一种基于通道表面切割胶原-DNA聚合物的基质金属蛋白酶检测方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，尤其涉及利用纳米通道检测基质金属蛋白酶的构建原理、过程、实验条件及应用。

发明背景

基质金属蛋白酶-2(MMP-2)是参与细胞侵袭和转移的过程并能够降解胞外基质蛋白的一种酶，目前已被发现与许多癌症的病理进程息息相关。因此，对MMP-2的定量检测成为热门研究课题。然而，大部分的MMP-2检测方法依然多依赖于免疫测定，包括酶联免疫法(ELISA)和表面等离子荧光共振免疫传感(SPR)。虽然这些免疫传感表现出极大的灵敏性和特异性，但它们利用抗体作为识别单元依然存在一些缺点，比如，需要生产高质量的抗体，克服困难的位点特异性识别和保留最初的活性等。

近年来，利用噬菌体展示技术筛选的短肽因其简单、易获取、化学性质稳定、成本效益好等优点、Heller等报道了一种具有PLGVR氨基酸序列、可以被MMP-2特异性水解和裂解的特异性肽段，并开发了几种基于肽段的检测MMP-2的方法，包括电化学分析法、生物荧光分析法。在这些技术中，电化学方法具有明显的响应迅速、灵敏度高等优势。例如，已有文献报道基于靶标诱导底物肽裂解的电化学方法来分析MMP-2。然而，这些生物传感器大多属于signal-off的信号产生方式，存在有限的信号输出和“假阳性”问题。此外，目前还没有开发出有效的信号放大策略，导致检测的灵敏度存在局限性。因此，低浓度MMP-2的分析仍然面临着巨大的挑战。

纳米孔或者纳米通道在生物传感和化学分析领域吸引了研究人员广泛的兴趣，由于纳米通道的结构特性可以通过离子电流展现分子几何变化和离子电流的变化，在疾病检测中发挥着越来越重要的作用，例如，江雷课题组设计了一系列基于纳米通道或纳米孔的生物传感器。而在纳米通道中多孔阳极氧化铝薄膜(PAA)作为一种有潜力的纳米通道在生物传感器方面表现出许多优点：可调节的纳米孔直径、良好的纳米通道阵列、易于功能化的表面和商业的可用性。这些材料为高灵敏的疾病检测开辟了一个新的途径。

发明内容

本发明的目的是在PAA膜表面构建用于检测MMP-2的胶原-DNA复合物，为高灵敏的疾病检测开辟一个新的途径。

发明原理：

明胶酶能降解基底膜胶原、纤连蛋白和弹性蛋白等，为肿瘤的侵袭转移扫除障碍。其中，MMP-2在肿瘤细胞介导的细胞外基质降解中起关键作用，其活性和表达的增加与人类多种恶性肿瘤侵袭、转移潜能及预后密切相关，因而成为近年来肿瘤侵袭和转移研究的热点。胶原中供体基团可以与双螺旋DNA中磷酸受体通过氢键形成复合物。受此启发，我们在阳极氧化铝薄膜阻挡层表面设计形成胶原-DNA复合物，从而实现对MMP-2活性的电化学检测。原理如图1所示。首先，在阳极氧化铝薄膜表面修饰一段含有醛基的DNA S1，接着通过杂交修饰其互补链DNA S2。DNA S1与DNA S2可以通过碱基互补配对形成双链DNA。之后将修饰有双链DNA的PAA膜表面滴加胶原样多肽溶液，这样胶原样多肽通过静电及氢键作用与双链DNA结合，在阳极氧化铝薄膜表面形成胶原-DNA复合物。复合物中的胶原多肽可作为MMP-2的底物，即当胶原被MMP-2降解后，阳极氧化铝薄膜表面空间位阻大大减小，使得离子整流电流增大，该响应信号的改变可用于MMP-2的检测表征。当MMP-2存在的时候，胶原多肽被切割，使得通道中离子整流曲线的电流值增加，避免了复杂的信号输出与转化过程，与传统的其他方法相比，极大的增加反应的灵敏性，我们的检测方法更加便捷高效，并且不需要复杂完整的蛋白质底物，利用多肽即可替代。此外通过改变PAA膜表面的修饰层，还可以进一步模拟肿瘤细胞侵袭与转移的过程。此方法对于其他的切割酶的检测也具有潜在的参考应用价值。

需要的试剂：

醛基修饰的DNA S1序列：5′-CHO-CAC GAC GTT GTA AAA CGA CGG CCA GAG CAG-3′，其互补序列DNA S2：5′-CTG CTC TGG CCG TCG TTT TAC AAC-3′，由南京捷瑞有限公司合成。胶原多肽序列为GPQGIFGQIGPQGIFGQIGPQGIFGQIGPQGIFGQ，由南京肽业生物科技有限公司合成。MMP-2购自上海科敏生物技术有限公司。多孔阳极氧化铝薄膜(PAA)购于合肥普元纳米有限公司，TCEP和EDTA购自美国Sigma-Aldrich公司(中国，上海)。其他化学试剂都是分析纯。实验用水均经过Milli Q(＞18MΩcm)纯化系统(Barnstead公司，美国)纯化。

制备方法包括如下过程：

一、PAA表面氨基激活以及DNA S1、DNA S2、多肽的修饰表征：

为去除纳米通道中的杂质，PAA薄膜依次在酒精、水中超声5min，于N

二、基于胶原-DNA复合物的MMP-2检测方法可行性：

为进一步探究实验的可行性，我们选择了MMP-2作为检测对象进行实验。MMP-2的前体酶是没有活性的，需要事先经过激活剂(APMA)37℃过夜激活。激活后的MMP-2稀释到不同浓度备用，将修饰好胶原-DNA固定液的PAA膜放置在H型电解池的中间，在PAA膜的两边用硅胶垫圈与电解池相连接，其中硅胶垫圈的作用是防止液体渗漏，最后用金属夹子将PAA膜隔开的两个电解池固定，在电解池中各加入1mM KCl电解液，在两个电解池中分别插入饱和的甘汞电极，与电化学工作站形成一个完整的电回路。并在PAA阻挡层一侧的电解池加入10×的TCNB缓冲液(10mM CaCl

三、不同浓度DNA S1对MMP-2检测的影响：

为了控制反应条件，我们在对PAA膜表面进行修饰处理时，选择足量的APTES滴加在PAA表面。随后，设置滴加DNA S1链的浓度梯度分别为2.5μM，5μM，10μM，20μM，30μM，30℃条件下进行温育，采用电化学工作站记录PAA膜通道中的离子电流信号变化，结果如图4所示，随着DNA S1链浓度的不断增加，电流信号不断增加。且信号在DNA S1链浓度为20μM时达到一个平台，因此选择将20μM作为DNA S1链修饰在PAA表面的最适浓度。

四、MMP-2反应时间对检测的影响：

在确定DNA S1链最适浓度为20μM的基础上，我们进一步优化基质金属蛋白酶的反应时间，在37℃分别反应0min、10min、20min、40min、60min后用电化学工作站进行离子整流电流监测，如图5所示，在反应为20min时基本进入平台期，考虑到最优的反应速率和反应时间，因此我们在本部分实验中选择20min作为最终的反应时间。

五、基质金属蛋白酶MMP-2含量检测方法验证：

为了进一步表征MMP-2含量，我们选择了了不同浓度的酶切割PAA膜表面胶原底物后的电解池的离子电流曲线，并建立了电化学信号与MMP-2含量之间的对应关系。当加入活化后的MMP-2酶时，由于PAA膜表面阻挡离子流动的胶原复合物被降解从而在纳米通道中产生了一个强烈的离子整流电流信号。如图6所示，我们用不同浓度的MMP-2处理，记录了反应20min时的离子整流曲线，整流电流响应值随着MMP-2浓度的提高而增大，将离子整流电流变化值与酶浓度之间的关系拟合成曲线，得到线性拟合方程为y＝0.6375lg(pg/μL)+4.8113由此可见，随着酶浓度的不断增加，离子整流电流不断增大，最低检测限可达到2.5pg/μL。

肿瘤细胞在胞外会分泌MMP-2，在确定了我们的设计方案具有较好的MMP-2检测效果后，在细胞培养两天后，我们取细胞培养液进行实验，检测结果如图7所示，可以发现细胞培养液的含量与PAA膜通道的离子整流电流值具有很好的线性关系。

六、MMP-2检测体系的特异性实验：

为了进一步探究该体系对MMP-2检测的特异性，我们选取MMP-2、CEA、MMP-7等蛋白进行实验分析。在PAA膜表面组装好胶原-DNA聚合物之后，我们将MMP-2与MMP-7和CEA单独与上述PAA膜进行温育，检测得到的离子整流曲线如图8所示，只有当体系中只存在或者混合体系中存在MMP-2时，离子整流曲线在-1V时的电流绝对值为3.5μA，而miR-192或let-7的离子整流电流绝对值均低于1μA。因此可以证明本方法对MMP-2的检测具有良好的特异性。

八、结论

总而言之，我们基于在PAA膜通道表面组装胶原-DNA聚合物构建了一种灵敏检测MMP-2活性的方法。在该体系中，我们设计的具有重复序列的胶原多肽为MMP-2的切割底物，当MMP-2存在的时候，胶原多肽被切割，使得通道中离子整流曲线的电流绝对值增加，避免了复杂的信号输出与转化过程，与其他的传统方法相比，极大地增加了反应的灵敏性，更加便捷高效，并且不需要复杂完整的蛋白质底物，利用多肽即可替代。此外通过改变PAA膜表面的修饰，还可以进一步模拟肿瘤细胞侵袭与转移的过程。此方法对于其他切割酶的检测也有潜在的参考应用价值。

以上详细描述了本发明的装置原理，实施的方法及检测条件等，但是本发明不限于上述检测的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明进行检测底物的变换，这些检测底物的变换均属于本发明的保护范围内，另外需要说明的是，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

说明书附图

图1：基于阳极氧化铝薄膜表面胶原-DNA复合物的组装检测基质金属蛋白酶2装置。

图2：(A)PAA膜表面修饰表征图。其中黑色曲线代表未经修饰的PAA膜，红色曲线为修饰有APTES的PAA膜。(B)PAA膜表面修饰的表征图。其中，黑色曲线表示裸的PAA膜，红色曲线为修饰有APTES的PAA膜，蓝色曲线为修饰DNA的PAA膜，绿色曲线代表组装成胶原-DNA聚合物后的PAA膜。

图3：采用离子电流验证实验方法的可行性。(Bare PAA)为空白的未经修饰的PAA膜，(PAA-DNA)代表修饰了DNA后的PAA膜，(PAA-DNA-Peptide)为PAA表面组装形成胶原-DNA复合物，(MMP-2)为基质金属蛋白酶处理过的PAA膜。

图4：(A)在PAA膜表面修饰不同浓度DNA链的电流曲线。(B)为在-1V时对应的电流绝对值。DNA S1的浓度梯度分别为2.5μM、5μM、10μM、20μM、30μM。

图5：(A)MMP-2切割PAA膜表面胶原-DNA复合物的电流离子曲线。(B)在-1V时对应的电流绝对值。其中MMP-2反应时间分别为0、10、20、40、60min。

图6：(A)不同浓度MMP-2(pg/μL)处理PAA膜的电流曲线，浓度梯度为0，2.5，5，50，200，2000，10000，20000pg/μL。(B)不同浓度MMP-2处理PAA膜的对应的电流值的校准曲线。插图：校准曲线与miR-21浓度在10到1000fM之间对数的线性关系图(使用对数X轴缩放)。

图7：(A)不同含量细胞培养液处理PAA膜的离子整流曲线，含量梯度为0，10，50，100，200，500，1000，2000μL。(B)离子整流曲线与不同含量细胞培养液的校准曲线。插图：校准曲线与细胞含量在0到2000μL之间对数的线性关系图(使用对数X轴缩放)。

图8：生物传感器的选择性。每个检测体系所使用对象含量都为1000pg/μL。误差棒表示三次实验的标准差。