克拉夫新鞘氨醇杆菌在制备用于去除石油废水中COD的微生物菌剂中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及克拉夫新鞘氨醇杆菌在制备用于去除石油废水中COD的微生物菌剂中的应用。

背景技术

石油废水指石油开采及炼制过程中产生的废水，随着工业化进程的不断推进，目前石油废水的体量越来越大，石油废水的处理也越来越受到重视。

石油废水的主要组分有饱和烷烃类、不饱和烷烃类、环烷烃类和芳香烃类，以及硫、酚、氨氮、氰等，成分极其复杂，所以处理难度极大。石油废水的违规排放会造成巨大的危害：(1)石油废水分解过程会消耗大量氧气，导致水体中溶解氧浓度降低，造成水生动植物缺氧死亡，导致生态平衡遭到破坏；(2)石油废水污染土壤，会造成土壤污染，导致植物死亡、给生态系统和农牧业造成巨大损失；(3)石油废水中的芳香烃类难以被生物降解，会导致其通过食物链不断积累，最终产生致畸、致癌等严重危害人类生命和健康的后果。目前处理石油废水的难点主要是石油废水排放量大且处理难度大，目前主要的方法是物理法，通过吸附、萃取等方法去除石油废水中的污染物，但这类方法效果较差、成本高昂且只能将污染物转移，不能达到去除的目的，因此，目前仍无较好的方法应用于石油废水处理。因此，筛选出一株具有能够高效降解石油废水中污染物的菌株，对于石油废水的处理具有重要意义。

发明内容

本发明提供了克拉夫新鞘氨醇杆菌在制备用于去除石油废水中COD的微生物菌剂中的应用。所述克拉夫新鞘氨醇杆菌使用的是克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906，该菌具有耐广盐性，并能够耐受和降解石油废水中的COD。

为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：

本发明提供了克拉夫新鞘氨醇杆菌在制备用于去除石油废水中COD的微生物菌剂中的应用。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌为保藏编号为CGMCC No.20365的克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906。

进一步的，在应用时，将所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906直接以1-2‰的接种量直接接种到石油废水中，28-30℃处理3-5d。

进一步的，在应用时，将所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906制备成发酵菌液，然后以石油废水质量的1-2‰的添加量加入到石油废水中，28-30℃处理3-5d。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906发酵菌液的菌含量为2.0×10

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906发酵菌液的发酵条件为罐压0.2～0.3MPa，温度28～30℃，溶氧≥20％，搅拌速度150～180rpm，发酵时间32～36h。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906具有耐广盐性，能够在15-35‰的盐浓度下正常生长。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的最适生长温度为25-30℃，最适生长pH值为7.0-8.0。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906能够耐受石油废水中高浓度的COD。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906对石油废水中COD的降解率高于85％。

进一步的，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906为兼性厌氧菌，其最适生长溶解氧浓度为0.3-2mg/L。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：

本发明使用的是克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906，该菌分离自高盐水体环境，具有耐广盐性，在15-35‰的盐度范围内均能生长良好，且该菌能够耐受及高效降解石油废水中的COD。克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906可以直接接种到石油废水中，还可以将其制备成发酵菌液，单独或与其他载体混合后组合成微生物菌剂加入到石油废水中，使用方便，且生产工艺稳定。含有克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的微生物菌剂在石油废水中仍能存活繁殖，并具有于分解烷烃类物质、降解石油废水的能力，能够有效降解石油废水，能够快速高效地解决石油废水处理问题，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906在改良NB平板上的菌落形态特征。

图2为所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的生长曲线。

图3为所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906在石油废水中的生长曲线。

图4为所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906处理石油废水的COD变化结果。

具体实施方式

结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

下述实施例中所需培养基的配方如下：

1、耐盐生长微生物富集筛选液体培养基：葡萄糖15g，蛋白胨3g，K

2、耐盐生长微生物分离纯化固体培养基：葡萄糖15g，蛋白胨3g，K

3、改良营养肉汤(NB)培养基：牛肉膏10g，蛋白胨5g，酵母粉5g，氯化钠5g，FeSO

4、改良营养肉汤(NB)固体培养基：牛肉膏10g，蛋白胨5g，酵母粉5g，氯化钠5g，FeSO

5、发酵培养基：葡萄糖100g/L、玉米浆干粉20g/L、NaCl 5g/L、(NH

以上培养基在使用前，均需在121℃下灭菌20min，然后室温保存。

实施例1：克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的筛选、分离与鉴定

1、克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的筛选与纯化

取污水厂生化系统各段混合废水10ml，加入200mL的PBS缓冲溶液中，振荡20min，使样品充分混匀，800rpm离心1min，收集样品上清液，备用。取10mL上述样品上清液，分别加入到装有200mL耐盐生长微生物富集筛选液体培养基的锥形瓶中，30℃，180rpm恒温摇床培养3d，富集3次。取培养的菌悬液梯度稀释后取100μL涂布于耐盐生长微生物分离纯化固体培养基上，置于30℃培养箱培养。在48h之后，挑取不同形态单菌落在改良营养肉汤(NB)固体培养基上划线培养，重复分离纯化3次，最后得到单菌落，将该单菌落命名为GBW-HB1906。

如图1所示，所述菌株GBW-HB1906在改良营养肉汤(NB)固体培养基平板上的菌落为圆形，黄色，直径1-2μm，表面光滑较湿润，中间略凸起，不透明，边缘整齐，无晕环。

2、克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的鉴定

以所述的菌株GBW-HB1906的DNA为模板，使用16S rRNA通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，将得到的菌株GBW-HB1906的16S rDNA测序结果与GenBank中的序列进行比对分析，结果显示，菌株GBW-HB1906与Novosphingobium clarifavum的同源性最高，因此确定该菌株GBW-HB1906为克拉夫新鞘氨醇杆菌。

将筛选到的菌株GBW-HB1906进行菌种保藏，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年07月15日；克拉夫新鞘氨醇杆菌Novosphingobium clarifavum的保藏编号为：CGMCC No.20365。

3、克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906生长曲线测定

将斜面培养的克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906接种至改良NB培养基中，在pH7.0-7.5，28℃下恒温摇床培养40h，制得GBW-HB1906菌液，其中每1.0h取样一次，在OD600nm下测定吸光值，绘制生长曲线图。如图2所示，实验结果表明，GBW-HB1906在培养的前12h为生长迟缓期，随后进入对数生长期，待培养至28-30h时进入对数生长末期，菌数达到5.0×10

实施例2：克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906在石油废水中的生长曲线

取某石油化工企业废水100ml，以1‰接种量将克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906接入该石油废水中，于30℃恒温震荡摇床中进行培养，每12h取样进行菌落计数，连续取样3d。菌落计数方法：取1ml待测样品，将其接入含有9ml无菌水的灭菌试管中，依次稀释至合适浓度，取稀释液100μL于NA固体培养基中，使用涂布棒进行涂布，将涂布平板置于30℃恒温培养箱中培养24h后拿出计数。试验结果如图3所示，所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906于石油废水中培养3d后，菌体量能达到2×10

实施例3：克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906处理石油废水的COD变化

取某石油化工企业废水100ml(检测COD为302.7mg/L)，以1‰接种量将克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906接入该石油废水中，于30℃恒温震荡摇床中进行培养，每12h取样测定水样COD值，COD测定方法采用HJ 828-2017水质化学需氧量的测定-重铬酸钾法进行测定。试验结果如图4所示，经所述克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906处理3d后，石油废水的COD降低到87.52％。

在本发明中，还可以将克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906制备成发酵菌液后，发酵菌液可以直接或与其他载体混合用于去除石油废水中的COD，而克拉夫新鞘氨醇杆菌GBW-HB1906发酵菌液(菌含量为2.0×10

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。