低剪切力配制疫苗乳剂的油佐剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种新型疫苗油佐剂及其制备方法和用途。

背景技术

中国是养殖业大国，畜禽数量庞大，2017年出栏的生猪约6.88亿头，肉鸡113.7亿只(1,2)。由于动物传染病在养殖场频发，危害动物的健康，给畜牧业生产造成巨大的经济损失。一些人畜共患传染病可从动物传播给人，危害人类的健康。给畜禽注射疫苗是当前预防动物传染病发生的一项重要措施。为了提高疫苗的免疫效果，常在动物疫苗中加入佐剂。油佐剂是一种常见的兽用疫苗佐剂。经典的灭活疫苗制备过程是，佐剂油相和抗原水相混合，乳化，最后形成疫苗乳剂。

在采用传统的油佐剂制备兽用疫苗时，佐剂油相和抗原水相需要在乳高速剪切力作用下才能形成稳定的乳剂，对乳化设备技术要求高，能耗大。

因此，研制出一种能在低剪切力条件下就能和抗原水相形成稳定疫苗乳剂的新型油佐剂，可以大大简化兽用疫苗的制备过程，降低能耗，并提高疫苗制备过程的安全性。

参考文献

(1)农产品期货网.国家统计局：2017年生猪出栏6.88亿头增0.5％。http://finance.sina.com.cn/money/future/agri/2018-01-23/doc-ifyqtycx2309650.shtml。

(2)新牧网.2017我国白羽肉鸡出栏42亿只，国鸡出栏37亿只。http://www.xinm123.com/html/ex-info/475770.html。

(3)秦玉明,赵耘,李宇,王栋.国外疫苗佐剂的评价.中国兽药杂志，2005,36：34-36。

(4)何海蓉，姜平，梅忠，宋立芹，岳建新.不同来源白油佐剂质量分析及其制备的禽流感疫苗安全生与免疫效力研究.中国家禽，2009，31：15-18。

(5)河牧牧业.养鸡业走出疫病困扰的重要出路.http://www.hemumuye.com。

(6)Stone HD.Efficacy of Experimental Animal and Vegetable Oil-Emulsion Vaccines for Newcastle Disease and Avian Influenza.Avian Diseases，1993,37(2)：399-405。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种低剪切力配制疫苗的油佐剂及其制备方法和用途；本发明能克服传统疫苗油佐剂不能在低剪切力下乳化形成稳定乳剂的不足。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种低剪切力配制疫苗的油佐剂E515-A的制备方法，油佐剂E515-A包括组分A1和组分A2这两部分，所述组分A1：组分A2的体积比为60～70:30～40；

S1、制备组分A1：

在搅拌状态下向在25～45℃白油中加入并溶解司班-80和司班-85，得组分A1；

所述白油、司班-80和司班-85的体积比为85～87:8～10：4～6；

S2、制备组分A2：

将吐温-80和聚乙二醇-200体积比以22～24:75～78(优选23:75～78)混合，得组分A2。

说明：S2在室温(10～30℃)下进行。

本发明还同时提供了上述低剪切力配制疫苗的油佐剂的用途：先将组分A1和组分A2以60～70:30～40的体积比混合，形成油佐剂E515-A，再将油佐剂E515-A和含抗原的水相以体积比1:1混合；所得的混合液于室温下50～200rpm摇床乳化1～5分钟，便得疫苗乳剂。

说明：油佐剂需要现配现用，即，在制备疫苗乳剂时，才将将组分A1和组分A2进行混合。

本发明所述的白油是一种无色无味透明油状液体，经过深度精制后的矿物油，基本组成成份为饱和烃。

本发明的有益效果是：采用本发明的佐剂油E515-A和含抗原的水相可以在低剪切力下完成乳化过程，简化了乳化设备，降低了乳化过程中的能耗低。低剪切力乳化可以使体系的温度稳定，保持抗原的完整性，提高疫苗质量。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是乳剂经过脂溶性染料苏丹丹Ⅲ(A)和水溶性染料署红-Y(B)染色的照片；

图2为含E515-A佐剂的油乳剂疫苗的粒径分布；

图3为疫苗的稳定性比较；

(A)常规白油佐剂低剪切力(100rpm)；(B)常规白油佐剂高剪切力(18000rpm)；(C)E515-A佐剂低剪切力(100rpm)；

图4为NK细胞杀伤活性；

图5为小鼠血清IFN-γ水平；

图6为小鼠血清IgG水平；

图7为小鼠血清IgG亚类水平；

图8为脾淋巴细胞刺激指数。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

10号白油，可购自中国石化集团杭州炼油厂；

司班-80，可购自广州超能实业有限公司；

司班-85，可购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；

吐温-80，可购自国药集团化学试剂有限公司；

聚乙二醇200，可购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。

组分A1于25～45℃进行制备；组分A2于室温(10～30℃)进行制备。

实施例1-1：组分A1制备方案一

取10号白油85mL，司班-80 10mL，司班-85 5mL混匀(在60rpm转速下搅拌2分钟)，即得100mL组分A1。

实施例1-2：组分A1制备方案二

取10号白油86mL，司班-80 9mL，司班-85 5mL混匀，即得100mL组分A1。

实施例1-3：组分A1制备方案三

取10号白油87mL，司班-80 7mL，司班-85 6mL混匀，即得100mL组分A1。

实施例2-1：组分A2制备方案一

将吐温-80 22mL和聚乙二醇200 78mL混匀(在120rpm转速下搅拌1分钟)，即得100mL组分A2。

实施例2-2：组分A2制备方案二

将吐温-80 23mL和聚乙二醇200 77mL混匀，即得100mL组分A2。

实施例2-3：组分A2制备方案三

将吐温-80 24mL和聚乙二醇200 76mL混匀，即得100mL组分A2。

实施例3：用组分A1和组分A2配制疫苗(组合1)

取组分A1(实施例1-2)60mL和组分A2(实施例2-2)40mL充分混合(在120rpm转速下搅拌1分钟)，得E515-A 100mL。再将E515-A和灭活流行性腹泻病毒抗原(PEDV)(10

疫苗乳剂经15分钟3000rpm离心后，未见油水分层现象，说明乳剂稳定。

实施例4：用组分A1和组分A2配制疫苗(组合2)

取组分A1(实施例1-1)60mL和组分A2(实施例2-3)40mL充分混合(在120rpm转速下搅拌1分钟)，得E515-A 100mL。再将E515-A和灭活流行性腹泻病毒抗原(PEDV)(10

疫苗乳剂经15分钟3000rpm离心后，未见油水分层现象，说明乳剂稳定。

实施例5：用组分A1和组分A2配制疫苗(组合3)

取组分A1(实施例1-3)60mL和组分A2(实施例2-1)40mL充分混合(在120rpm转速下搅拌1分钟)，得E515-A 100mL。再将E515-A和灭活流行性腹泻病毒抗原(PEDV)(10

疫苗乳剂经15分钟3000rpm离心后，未见油水分层现象，说明乳剂稳定。

上述实施例中，没有明确限定的均是在室温(10～30℃)下进行。

实验1：含E515-A疫苗的乳剂类型、稳定性、粘滞度和粒径

1.方法

1.1.乳剂类型鉴定：用水溶性染料曙红-Y(上海生工生物工程有限公司产品)和脂溶性染料苏丹Ⅲ(上海生工生物工程有限公司产品)对疫苗乳剂(实例7)进行染色，观察内外相染色情况。

1.2.稳定性检测：吸取10mL疫苗乳剂(实施例3)于离心管中，用离心机(5810R，德国Eppendorf公司产品)，于3 000rpm离心15min，观察其析出与分层情况。

1.3.粘滞度测定：用NDJ-8S型旋转粘度计(上海昌吉地质仪器有限公司产品)测定疫苗乳剂(实施例3)粘滞度。

1.4.粒径测定：用Nano ZS型纳米粒度电位分析仪(英国Malvern仪器有限公司产品)检测疫苗乳剂(实施例3)粒径大小及分布。

2.结果和分析

2.1.乳剂类型：

图1显示，水溶性染料曙红使脂滴外围的水相着色(B)；脂溶性染料苏丹Ⅲ使油相脂滴染色(A)。该疫苗为水包油型乳剂。

2.2.稳定性：疫苗经过15分钟3000rpm离心后，未见油水分层现象，说明乳剂稳定性良好。

2.3.粘滞度：疫苗的粘滞度为18±2mpa·s，说明疫苗的流动性良好(兽药典规定<200mpa·s)。

2.4.粒径分布：图2显示，乳剂粒径分布在106～122nm(92％)和6～8nm(8％)，平均粒径为106.9nm。

实验2：E515-A佐剂疫苗乳剂和常规油佐剂疫苗乳剂稳定性的比较

1.材料和方法

1.1.E515-A佐剂疫苗制备：同实施例3。

1.2.常规白油佐剂低剪切力制备疫苗：油相，配制含6％司班-80(广州超能实业有限公司产品)的10号白油(中国石化集团杭州炼油厂产品)10mL。水相，配制含3％吐温-80(国药集团化学试剂有限公司产品)的灭活流行性腹泻病毒抗原(PEDV)(10

上述％为体积％。

1.3.常规油佐剂高剪切力制备疫苗：油相，配制含6％司班-80(广州超能实业有限公司产品)的10号白油(中国石化集团杭州炼油厂产品)10mL。水相，配制含3％吐温-80(国药集团化学试剂有限公司产品)的灭活流行性腹泻病毒抗原(PEDV)(10

1.3.稳定性检测：将三种疫苗经过15分钟3000rpm离心后，观察油水分层现象。

2.结果

图3显示，经离心后常规白油佐剂用低剪切力方法制备的疫苗(A)有分层现象，高剪切力方法制备的疫苗(B)和E515-A佐剂在低剪切力下制备的疫苗(C)则无分层现象。

实验3：含E515-A佐剂PEDV疫苗诱导的免疫反应(组合1)

1.方法

1.1.动物分组和处理：雄性ICR小鼠，6-8周龄，18-20g，购自上海史莱克实验动物有限责任公司。将60只小鼠随机分成5组，每组12只，腹部皮下分别注射0.2mL：

(1)空白组：0.2mL生理盐水，

(2)无佐剂对照组：PEDV抗原(10

(3)白油组：PEDV抗原(10

(4)E515-A组：按实施例3制得；

(5)铝胶组：PEDV抗原(10

免疫两次，间隔两周。每组随机取6只小鼠于一免后24h采血分离血清用于检测IFN-γ水平，并无菌分离脾脏制备淋巴细胞用于检测NK细胞杀伤活性。每组的另外6只小鼠于二免后的1周和2周采血分离血清，用于检测PEDV特异性IgG抗体及其亚类IgG1和IgG2a水平，并于二免后2周无菌分离脾脏制备淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验。

1.2.NK细胞杀伤活性试验：无菌分离脾脏，于研钵中磨碎后过200目滤网，滤液于1500rpm离心8min，弃上清后，加入红细胞裂解液于冰上处理3min，然后于1 500rpm离心8min，弃上清，用Hank’s溶液洗涤3次，加入配好的细胞培养液(含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素双抗溶液)，调整淋巴细胞浓度至1×10

1.3.脾淋巴细胞增殖试验：脾淋巴细胞的制备同上节，调整细胞浓度为5×10

1.4.血清IgG抗体及其亚类检测：采用间接ELISA方法检测，在预包被PEDV抗原的96孔板中，加入100μL 1:1 600稀释的待测血清，于37℃孵育60min，洗板后加入100μL HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1:40 000稀释)、IgG1(1:1 500稀释)或IgG2a(1:1 500稀释)抗体，于37℃孵育30min，洗板后加入100μL TMB显色液，显色时间为10min，然后加入50μL终止液后检测OD

1.5.血清细胞因子测定：采用武汉博士德生物工程有限公司生产的fELISA试剂盒检测小鼠血清IFN-γ水平，具体操作按说明书进行。

1.6.数据统计：试验结果表示为平均值±标准方差(Mean±SE)，采用SPSS 24.0统计软件中One-way ANOVA post-hoc多重比较的Duncan法进行检验，P<0.05为差异显著。

2.结果和分析

2.1.E515-A提高了NK细胞的杀伤活性，见图4。

疫苗中添加佐剂组的NK细胞杀伤活性显著高于无佐剂对照组(P<0.05)。按照NK细胞杀伤活性大小，各组的排列次序依次为：E515-A组＞白油组>铝胶组＞无佐剂对照组(PEDV抗原+生理盐水)；后两者相近的原因：在本实验条件下，PEDV抗原需要在佐剂参与下才能发挥作用。

2.2.E515-A提高了血清IFN-γ水平，见图5。

疫苗中添加佐剂组的血清IFN-γ显著高于无佐剂对照组(P<0.05)。按照IFN-γ水平高低，各组的排列次序依次为：E515-A组＞白油组>铝胶组＞无佐剂对照组。

2.3.E515-A提高了血清特异性抗体水平，见图6。

疫苗中添加佐剂组的血清IgG水平显著高于无佐剂对照组(P<0.05)。按照IgG水平高低，各组的排列次序依次为：E515-A组＞白油组>铝胶组＞无佐剂对照组。

2.4.E515-A提高了血清特异性抗体亚类水平，见图7。

疫苗中添加佐剂组的血清IgG亚类水平显著高于无佐剂对照组(P<0.05)。按照IgG亚类水平高低，各组的排列次序依次为：E515-A组＞白油组>铝胶组＞无佐剂对照组。

2.5.E515-A促进了淋巴细胞增殖反应，见图8。

疫苗中添加佐剂组的淋巴细胞刺激指数显著高于无佐剂对照组(P<0.05)。按照刺激指数的高低，各组的排列次序依次为：E515-A组＞白油组>铝胶组＞无佐剂对照组。

说明：抗原+白油(高剪切力)乳化后疫苗有温度升高现象，该组的免疫反应低于抗原+E515-A(低剪切力)组，可能和乳化过程中温度升高，改变的抗原的结构有关。

实验4：含E515-A佐剂PEDV疫苗诱导的免疫反应(组合2和3)

将36只小鼠随机分成6组，每组6只，用免疫两次，间隔两周。于一免后24h采血分离血清用于检测IFN-γ水平，于二免后的1周和2周采血分离血清，用于检测PEDV特异性IgG抗体。其它实验方法按照实验3，但E515-A组的疫苗用实施例4和实施例5获得的疫苗取代，检测项仅仅检测血清IgG和血清IFN-γ水平。结果见表1。

表1、二免后1周的血清IgG和一免后血清IFN-γ水平(n＝6)

由表1可知，E515-A+抗原组的血清IgG和IFN-γ水平大大高于其它各组。

对比例1-1、将“组分A1(实施例1-2)60mL、组分A2(实施例2-2)40mL“改成“组分A180mL、组分A2 20mL”其余等同于实施例3。

对比例1-2、将“组分A1(实施例1-2)60mL、组分A2(实施例2-2)40mL”改成“组分A150mL、组分A2 50mL”其余等同于实施例3。

对比例2-1、将组分A1改成：10号白油80mL，司班-80 10mL，司班-85 10mL，其余等同于实施例3。

对比例2-2、将组分A1改成：90号白油80mL，司班-80 5mL，司班-85 5mL，其余等同于实施例3。

上述4个对比例制成的疫苗乳剂经过15分钟3000rpm离心后，均可见油水分层现象，说明乳剂不稳定，不能用于用苗。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。