H9N2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体地说，涉及一种H9N2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

H9N2亚型禽流感病毒流传在世界各地的鸟类中，并跨越欧亚大陆流行于地方性家禽种群中。自1878年首次报道禽流感以来，世界各地都相继报道了该病的暴发，给当地养禽业带来了巨大的经济损失。近年来，不断有禽流感从哺乳动物和人体分离的报道，给人类生命健康造成巨大威胁。

流感病毒会经常发生变异，以前流行的H9N2亚型禽流感主要属于以BJ/94毒株为代表分支；2004~2008年分离的毒株逐渐属于以F/98株为代表分支，并且在2002~2003年可能发生了重要的抗原漂变并逐渐适应在鸡群内复制和传播，而近些年分离的H9N2毒株主要属于Y28株为代表的的分支，即Calde9.4.2.5分支。

目前国内H9亚型禽流感疫苗主要用鸡胚生产，鸡胚由于其本身特殊性容易受到孵化等周期影响，并且生产过程中操作活毒，人工成本高，并且生产后的鸡胚需要昂贵的处理费用。杆状病毒表达系统具有高效表达、安全、易操作等特点，昆虫细胞可以完全无血清悬浮培养，生产易放大，非常适合用于基因工程亚单位疫苗开发。

因此研制一种生产成本低、生产效率高以及免疫效果好的H9N2亚型禽流感基因工程亚单位疫苗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种H9N2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽由H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白胞外区如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。

第二方面，本发明提供编码所述多肽的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

第四方面，本发明提供所述多肽、编码所述多肽的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料在制备H9N2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。

第五方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含所述多肽和药学上可接受的载体。

第六方面，本发明提供一种疫苗组合物，其包含所述免疫原性组合物。

第七方面，本发明提供一种重组杆状病毒，所述重组杆状病毒包含编码所述多肽的核酸分子。

第八方面，本发明提供所述重组杆状病毒在H9N2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗生产中的应用。

第九方面，本发明提供一种H9N2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗，所述疫苗包含所述多肽和疫苗佐剂。

第十方面，本发明提供H9N2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法，包括：采用所述重组杆状病毒感染sf9或hi5昆虫细胞后，培养细胞并收集上清，从上清中分离纯化获得抗原蛋白，与疫苗佐剂混合，即得。

具体方法如下：

（1）人工合成如SEQ ID NO:2所示的基因序列，将改基因序列构建到pFastBac1载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性穿梭载体；然后将穿梭载体转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，筛选（蓝白斑筛选）阳性重组Bacmid；接种白斑到含有卡那霉素、庆大霉素和四环素的LB液体培养基中过夜培养；收集菌液，提取重组穿梭质粒Bacmid DNA并对重组Bacmid进行测序鉴定；

（2）取无血清悬浮培养的sf9细胞，待细胞密度为2.0×10

（3）取无血清悬浮培养的sf9细胞，待细胞密度为2.0×10

（4）按照（3）同样的方法连续传5-6代。取无血清悬浮培养的hi5细胞，待细胞密度为2.0×10

（5）将（4）收获的上清过His亲和层析柱，用洗脱液洗脱，收集洗脱液，即为抗原蛋白溶液，并检测抗原蛋白溶液中蛋白的纯度和浓度；

（6）取抗原蛋白溶液94~96份，加入吐温-80 4~6份搅拌溶解，作为水相，另取白油94~96份，司本-80 4~6份混匀，作为油相；取油相2~3份，加入水相1~1.5份，乳化20~40min（优选取抗原蛋白溶液96份，加入吐温-80 4份搅拌溶解，作为水相，另取白油94份，司本-80 6份混匀，作为油相；取油相2份，加入水相1份，乳化30min），即得H9N2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗。

本发明中，所述份为重量份。

第十一方面，本发明提供所述疫苗或按照上述方法制备的疫苗在制备治疗或预防H9N2亚型禽流感病毒感染的药物中的应用。

本发明通过截取H9N2亚型禽流感病毒保护性抗原HA蛋白的胞外区，构建含有HA胞外区基因的穿梭载体，转染sf9昆虫细胞，拯救重组病毒，并通过hi5细胞进行分泌表达，通过亲和层析进行纯化，获得HA蛋白抗原，加入佐剂，乳化，制备得到H9N2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗。本发明制备方法简单，克服了以鸡胚生产疫苗的缺点，耗时短，表达量高，可在反应器中实现细胞悬浮培养，有利于大规模生产，所制备的基因工程亚单位疫苗免疫效果良好，能有效预防H9N2亚型禽流感病毒的感染。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中健康细胞（左）和病变细胞（右）对比。

图2为本发明较佳实施例中重组蛋白的Western Blot检测结果。

图3为本发明较佳实施例中重组蛋白的SDS-PAGE检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW，Molecular Cloning: a Laboratory Manual，2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 穿梭载体的设计与构建

根据实验室分离到的H9N2流行毒株，截取该毒株HA蛋白第1-400位氨基酸残基，设计编码基因序列，其N端加入起始密码子ATG，末端加入6×His标签CATCATCATCATCACCAC及终止密码子TAA序列，进行昆虫细胞密码子优化（优化后的HA蛋白截短体的编码基因序列如SEQID NO:2所示），送至生物公司进行合成，并通过同源重组的方式连接到pFastBac1载体（购自Invitrogen公司）中，获得pFastBac1-9HA。

实施例2 阳性重组Bacmid的筛选及重组杆状病毒获得

1、取穿梭载体pFastBac1-9HA 5μg，转化DH10Bac感受态，冰上孵育30min，42℃热激90s，冰上孵育5min，加入无抗LB培养基，37℃摇床190rpm培养4h，取10μl菌液涂布三抗平板，37℃恒温培养箱培养48h，待蓝白斑明显后，挑取白斑加入三抗（含有卡那霉素、庆大霉素和四环素）LB培养基进行过夜培养。

2、收集菌液，12000rpm离心收集菌体，采用异丙醇沉淀法提取重组Bacmid，用分光光度计检测Bacmid浓度，重组Bacmid浓度为3000ng/μl。

3、取无血清悬浮培养的sf9细胞，待细胞密度为2.5×10

实施例3 重组杆状病毒的扩繁及蛋白的表达

1、取无血清悬浮培养的sf9细胞，待细胞密度为2.5×10

2、取无血清悬浮培养的hi5细胞，待细胞密度为2.5×10

实施例4 重组HA蛋白的纯化

1、hi5细胞接种重组杆状病毒72-96h，待细胞膨大，折光率降低，收获培养物，8000rpm离心30min，收集细胞上清，用0.45μm水性滤膜过滤，除去小的细胞碎片，备用。

2、用超纯水清洗His预装柱，清洗5个柱体积，然后用结合缓冲液（20mM Tris、50mMNaCl和20mM咪唑）处理预装柱，5个柱体积，处理完毕后，将抽滤的细胞上清结合His亲和层析柱（购自GE公司，商品型号Histrap HP），直至结合完毕，然后用洗脱缓冲液（20mM Tris、50mM NaCl和300mM咪唑）进行洗脱，洗脱完毕的重组蛋白制样，进行SDS-PAGE电泳鉴定，结果显示蛋白正确表达（图3），经分光光度计检测，其表达水平为200mg/L，血凝效价达2

实施例5 H9N2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗的制备及免疫原性鉴定

1、将重组蛋白稀释至相应浓度，作为水相，每羽份剂量分别为10μg、20μg、30μg、40μg、50μg，取96份上清，加入4份吐温-80，搅拌溶解，作为水相，取白油94份，司本-80 6份，混合均匀，作为油相，取油相2份，缓缓加入1份水相，3000rpm乳化30分钟，即得H9N2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗，4℃保存。

2、取70只21日龄SPF鸡，肌肉注射疫苗，平均分成7组，每组10只，第一组为空白对照组（注射无菌PBS，0.5ml/只），第二组免疫常规H9亚型胚苗WJ57株（配制方法为：将制备好的血凝价为2

3、免疫21天后，进行攻毒A/Chicken/Jiangsu/JS-1/2002（liu JH, et al.Geneticconservation of Hemagglutinin Gene of H9 Influenza virus in Chickenpopulation in mainland China），攻毒剂量为10

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 乾元浩生物股份有限公司

<120> H9N2亚型禽流感病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用

<130> KHP201118927.1YS

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 400

<212> PRT

<213> 禽流感病毒(Avian influenza virus)

<400> 1

Met Glu Thr Ile Ser Leu Met Thr Ile Leu Leu Val Ala Thr Val Ser

1 5 10 15

Asn Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu

20 25 30

Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Ala Lys

35 40 45

Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Ser Leu

50 55 60

Gly Asn Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Gly Asn Pro Ser Cys Asp Pro Leu Leu Gly Gly Arg Glu Trp Ser Tyr

85 90 95

Ile Val Glu Arg Pro Ser Ala Val Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Ser

100 105 110

Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Ser Leu Phe Ser Ser Ala Arg Ser

115 120 125

Tyr Gln Arg Ile Gln Ile Phe Pro Asp Thr Ile Trp Asn Val Ser Tyr

130 135 140

Ser Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Asp Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg

145 150 155 160

Trp Leu Thr Gln Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Ile Gln Asp Ala Gln Tyr

165 170 175

Thr Asn Asn Gln Glu Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile Asn His

180 185 190

Pro Pro Thr Glu Thr Val Gln Thr Asn Leu Tyr Thr Arg Thr Asp Thr

195 200 205

Thr Thr Ser Val Ala Thr Glu Glu Ile Asn Arg Ile Phe Lys Pro Leu

210 215 220

Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Leu Met Gly Arg Ile Asn Tyr

225 230 235 240

Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Lys Ser Asp

245 250 255

Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser

260 265 270

His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Lys Arg Gly Ser Cys Thr Val

275 280 285

Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Thr Thr Leu Pro Phe Gln

290 295 300

Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Ser Lys Tyr Ile Gly Ile

305 310 315 320

Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser Arg Ser

325 330 335

Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp

340 345 350

Ser Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln

355 360 365

Gly Val Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp

370 375 380

Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Val Asp Lys Met Asn Lys Gln

385 390 395 400

<210> 2

<211> 1200

<212> DNA

<213> 禽流感病毒(Avian influenza virus)

<400> 2

atggagacaa tatcactaat gactatacta ctagtggcaa cagtaagcaa tgcagataag 60

atctgcatcg gctatcaatc aacaaactcc acagaaactg tggacacact aacagaaaac 120

aatgtccctg tgacacatgc caaagaactg ctccacacag agcataatgg gatgctgtgt 180

gcaacaagct tgggaaaccc tcttattcta gacacttgca ccattgaagg gctaatttat 240

ggcaatcctt cttgtgatcc attgctggga ggaagagaat ggtcctatat cgtcgagaga 300

ccatcagctg ttaacggatt gtgttatccc gggagtgtag aaaatctaga agagctaagg 360

tcacttttta gttctgctag gtcttatcaa aggatccaaa tcttcccaga cacaatctgg 420

aatgtgtctt acagtgggac aagcaaagca tgctcagatt cattctacag aagcatgagg 480

tggttgactc aaaagaacaa cgcttacccc attcaagatg ctcaatacac aaataatcaa 540

gagaagaaca ttcttttcat gtggggcata aatcacccac ccaccgaaac tgtgcagaca 600

aatctgtaca caagaaccga cacaacaacg agtgtggcaa cagaagaaat aaataggatc 660

ttcaaaccat tgataggacc aaggcctctt gtcaacggtt tgatgggaag aattaattat 720

tattggtcgg tattgaaacc gggtcaaaca ctgcgaataa aatctgatgg gaacctaata 780

gctccatggt atggacacat tctttcagga gagagccacg gaagaatcct gaagactgat 840

ttaaaaaggg gtagctgcac agtgcagtgt cagacagaga aaggtggatt aaatacaaca 900

ttgccattcc aaaatgtgag taagtatgcc tttggaaact gctcaaagta cattggcata 960

aagagtctca aacttgcagt tggtctgagg aatgtgcctt ctagatctag tagaggacta 1020

ttcggggcca tagcaggatt tatagaggga ggttggtcag gactagttgc tggttggtat 1080

gggttccagc attcaaatga ccaaggggtt ggtatggcag cagatagaga ctcaacccaa 1140

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