一种治疗严重腹泻的植物提取物

技术领域

本发明涉及一种治疗严重腹泻的植物提取物，属于医药技术领域。

背景技术

腹泻(diarrhea)是一种常见症状，俗称“拉肚子”，是指排便次数明显超过平日习惯的频率，粪质稀薄，水分增加，每日排便量超过200g，或含未消化食物或脓血、黏液。腹泻常伴有排便急迫感、肛门不适、失禁等症状。据不完全统计，全球每年约有17～50亿人次发生腹泻，造成140万人死亡，其中，一些婴幼儿每年发生3次以上的腹泻，腹泻也是造成发展中国家5岁以下婴幼儿营养不良与死亡的主要原因。

腹泻的病因有很多，例如，感染性肠炎(主要由细菌、病毒、寄生虫和真菌等入侵所致)、泻药(引发腹泻的药物可分为刺激性泻药、容积性泻药、润滑性泻药等)、肠功能紊乱(主要由指冷热交替、拥挤、捕捉、惊恐、长途运输、断奶等造成)、抗生素、过敏原、化疗、全身性疾病(包括肠结构异常疾病、肿瘤与息肉病、原发性吸收不良综合症等)等均可引起腹泻，多种病因共存时，还可引发顽固性腹泻(又称严重腹泻)。据不完全统计，我国每年有5000余万人长期忍受着顽固性腹泻的折磨。

目前，治疗腹泻的药物常以西药的各种消炎杀菌制剂为主，这些药物对感染性肠炎引起的感染性腹泻很有效，但对其他原因引起的药物型腹泻、应激型腹泻、抗生素型腹泻、过敏型腹泻等其他腹泻常常无效，并且，这些药物中含有抗生素以及其他消炎成分，易引起抗药性，副作用也较大。

肠上皮细胞对液体和电解质的过度分泌与吸收障碍是腹泻发病机制的两个重要因素，因此，减少肠液分泌和促进肠液吸收是可普遍治疗多种原因引起的腹泻的有效手段。从减少肠液分泌和促进肠液吸收这两点出发，或可找到一种可预防和/或治疗多种原因引起的腹泻、不易引起抗药性且无副作用的药物。

杨梅属于木兰纲、杨梅科、杨梅属小乔木或灌木植物，又称圣生梅、白蒂梅、树梅具有很高的药用和食用价值，在中国华东和湖南、广东、广西、贵州等地区均有分布。杨梅具有生津解渴，和胃消食，治烦渴，痢疾，腹痛，涤肠胃，解酒的功效。

目前，关于杨梅提取物在制备预防和/或治疗非感染性腹泻和减少小肠积液的药物中的应用尚无报道。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供了杨梅提取物的新用途，即提供了杨梅提取物在制备预防和/或治疗腹泻和减少小肠积液的药物中的应用。

为解决上述问题，本发明提供了植物提取物在制备产品中的应用，所述植物提取物为杨梅提取物；所述产品具有如下至少一种用途：

(a)预防和/或治疗腹泻；和/或，

(b)减少小肠积液。

在本发明的一种实施方式中，所述腹泻为药物型腹泻、感染型腹泻、应激型腹泻、抗生素型腹泻或过敏型腹泻；所述小肠积液为腹泻、肠梗阻、肠转转、肠炎、肠道息肉或肠道肿瘤引起的小肠积液。

在本发明的一种实施方式中，所述杨梅提取物的制备方法包括如下步骤：

取杨梅采用水和/或有机溶剂进行提取后进行固液分离，取上清液，得到杨梅提取物；

或者，取杨梅采用水和/或有机溶剂进行提取后进行固液分离，取上清液，将上清液进行层析柱纯化和/或萃取，得到杨梅提取物。

在本发明的一种实施方式中，所述杨梅提取物的制备方法包括如下步骤：取杨梅采用水和/或有机溶剂进行提取后进行固液分离，取上清液，将上清液进行层析柱纯化后进行萃取或者进行层析柱纯化后再次进行层析纯化，得到杨梅提取物。

在本发明的一种实施方式中，在所述提取过程中，取杨梅采用水和/或醇水溶液在温度为-4～50℃下浸提6h～7d。

在本发明的一种实施方式中，可以在搅拌条件下进行浸提，浸提的温度为40～50℃、时间为6～24h、搅拌速度为100～200rpm。

在本发明的一种实施方式中，可以在静置条件下进行浸提，浸提的温度为-4～25℃、时间为3～7d。

在本发明的一种实施方式中，所述有机溶剂为乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇中的一种或一种以上。

在本发明的一种实施方式中，所述有机溶剂为体积分数为10～50％的乙醇水溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述固液分离为离心或者过滤。

在本发明的一种实施方式中，在所述层析纯化过程中，采用大孔吸附树脂进行层析纯化1～3次，每次采用体积分数为30～95％的乙醇-水进行梯度洗脱，收集洗脱液。

在本发明的一种实施方式中，所述梯度洗脱的流速为2～4BV/h，每个梯度2～4个柱体积。

在本发明的一种实施方式中，所述大孔吸附树脂为大孔吸附树脂AB-8、大孔吸附树脂D101或大孔吸附树脂XAD1600。

在本发明的一种实施方式中，在所述萃取过程中，依次采用除杂剂、活性部位提取剂为萃取剂进行萃取；所述除杂剂为石油醚和/或氯仿；所述活性部位提取剂为乙酸乙酯和/或正丁醇。

本发明还提供了一种制备植物提取物的方法，所述植物提取物为杨梅提取物；所述杨梅提取物的制备方法包括如下步骤：

取杨梅采用水和/或有机溶剂进行提取后进行固液分离，取上清液，得到杨梅提取物；

或者，取杨梅采用水和/或有机溶剂进行提取后进行固液分离，取上清液，将上清液进行层析柱纯化和/或萃取，得到杨梅提取物。

在本发明的一种实施方式中，所述杨梅提取物的制备方法包括如下步骤：取杨梅采用水和/或有机溶剂进行提取后进行固液分离，取上清液，将上清液进行层析柱纯化后进行萃取或者进行层析柱纯化后再次进行层析纯化，得到杨梅提取物。

在本发明的一种实施方式中，在所述提取过程中，取杨梅采用水和/或醇水溶液在温度为-4～50℃下浸提6h～7d。

在本发明的一种实施方式中，可以在搅拌条件下进行浸提，浸提的温度为40～50℃、时间为6～24h、搅拌速度为100～200rpm。

在本发明的一种实施方式中，可以在静置条件下进行浸提，浸提的温度为-4～25℃、时间为3～7d。

在本发明的一种实施方式中，所述有机溶剂为乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇中的一种或一种以上。

在本发明的一种实施方式中，所述有机溶剂为体积分数为10～50％的乙醇水溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述固液分离为离心或者过滤。

在本发明的一种实施方式中，在所述层析纯化过程中，采用大孔吸附树脂进行层析纯化1～3次，每次采用体积分数为30～95％的乙醇-水进行梯度洗脱，收集洗脱液。

在本发明的一种实施方式中，所述梯度洗脱的流速为2～4BV/h，每个梯度2～4个柱体积。

在本发明的一种实施方式中，所述大孔吸附树脂为大孔吸附树脂AB-8、大孔吸附树脂D101或大孔吸附树脂XAD1600。

在本发明的一种实施方式中，在所述萃取过程中，依次采用除杂剂、活性部位提取剂为萃取剂进行萃取；所述除杂剂为石油醚和/或氯仿；所述活性部位提取剂为乙酸乙酯和/或正丁醇。

本发明还提供了上述制备植物提取物的方法制得的植物提取物。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗腹泻的产品，所述产品含有上述制备植物提取物的方法制得的植物提取物。

在本发明的一种实施方式中，所述腹泻为药物型腹泻、感染型腹泻、应激型腹泻、抗生素型腹泻或过敏型腹泻。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品或药品。

在本发明的一种实施方式中，所述药品为所述杨梅提取物按照常规工艺，加入常规辅料制成临床上可接受的凝胶剂、乳霜剂、片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂、糖浆剂、煎膏剂、栓剂、气雾剂、贴膏剂、软膏剂、注射剂、喷剂、搽剂、酊剂、湿敷剂、糊剂、洗剂或者缓控释制剂。

本发明技术方案，具有如下优点：

1、本发明提供了杨梅提取物在制备预防和/或治疗腹泻的产品中的应用，研究发现将杨梅用水和/或有机溶剂提取后经层析柱纯化和/或萃取得到的杨梅提取物可显著降低腹泻小鼠的小肠积液(FA)，说明用水或有机溶剂提取得到的杨梅提取物具有预防和/或治疗腹泻的作用。

2、本发明提供了杨梅提取物在制备预防和/或治疗腹泻的产品中的应用，通过采用大孔吸附树脂进行层析纯化后，采用体积分数为30～95％的乙醇-水进行梯度洗脱，和/或，采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯为萃取剂进行萃取或者依次采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇为萃取剂进行萃取，可以有效的富集杨梅中的有效成分，得到的杨梅提取物具有更好地降低腹泻小鼠的小肠积液的能力。并且，由于杨梅提取物来源于杨梅，杨梅作为一种常见水果，对人体无副作用且不会引起抗药性，说明用水或有机溶剂提取得到的杨梅提取物在用于预防和/或治疗腹泻时对人体无副作用且不会引起抗药性。

3、本发明提供了杨梅提取物在制备预防和/或治疗腹泻的产品中的应用，研究发现尽管高温有利于提取出更多地有效成分，然而其可能会破坏杨梅中可发挥治疗腹泻作用的有效成分，本发明采用水和/或醇水溶液在温度为-4～50℃下浸提6h～7d，能够在避免对于腹泻发挥作用的有效成分破坏的基础上，提取出更多的有效成分，从而提高对腹泻的疗效。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

下述实施例中涉及的小鼠为8～10周龄、体重19～21g的SPF级雌雄性C57BL/6小鼠，购自北京维通利华公司；下述实施例中涉及的霍乱毒素(CT)购自上海懋康生物科技有限公司(货号MX0931-5ml，浓度50μg/mL)；下述实施例中涉及的氯丙嗪包衣片购自上海信谊药厂有限公司(50mg/片)；下述实施例中涉及的D101、AB-8、LX-1600R大孔树脂柱购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司；下述实施例中涉及的XAD1600大孔树脂柱购自陶氏化学。

实施例1：杨梅提取物的制备

具体步骤如下：

取新鲜杨梅5kg，去核，得到去核杨梅；在去核杨梅中加入5kg去离子水，50℃、200rpm下搅拌24h，得到混合物；将混合物板框过滤，取上清，得到杨梅提取物1A；将杨梅提取物1A经D101大孔树脂柱(大孔树脂柱的直径为6cm、高度为42cm、柱体积为1200mL)层析纯化后，依次用水、95％(v/v)的乙醇-水梯度洗脱(梯度洗脱的流速为3BV/h，每个梯度3个柱体积)，分别收集洗脱液，50℃进行减压浓缩、干燥，得到杨梅提取物1B、1C。

实施例2：杨梅提取物的制备

具体步骤如下：

取新鲜杨梅5kg，去核，得到去核杨梅；在去核杨梅中加入10kg去离子水，-4℃浸泡3d，得到混合物；将混合物板框过滤，取上清，得到杨梅提取物2A；将杨梅提取物2A经D101大孔树脂柱(大孔树脂柱的直径为6cm、高度为42cm、柱体积为1200mL)层析纯化后，依次用5％(v/v)、95％(v/v)的乙醇-水梯度洗脱(梯度洗脱的流速为3BV/h，每个梯度3个柱体积)，分别收集洗脱液，50℃进行减压浓缩、干燥，得到杨梅提取物2B、2C；在杨梅提取物2C中加入纯水稀释至500mL，得到混合液；将混合液依次用2倍质量的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇为萃取剂萃取3次，收集石油醚萃取液的有机相，50℃进行减压浓缩、干燥，得到杨梅提取物2D，收集氯仿萃取液的有机相，50℃进行减压浓缩、干燥，得到杨梅提取物2E，收集乙酸乙酯萃取液的有机相，50℃进行减压浓缩、干燥，得到杨梅提取物2F，收集正丁醇萃取液的有机相，50℃进行减压浓缩、干燥，得到杨梅提取物2G。

实施例3：杨梅提取物的制备

具体步骤如下：

取新鲜杨梅5kg，去核，得到去核杨梅；在去核杨梅中加入10kg 10％(v/v)的乙醇，25℃浸泡5d，得到混合物；将混合物纱布过滤，取上清，得到杨梅提取物3A；将杨梅提取物3A经XAD1600大孔树脂柱(大孔树脂柱的直径为6cm、高度为42cm、柱体积为1200mL)层析纯化后，依次用10％(v/v)、95％(v/v)的乙醇-水梯度洗脱(梯度洗脱的流速为3BV/h，每个梯度3个柱体积)，分别收集洗脱液，50℃进行减压浓缩、干燥，得到杨梅提取物3C、3D。

实施例4：杨梅提取物的制备

具体步骤如下：

取新鲜杨梅5kg，去核，得到去核杨梅；在去核杨梅中加入5kg 30％(v/v)的乙醇，40℃、100rpm下搅拌6h，得到混合物；将混合物4000rpm离心30min，取上清，得到杨梅提取物4A；将杨梅提取物4A经AB-8大孔树脂柱(大孔树脂柱的直径为6cm、高度为42cm、柱体积为1200mL)层析纯化后，依次用水、10％(v/v)、95％(v/v)的乙醇-水梯度洗脱(梯度洗脱的流速为3BV/h，每个梯度3个柱体积)，分别收集洗脱液，50℃进行减压浓缩、干燥，得杨梅提取物杨梅提取物4B、4C、4D；在杨梅提取物4D中加入纯水稀释至500mL，得到混合液；将混合液经LX-1600R大孔树脂柱(大孔树脂柱的直径为4cm、高度为48cm、柱体积为600mL)层析纯化后，依次用30％(v/v)、60％(v/v)、95％(v/v)的乙醇-水梯度洗脱(梯度洗脱的流速为3BV/h，每个梯度3个柱体积)，分别收集洗脱液，50℃进行减压浓缩、干燥，得杨梅提取物杨梅提取物4E、4F、4G。

实施例5：杨梅提取物的制备

具体步骤如下：

取新鲜杨梅10kg，去核，得到去核杨梅；在去核杨梅中加入10kg 50％(v/v)的乙醇，25℃浸泡7d，得到混合物；将混合物板框过滤，取上清，得到杨梅提取物5A；将杨梅提取物5A经AB-8大孔树脂柱(大孔树脂柱的直径为6cm、高度为42cm、柱体积为1200mL)层析纯化后，依次用水、95％(v/v)的乙醇-水梯度洗脱(梯度洗脱的流速为3BV/h，每个梯度3个柱体积)，分别收集洗脱液，50℃进行减压浓缩、干燥，得杨梅提取物杨梅提取物5B、5C；在杨梅提取物5C中加入纯水稀释至500mL，得到混合液；将混合液依次用2倍质量的石油醚、正丁醇为萃取剂萃取2次，收集石油醚萃取液的有机相，50℃进行减压浓缩、干燥，得到杨梅提取物5D，收集正丁醇萃取液的有机相和水相，分别于50℃进行减压浓缩、干燥，得到杨梅提取物5E、5F。

对比例1：杨梅提取物的制备

具体步骤如下：

取新鲜杨梅10kg，去核，得到去核杨梅；在去核杨梅中加入2倍重量的水，于95℃下煎煮1h，得到混合物；将混合物板框过滤，取上清，得到杨梅提取物6A。

对比例2：鹰嘴豆粉的制备

取鹰嘴豆粉80份、香蕉提取物20份、杨梅提取物1A 25份、凤尾草10份、车前草5份、山莓根15份、乌豆根15份，参照公开号为CN106511647A的专利申请文本，制备得到鹰嘴豆粉，具体步骤如下：

(1)粉料的制备

挑选优质的鹰嘴豆、凤尾草、车前草、山莓根、乌豆根，洗净晾干，分别用粉碎机进行初步粉碎至80目，再用超微粉碎均质机进行超微粉碎，粉碎至150目，将粉料放入65℃的烘干箱内分别进行干燥60min，粉料备用；

(2)提取物的制备

将香蕉和杨梅先用水浸泡2h，再加入8倍原料的水进行煎煮，先用武火煎煮至沸腾并继续煎煮20min，再用文火煎煮100min；冷却后加入体积分数为95％的乙醇，缓慢搅拌30min，静置2h后进行过滤，在滤液中加入纳豆粉并搅拌均匀，将混合液在90℃的温度下进行旋转加热，制得相对密度为1.30的流浸膏，再将流浸膏放入90℃的烘箱内干燥2h；将干燥的物料先用粉碎机粉碎至50目，再用超微粉碎均质机粉碎至150目，粉料备用；

(3)将步骤(1)中的鹰嘴豆粉、凤尾草粉、车前草粉、山莓根粉、乌豆根粉和步骤(2)制备的粉料进行充分混合，即得治疗腹泻的鹰嘴豆粉。

实验例1：杨梅提取物对顽固性腹泻小鼠小肠积液(Fluid accumulation,FA)的影响

具体步骤如下：

1、试剂与受试药物溶液的配制

7％NaHCO

25μg/mL霍乱毒素溶液：称取50μg/mL的霍乱毒素溶液，加入等体积的超纯水，加入NaHCO

2.5mg/mL氯丙嗪溶液：取氯丙嗪包衣片1片(50mg)，研磨均匀后混悬于20mL的质量分数为7％的NaHCO

5mg/mL受试药物溶液：称取受试药物，加入质量分数为0.5％的CMC-Na水溶液配制成浓度为5mg/mL的受试药物溶液。

2、试验方法

取小鼠132只，随机分为22组，每组6只，22组分别为：空白组、模型组、给药氯丙嗪的阳性组、分别给药受试药物1～19的受试组1～19，其中，受试药物1～19分别为实施例1～5制备的2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、1A、5A、5E，对比例1制备的6A，以及对比例2制备的鹰嘴豆粉7A。

实验开始后，空白组小鼠以0.4mL/只的计量灌胃7％NaHCO

造模6h后，将各组小鼠脱颈椎处死，检测各组小鼠的小肠积液，检测结果见表1；

其中，小鼠小肠积液(Fluid accumulation,FA)的测定方法如下：

将小鼠解剖后，用结扎线绑好小鼠小肠两端，然后剪下小肠段；将小鼠小肠解剖后，取出固形物，称量固形物质量以及去液体前、后小肠质量；根据称量结果计算小鼠小肠积液(Fluid accumulation,FA)，计算公式如下：

3、试验结果

由表1可知，与空白组相比，模型组小鼠的小肠积液明显增多；与模型组相比，受试组6、13、17小鼠的小肠积液极显著降低(P<0.001)，受试组1、3、7、11、12、15小鼠的小肠积液显著降低(P<0.05)，具有统计学差异，受试组8、14、15、16小鼠的小肠积液降低明显且效果优于受试组18、19，但无统计学意义。可见，杨梅提取物2C、2F、2G、4D、4F、5E具有降低腹泻小鼠小肠积液的作用，其中，2F、4F效果优于或与阳性药相当，在预防和/或治疗顽固性腹泻方面具有极高的应用前景。

并且，由表1可知，从受试物1～3的抑制率上看，受试物3＞受试物1＞受试物2，表明杨梅提取得到的杨梅提取物具有一定的活性，而层析柱纯化可进一步富集杨梅提取物中的有效成分，去除无效成分；从受试物3～7的抑制率上看，受试物6＞受试物3＞受试物7＞受试物5＞受试物4，表明对杨梅提取得到的杨梅提取物用乙酸乙酯和正丁醇进行萃取可更好的富集杨梅提取物中的有效成分，进一步提高其抑制率，而用石油醚和氯仿进行萃取仅可以可有效去除杨梅提取物中的杂质，并不能有效富集杨梅提取物中的有效成分；从受试物8～17的抑制率上看，受试物13＞受试组17＞受试物11＞受试物12＞受试组15＞受试组16＞受试物8＞受试物14＞受试物10＞受试物9，表明仅有使用体积分数为30～95％的乙醇-水对杨梅提取得到的杨梅提取物进行层析柱纯化才可提高其抑制率，并且，对纯化得到的产物再进行层析柱纯化或萃取可进一步提高其抑制率。

另外，阳性组小鼠在给药1h内，出现呼吸微弱，不动，身体发凉等症状，但仍有呼吸，3h后解剖，部分小鼠小肠表面毛细血管明显。可见，氯丙嗪可能有一定的毒性。而受试组小鼠均为出现任何不良反应。可见，杨梅提取物无毒性，安全性较高。

表1 不同组小鼠的小肠积液(n＝6，均值±SD)

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。