利用HEK293细胞制备新型冠状病毒核衣壳蛋白的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种利用HEK293细胞制备新型冠状病毒核衣壳蛋白的方法。

背景技术

新型冠状病毒(即SARS-CoV-2，或称为COVID-19)是2020年在全球大规模爆发的冠状病毒新毒株，与SARS冠状病毒同为β属冠状病毒。人感染了新型冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡，对人类健康造成严重威胁。

新型冠状病毒核衣壳蛋白（N蛋白）是新冠病毒衣壳内最重要的结构蛋白之一，在病毒的结构蛋白中所占比例最大。COVID-19-N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用。N蛋白在新冠病毒中相对保守，感染早期机体就能产生抗N蛋白的高水平抗体，因此，N蛋白具有建立快速检测新型冠状病毒血清抗体方法的潜力，也可以进一步开展单抗制备等研究，市面上的冠状病毒N蛋白多采用大肠杆菌原核表达系统进行表达。原核表达的优点在于能够短时间内获得基因表达产物，成本相对较低，方法也比较简单。但由于大肠杆菌原核表达系统与真核表达系统相比，存在蛋白折叠错误及翻译后修饰等诸多缺陷，使用大肠杆菌表达制备的N蛋白存在与新冠病毒感染人体后人体细胞所表达的N蛋白结构及修饰不同的风险，进而降低了免疫诊断和抗体制备的准确性。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用HEK293细胞制备新型冠状病毒核衣壳蛋白的方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种利用HEK293细胞制备新型冠状病毒核衣壳蛋白的方法，包括以下步骤：

1）构建新型冠状病毒核衣壳蛋白重组表达载体；

2）用步骤1）中构建的重组表达载体转染HEK293细胞；

3）体外培养细胞，采用一步亲和层析法从培养上清中分离纯化重组表达的新型冠状病毒核衣壳蛋白。

前述的方法，步骤1）中新型冠状病毒核衣壳蛋白重组表达载体的构建方法包括：在新型冠状病毒核衣壳蛋白的N端引入如SEQ ID NO:2所示的前导肽，并在新型冠状病毒核衣壳蛋白的C端引入用于蛋白纯化的标签（如6×His标签），人工合成上述重组蛋白对应的核酸构建体，并将其构建到真核表达载体上。

进一步地，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

进一步地，所述核酸构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

所述真核表达载体采用的启动子可以是EF-1α（human elongation factor-1α）启动子、hCMV（human cytomegalovirus）启动子或SV40（Simian vacuolating virus40）晚期启动子等。

其中，所述启动子与所述核酸构建体可操作地连接。

所述真核表达载体为pcDNA3.1(+)。

前述的方法，步骤2）包括：将HEK293细胞培养至细胞密度为1.8-2.2×10

优选地，1×10

前述的方法，步骤3）中HEK293细胞的培养条件为：37℃，5%CO

所用细胞培养基可以是CD 293 TGE培养基。

前述的方法，步骤3）中采用His-tag亲和层析柱对重组蛋白进行分离纯化，包括：1000g离心30 min收集细胞培养上清，将上清过滤后加至预先用PBS缓冲液平衡的GEHisTrap excel层析柱，然后依次用含有0、30、100、250和500 mM咪唑的PBS缓冲液进行梯度洗脱，每个浓度洗脱体积为10 CV，收集蛋白洗脱液。并进行SDS-PAGE分析。根据SDS-PAGE结果，100、250、500 mM咪唑条件下洗脱得到的N蛋白纯度均高达95%以上，将该部分蛋白混合后进行透析，所用透析袋的截留分子量为30KDa。于4℃冰箱中透析过夜，所用透析液为：PBS缓冲液（pH7.4）。并对透析后的样品进行SDS-PAGE检测。

第二方面，本发明提供按照上述方法制备的新型冠状病毒核衣壳蛋白的以下任一应用：

（1）用于制备新型冠状病毒疫苗；

（2）用于制备新型冠状病毒抗体检测试剂。

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

（一）本发明利用HEK293表达系统可在短时间内获得大量新冠病毒核衣壳蛋白，纯度高达98%以上，表达量高达300mg/L。

（二）与使用大肠杆菌表达系统制备的核衣壳蛋白相比，采用HEK293表达系统制备的新冠核衣壳蛋白在与抗体的结合活性以及新冠抗体的胶体金检测方面均表现出极大优势，且HEK293表达系统制备的新冠核衣壳蛋白其蛋白空间构象接近于病毒N基因在宿主体内的蛋白表达构象，其更接近于新冠病毒感染人体后人体细胞所表达的核衣壳蛋白的结构及修饰，具有更高的免疫诊断和抗体制备的准确性，将其用于制作诊断试剂和疫苗前景广阔。

（三）整套核衣壳蛋白表达和纯化工艺操作简单，方法可重复性高，可投入大量生产过程。

附图说明

图1为表达载体pcDNA3.1图谱。

图2为本发明较佳实施例中重组质粒构建示意图。

图3为本发明较佳实施例中新冠病毒N蛋白纯化SDS-PAGE图。其中，泳道1：细胞培养上清；泳道2：流穿液；泳道3：0mM咪唑；泳道4：30mM咪唑；泳道5：100mM咪唑；泳道6：2500mM咪唑；泳道7：500mM咪唑；泳道8：蛋白Marker。

图4为本发明较佳实施例中透析后新冠病毒N蛋白的SDS-PAGE图。

图5为本发明较佳实施例中利用ELISA法检测大肠杆菌表达的N蛋白和HEK293细胞表达的N蛋白分别与抗体结合的活性。

图6为本发明较佳实施例中利用大肠杆菌表达的N蛋白胶体金试纸条（A）和HEK293细胞表达的N蛋白胶体金试纸条（B）检测新冠病毒抗体样品的结果。图中阴性对照代表健康人阴性血清、样本1~5代表5例新冠确诊患者的阳性血清。

具体实施方式

本发明提供一种利用HEK293细胞高效表达新型冠状病毒核衣壳蛋白的方法，所述HEK293细胞为人胚肾293细胞(human embryonic kidney293,HEK293）；所述新型冠状病毒核衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

具体技术方案如下：

1、构建新冠病毒N蛋白重组表达质粒；

2、N蛋白重组表达质粒转染HEK293细胞；

3、N蛋白在HEK293细胞中的重组表达；

4、从培养上清中收获重组表达的N蛋白。

本发明中，在新冠病毒N蛋白的N端引入一段前导肽，帮助重组表达的N蛋白成功分泌至培养上清中，所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明中，在新冠病毒N蛋白的C端均引入一段poly His标签用于蛋白的分离纯化，氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。

上述包含前导序列、新冠病毒N蛋白和poly His标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

编码上述氨基酸序列的基因均可通过常规的合成方法进行制备。

本发明包含前导肽的编码基因构建至哺乳动物细胞表达载体，用于引导N蛋白的分泌表达。

所述表达载体的启动子可以是EF-1α（human elongation factor-1α）启动子、hCMV（human cytomegalovirus）启动子、SV40（Simian vacuolating virus40）晚期启动子等。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW,Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 重组表达载体的构建

重组pHEK-N1表达载体的构建：由上海生物工程有限公司合成编码氨基酸序列如SEQID NO:4所示的多核苷酸（SEQ ID NO:5），并在5’末端添加限制性内切酶BamH Ⅰ酶切位点、Kozak序列；3’末端添加终止密码子TAA和限制性内切酶Xho Ⅰ酶切位点。合成产物用限制性内切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。将目的片段分别与同样经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司，货号：V790-20)（图1）连接，构建重组真核表达载体，命名为pHEK-N1。重组质粒构建示意图见图2。用pHEK-N1转化大肠杆菌E.coli DH5α，37℃培养16h后挑取单菌落进行质粒提取，将提取后的质粒用限制性内切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，将阳性克隆送上海生物工程有限公司进行测序，选择测序正确的克隆进行质粒的放大提取，提取后的质粒无菌过滤后，-20℃保存备用。

实施例2 重组表达载体转染HEK293细胞并表达新冠病毒核衣壳蛋白

用PEI转染试剂将构建好的重组质粒pHEK-N1转染HEK293细胞，进行新冠病毒N蛋白的重组表达。转染前一天将HEK293细胞按照1×10

根据细胞密度计算转染复合物中各组分的用量:质粒剂量与细胞的数量对应关系为1×10

根据上述计算得到的组分用量配置转染复合物：将50 ug浓度为200 ug/mL的重组质粒加入CD 293 TGE培养基至0.5 mL（A液），150 ug浓度为1 mg/mL的 PEI转染试剂加入CD293 TGE培养基至0.5ml（B液），分别混匀后，将B液缓慢加入至A液中，混匀室温静置10-15min后，将转染混合液缓慢滴加入10 mL HEK293细胞中。37℃，5%CO

实施例3 新冠病毒核衣壳蛋白的分离纯化

使用His-tag亲和层析柱对重组蛋白进行分离纯化，具体为：1000g离心30 min收集上述细胞培养上清，将上清过滤后分别结合预先用PBS缓冲液平衡的GE HisTrap excel层析柱，然后依次用含有0、30、100、250和500 mM咪唑的PBS缓冲液进行梯度洗脱，每个浓度洗脱体积为10 CV，收集蛋白洗脱液，并进行SDS-PAGE分析（图3）。根据SDS-PAGE结果，100、250和500 mM咪唑条件下洗脱的N蛋白纯度均高达95%以上，将该部分蛋白混合后进行透析，所使用的透析袋截留分子量为30KDa，于4℃冰箱中透析过夜，所用透析液为：PBS缓冲液（pH7.4）。并对透析后的样品进行SDS-PAGE检测，SDS-PAGE结果显示纯化后的蛋白条带位于45~66KDa之间，符合蛋白理论分子量大小，且纯度高达98%以上，表达量高达300mg/L（图4）。

实施例4 HEK293细胞表达的N蛋白和大肠杆菌表达的N蛋白与抗体结合活性的比较

本实施例中采用ELISA(酶联免疫吸附测定)方法比较本发明HEK293表达的N蛋白和大肠杆菌表达的N蛋白与抗体的结合活性。

1、包被：用0.1μg/孔（1μg/ml，100μl/孔）的抗新冠病毒N蛋白的抗体（安源生物科技有限公司，货号：NP031901）包被96孔板（Corning，货号：42592），在4℃包被过夜（或16h）。抗体稀释所用包被缓冲液为15 mM Na

2、洗涤：用每孔300μl的洗涤缓冲液（TBS，0.05％Tween-20，pH7.4）洗涤孔4次。注：彻底清除洗涤缓冲液很关键。洗完之后通过抽吸除去残留的溶液，并确保其完全干燥；

3、封闭：在37℃条件下，每孔用300μl封闭缓冲液（TBS，0.05％Tween-20，2％BSA，pH7.4）封闭1.5 h。

4、洗涤：重复步骤2。

5、添加样品：每孔加入100μl 0.195313-200 ng/ml实施例3制备的N蛋白或大肠杆菌表达的N蛋白（ACRObiosystems，货号：NUN-C51H9），37℃孵育1h。样品提前用稀释缓冲液（TBS，0.05% Tween-20，0.5% BSA，pH7.4）进行稀释。

6、洗涤：重复步骤2。

7、添加检测抗体：向每个孔中加入100μl anti-His-tag抗体（HRP）（GeneTex，货号：GTX628914-01），37℃孵育1 h。抗体提前用稀释缓冲液（TBS，0.05% Tween-20，0.5%BSA，pH7.4）以1:20000比例进行稀释；

8、洗涤：重复步骤2。

9、添加底物：向各孔中加入200μl底物溶液，37℃孵育20 min。避光。底物溶液配置：在10 ml底物溶液（50 mM Na

10、终止反应：向各孔中加入1M硫酸50μl。

11、读取OD值：在450 nm处读取OD值，然后OD

检测结果如图5所示，可以看出大肠杆菌表达的N蛋白与抗体结合的EC

实施例5新冠病毒核衣壳蛋白的胶体金检测

本实施例对本发明HEK293细胞表达的N蛋白和大肠杆菌表达的N蛋白进行了新冠抗体胶体金检测灵敏度和阳性检出率的比较。

（一）胶体金试纸条的制备

1、胶体金试纸条的组成：试纸条由样品垫、金标垫、NC膜、吸水垫和PVC板组成，与常规胶体金检测卡组成一致。

2、样品垫预处理：使用PBS缓冲液体系，加入0.5%牛血清白蛋白、0.2% Triton X-100和0.1% PC-300，浸泡样品垫后，过夜烘干备用。

3、金标垫预处理：本实施例采用喷金工艺，对金标垫进行预处理，实验中选择PB缓冲液体系，加入0.5%牛血清白蛋白、0.2% Triton X-100和0.1% PC-300，再加入0.5%大分子骨架蛋白PVA-124，浸泡垫子后，过夜烘干备用。

4、金标垫的制备方法如下（新冠病毒核衣壳蛋白的标金）：向每1000μl胶体金溶液中加入16μl 0.2M K

其中，胶体金溶液的浓度为0.01%，胶体金颗粒粒径大小为40nm。

PB缓冲液中含有0.5% BSA、0.5% PEG20000、2%海藻糖和0.2% Triton X-100。

5、质控线对应小鼠IgG的标金：与新冠病毒核衣壳蛋白的标金条件相似，区别在于加入的0.2M K

6、喷金和烘干：将复溶后的金标溶液，用上海金标生物科技有限公司的喷金仪，设定2μL/cm喷量，将金溶液均匀喷到金标垫上，在真空干燥箱中，于37℃通风烘干4h。

7、划膜包被：NC膜上检测线T线包被检测抗人二抗（长沙博优生物科技有限公司），质控线包被羊抗鼠二抗，用PB溶液将二抗稀释到包被浓度1mg/mL，按1μL/cm速度进行划膜，划好的膜，在真空干燥箱中，于37℃通风烘干4h。

8、组装试纸条，将试纸条按照从上到下为吸水垫、NC膜、金标垫、样品垫的顺序正确对齐粘贴到PVC板上，用斩切机切成3mm宽的试纸条，并嵌合到卡壳中，压好外壳保证密合。

9、大肠杆菌表达的N蛋白制备胶体金试纸条的方法与上述方法相同。

（二）新冠病毒抗体样品的检测

本实施例中检测的样品为新冠患者血清样品，每个试纸条加入10μL待测样品，再加入70μL样品稀释液，反应15min，观察颜色反应，并记录结果，结果如图6所示。大肠杆菌表达的N蛋白胶体金试纸条（A）和本发明HEK293细胞表达的N蛋白胶体金试纸条（B）的对比结果可以发现，无论是检出率还是灵敏度，用本发明HEK293表达的N蛋白制备的胶体金试纸条均优于大肠杆菌表达的N蛋白制备的胶体金试纸条。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京百普赛斯生物科技股份有限公司

<120> 利用HEK293细胞制备新型冠状病毒核衣壳蛋白的方法

<130> KHP211110443.7

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 419

<212> PRT

<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)

<400> 1

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Val Trp

1 5 10 15

Ala

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Ser His His His His His His

1 5

<210> 4

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Val Trp

1 5 10 15

Ala Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile

20 25 30

Thr Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu

35 40 45

Arg Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn

50 55 60

Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp

65 70 75 80

Leu Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser

85 90 95

Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg

100 105 110

Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr

115 120 125

Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys

130 135 140

Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys

145 150 155 160

Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu

165 170 175

Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly

180 185 190

Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg

195 200 205

Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro

210 215 220

Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu

225 230 235 240

Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln

245 250 255

Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser

260 265 270

Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr

275 280 285

Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly

290 295 300

Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln

305 310 315 320

Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg

325 330 335

Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly

340 345 350

Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile

355 360 365

Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu

370 375 380

Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro

385 390 395 400

Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp

405 410 415

Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp

420 425 430

Ser Thr Gln Ala Gly Ser His His His His His His

435 440

<210> 5

<211> 1332

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgagcgccc tgctgatcct ggccctggtg ggcgccgccg tggtgtgggc catgagcgac 60

aatggaccac agaatcagag aaacgctcct cgaatcactt ttgggggtcc cagtgattca 120

accggctcaa accagaatgg ggaaagatca ggcgctagaa gcaagcagcg ccgcccccaa 180

ggactcccca acaataccgc cagttggttc accgctttga ctcagcacgg caaggaagat 240

ttgaaatttc ccagaggcca gggggtaccc atcaatacca attcttctcc tgacgatcaa 300

atcgggtatt atagaagagc cacacggcgc atccgagggg gggacgggaa aatgaaagac 360

ctgtctccac ggtggtattt ctattatttg ggaactggac ccgaggctgg tcttccttac 420

ggtgccaata aagacggcat tatctgggtg gccacagagg gggccttgaa tacaccgaag 480

gaccatatcg gtaccagaaa ccccgctaat aacgcggcca tcgtcctgca actgccccag 540

ggcaccacac tgcctaaggg cttttacgcc gagggctctc ggggcggctc acaggctagc 600

agtaggagta gctcacggtc aagaaacagt tccaggaact caactcccgg gagttcccgg 660

ggcacctcac cagcccggat ggccggaaac gggggcgacg ctgctctcgc gctgctgctc 720

cttgatcggc tcaatcagct ggaatcaaag atgtcaggga aaggacagca gcagcagggc 780

cagactgtca cgaagaaaag tgcagcagaa gcctccaaaa aacctagaca gaaaagaaca 840

gctacaaagg cctataatgt cactcaggcg ttcggacgac gagggcccga gcaaactcag 900

ggaaatttcg gcgaccagga gctcatcaga caaggcaccg actacaagca ttggcctcag 960

attgcccaat tcgctccttc tgcgtccgct tttttcggaa tgtcaagaat cggcatggag 1020

gttactccga gcggaacctg gctgacttac accggggcaa tcaaactgga tgacaaagac 1080

ccaaacttta aggatcaggt catcttgctg aataagcaca tcgatgcata caagaccttc 1140

ccccctacag aacccaagaa agacaaaaaa aagaaggcag atgagacaca agcactgccc 1200

cagagacaga aaaaacaaca aactgtcact ctgctcccag ccgcagatct ggacgacttc 1260

tccaagcagc tccagcagag catgtcttct gctgacagta ctcaggcggg ctcacaccac 1320

caccaccacc ac 1332