一种提高ARMS-TaqMan Blocker体系特异性的方法

技术领域

本发明涉及肿瘤突变检测技术领域，具体是一种提高ARMS-TaqMan Blocker体系特异性的方法。

背景技术

近年来，探针的非放射性标记受到广泛重视，同时得到迅速发展，广泛应用于核酸序列测定、基因检测以及疾病诊断等。ARMS技术是常用的荧光探针法，其基本原理是，如果引物的3’端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其3’端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。有时候为了提高特异性，会在体系中加入野生型模板扩增阻断剂(Blocker)，用以压制野生型模板的扩增，虽然这种方法在一定程度上可以压制野生，但是由于缺乏准确的Blocker设计软件和有效的筛选规则，导致压制效果不理想；另外，也可在ARMS引物的3’端倒数第二或第三个碱基处引入错配碱基，但是引入错配碱基通常会牺牲灵敏度。因此，常规ARMS-TaqMan Blocker系统一般很难同时做到灵敏度、特异性兼顾，常需要复杂繁琐的优化工作。

发明内容

针对常规ARMS-TaqMan Blocker体系很难同时做到灵敏度、特异性兼顾的问题，本发明提供一种提高ARMS-TaqMan Blocker体系特异性的方法。

本发明保护一种提高ARMS-TaqMan Blocker体系特异性的方法，将PCR抑制剂添加到PCR荧光定量检测体系中，PCR抑制剂可以为SDS、苯酚、乙醇、异丙醇、乙酸钠、氯化钠、EDTA或尿素。PCR抑制剂的添加量范围为24-40mM，优选32mM。

常规PCR反应抑制剂原则上会对扩增产生抑制，但对于ARMS体系来说，非特异扩增的产物量是极微量的，而特异性产物占绝大部分。当体系中加入一定量的PCR抑制剂之后，对特异性扩增不产生抑制，而非特异本身受到Blocker的强烈压制，本身含量较低，加入抑制剂之后，会被进一步抑制。

本发明还保护上述提高ARMS-TaqMan Blocker体系特异性的方法在肿瘤突变检测中的应用。

本发明首次将PCR抑制剂添加到PCR荧光定量检测体系中，抑制剂对非特异扩增产生明显的抑制作用，而对特异性扩增不产生抑制，从而达到降低非特异的目的。

附图说明

图1为E545K位点PCR抑制剂作用对比图；

图2为braf位点PCR抑制剂作用对比图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。

说明：本发明使用的引物、探针、Blocker通过软件TM Utility v1.3进行熔点预测，各引物、探针、Blocker的序列信息见下表1，其中F/R表示引物、P表示探针、B表示竞争性抑制剂Blocker、FAM为荧光基团、MGB为淬灭基团、方框表示LNA修饰的碱基、PHO表示磷酸化修饰。

表1

实施例1E545K位点PCR抑制剂的作用

一、引物、探针、Blocker设计

引物按照ARMS引物设计原则设计，引物长度15～38nt，GC含量40-60％，引物自身3’端避免发卡结构，引物之间避免4个碱基的匹配，碱基分布均匀，避免连续的GC或AT。上游ARMS引物的3’端与突变位点一致，下游引物为通用引物，可同时扩增野生和突变型模板。上游引物E545K-F4序列如表1中SEQ NO.01，下游引物E545K-R1序列如表1中SEQ NO.02。探针按照TaqMan探针设计原则设计，长度为14-35nt，GC含量60-70％，5’端第一个碱基避免为G，探针E545K-P序列如表1中SEQ NO.03；竞争性Blocker为E545K-B-1，序列如表1中SEQNO.04，PCR抑制剂使用1M氯化钠。

二、PCR反应体系配制

按照下表2进行PCR反应液配制，补充去离子水至25μl。第一组反应液只加纯水，不加氯化钠；第二组反应液氯化钠加16mM；第三组反应液氯化钠加24mM；第四组反应液氯化钠加32mM；第五组反应液氯化钠加40mM。

表2

三、样本准备

将E545K质粒10^3copies/μl与10ng/μl野生型基因组等体积混合，得到突变率为50％的标准品，将50％的标准品用10ng/μl野生型基因组进行稀释，得到1％和0.1％的标准品，准备10ng/μl野生型基因组，备用。

四、加样，上机

以上各组反应液均加入5μl 1％、0.1％的标准品和10ng/μl野生型基因组，0.1％做4个平行管，其他各做2个平行管。上机程序为：95℃2min，一个循环；95℃5s，56℃30s(不采集荧光)，72℃15s，10个循环；93℃3s，56℃30s(采集荧光)，60℃30s，35个循环。仪器使用SLAN96荧光PCR仪。

五、实验结果分析

参照图1，第一组反应液只加纯水，不加氯化钠，用黑色圆圈表示；第四组反应液氯化钠加32mM，用黑色方块表示。为了便于观察，未将其他组结果放入结果图1中。

实验结果显示，不加氯化钠的对一组(黑色圆圈)非特异较靠前，CT值较小；当加入16-24mM氯化钠时，不影响体系的灵敏度和特异性(结果未列出)；当氯化钠用量提高到32mM时(黑色方块)，不影响0.1％标准品的检出，且特异性比不添加氯化钠的更好，10ng/μl野生型基因组的CT值更靠后；当氯化钠用量进一步提高到40mM时，会影响灵敏度，0.1％标准品相对靠后(结果未列出)。

实验结果说明，适量PCR抑制剂的添加不影响体系灵敏度，更有利于压制微量野生型非特异模板的扩增，从而降低非特异信号。

实施例2braf位点PCR抑制剂作用

一、引物、探针、Blocker设计

引物按照ARMS引物设计原则设计，引物长度15-38nt，GC含量40-60％，引物自身3’端避免发卡结构，引物之间避免4个碱基的匹配，碱基分布均匀，避免连续的GC或AT。上游ARMS引物的3’端与突变位点一致，下游引物为通用引物，可同时扩增野生和突变型模板。上游引物braf-F序列如表1中SEQ NO.05，下游引物braf-R序列如表1中SEQ NO.06；探针按照TaqMan探针设计原则设计，长度为14-35nt，GC含量60-70％，5’端第一个碱基避免为G。探针braf-P序列如表1中SEQ NO.07；竞争性Blocker为braf-B2，序列如表1中SEQ NO.08，PCR抑制剂使用1M氯化钠。

二、PCR反应体系配制

按照下表3进行PCR反应液配制，补充去离子水至25μl。第一组反应液只加纯水，不加氯化钠；第二组反应液氯化钠加12mM；第三组反应液氯化钠加24mM；第四组反应液氯化钠加32mM；第五组反应液氯化钠加40mM。

表3

三、样本准备

将braf质粒10^3copies/μl与10ng/μl野生型基因组混合，得到突变率为50％的标准品，将50％的标准品用10ng/μl野生型基因组进行稀释，得到1％和0.1％的标准品，准备20ng/μl野生型基因组，备用。

四、加样，上机

以上各组反应液均加入5μl的1％和0.1％的标准品和20ng/μl野生型基因组，0.1％的做4个平行管，其他的各做2个平行管。上机程序为：95℃2min，一个循环；95℃5s，56℃30s(不采集荧光)，72℃15s，10个循环；93℃3s，56℃30s(采集荧光)，60℃30s，35个循环。仪器使用SLAN96荧光PCR仪。

五、实验结果分析

参照图2，第一组反应液只加纯水，不加氯化钠，用黑色圆圈表示；第四组反应液氯化钠加32mM，用黑色方块表示。为了便于观察，未将其他组结果放入结果图2中。

实验结果显示，不加氯化钠的一组(黑色圆圈)非特异最靠前，CT值最小；当加入12-24mM氯化钠时，不影响体系的灵敏度和特异性(结果未列出)；当氯化钠用量提高到32mM时(黑色方块)，不影响0.1％标准品，且特异性比不添加氯化钠的更好，20ng/μl野生型基因组的CT值更靠后；而当氯化钠用量进一步提高到40mM时，会影响灵敏度，0.1％标准品相对靠后(结果未列出)。

实验结果说明，适量PCR抑制剂的添加不影响体系灵敏度，更有利于压制野生型非特异模板的扩增，降低非特异信号，显著提高体系特异性。

显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域及相关领域的普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应属于本发明保护的范围。