆

(1)以黄瓜“新泰密刺”为试材；

(2)利用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒的方法提取总RNA，反转录合成cDNA第一链；

基因的克隆：以反转录的cDNA第一链为模板，利用引物CsRab11A-F/CsRab11A-R和TRV-CsRab11A-F/TRV-CsRab11A-R进行PCR扩增，回收PCR产物，分别获得681bp和300bp的目的片段(图1)。

实施例2、植物表达载体构建

将纯化后的胶回收产物CsRab11A全长及编码区前300bp序列，应用In-Fusion HDCloning kit连入pRI101-GFP-CaMV35S和TRV2线性大片段中，反应体系为：2μL 5×In-Fusion HD Enzyme Premix，2μL线性大片段，6μL目的基因片段，50℃反应15min。将连接产物转至大肠杆菌感受态DH5α中，经菌落PCR及测序鉴定，摇菌、提质粒获得带有目的基因的植物表达载体pRI101-GFP-CaMV35S-CsRab11A和TRV-CsRab11A，送到专业机构测序，结果见图2。之后转化农杆菌EHA105感受态细胞，做菌落PCR鉴定(图3)，得到的含有重组质粒的农杆菌用于黄瓜子叶的转化。

实施例3、瞬时转化黄瓜子叶进行功能验证

(1)重组质粒转化黄瓜子叶

提取含有目的基因CsRab11A的农杆菌EHA105阳性克隆，接种于含有50μg mL

(2)黄瓜基因瞬时过表达株系鉴定

(a)荧光检测及表型检测：pRI101-GFP-CaMV35S-CsRab11A过表达载体含有GFP标签，用于检测植株中特定基因的转化效果及亚细胞定位情况，仅注射农杆菌EHA105(Con.)及注射pRI101-GFP-CaMV35S农杆菌的黄瓜子叶为对照，应用激光共聚焦显微镜检测黄瓜原生质体中CsRab11A-GFP融合蛋白的表达情况，在注射pRI101-GFP-CaMV35S、pRI101-GFP-CaMV35S-CsRab11A的黄瓜原生质体中均检测到荧光信号，表明pRI101-GFP-CaMV35S-CsRab11A表达载体在子叶中成功表达(图4)。

病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术瞬时转化植株会在叶片上产生病斑，通过子叶病斑积累情况检测TRV-CsRab11A农杆菌菌液的转化情况，在注射TRV1/TRV-CsRab11A农杆菌的黄瓜子叶上有大量病毒斑点(图5A左)，表明沉默表达载体TRV1/TRV-CsRab11A成功在黄瓜子叶中表达。

(b)PCR检测：进一步检测CsRab11A基因的表达情况，提取瞬时转化5d的黄瓜子叶总RNA并反转录合成cDNA，通过qRT-PCR技术检测瞬时过表达子叶中CsRab11A基因的表达情况。注射TRV1/TRV-CsRab11A农杆菌菌液的黄瓜中CsRab11A基因的表达量显著降低；注射含有重组质粒pRI101-GFP-CaMV35S-CsRab11A农杆菌菌液的黄瓜中CsRab11A基因的表达量显著升高(图5B)。结果表明，CsRab11A成功在黄瓜子叶中瞬时沉默和过表达。

实施例4、瞬时表达CsRab11A基因对黄瓜白粉病菌的抗性鉴定

将转基因黄瓜子叶接种白粉病菌并观察其发病情况。结果表明，注射pRI101-GFP-CaMV35S-CsRab11A的黄瓜子叶显现出更加明显的白粉病病斑积累，发病情况较对照组(EHA105)严重；注射TRV1/TRV-CsRab11A的黄瓜子叶白粉病发病情况较轻(图6a)。病情指数调查分析，CsRab11A过表达植株的病情指数是45.48±1.89，而Con.和注射TRV1/TRV-CsRab11A植株的病情指数分别是27.14±1.24和23.33±0.71(图6b)。因此，CsRab11A基因的沉默显著提高了黄瓜对白粉病菌胁迫的抗性。