水稻转录因子WRKY53在MAPK级联信号通路中的应用

技术领域

本发明涉及水稻的遗传育种领域，尤其涉及水稻转录因子WRKY53在MAPK级联信号通路中的应用。

背景技术

水稻叶倾角和粒型是影响作物产量的重要农艺性状，以叶倾角和粒型为指标，筛选水稻高产新株型，合理规划种植密度，实现作物产量的提高不失为一种有效的手段。水稻MAPK级联信号被报道能够参与调控水稻的病原体防御反应、机械损伤防御方应，以及水稻株型的调控等生物过程。此外，在株型调控方面，主要参与调控水稻叶倾角和粒型的发育。MAPKKK10突变体smg2-1表现为叶倾角变小、粒型变小等表型；而组成型激活的MAPKKK10过表达转基因水稻呈现出粒型增大的表型特征。MAPKK4突变体smg1-1表现为叶倾角变小、粒型变小等表型；而组成型激活的MAPKK4过表达转基因水稻表现为叶倾角增大、粒型增大的表型特征。MAPK6突变体dsg1表现为叶倾角直立、粒型变小等表型；而组成型激活的MAPK6过表达转基因水稻表现为粒型增大的表型特征，说明MAPKKK10-MAPKK4-MAPK6能够正向调控水稻叶倾角和粒型的发育。水稻转录因子OsWRKY53在MAPKKK10-MAPKK4-MAPK6级联信号中的作用机制还不清楚。

发明内容

本发明的目的是首次阐明WRKY53在MAPKKK10-MAPKK4-MAPK6信号通路中的作用机制，为水稻株型育种提供重要理论依据，对筛选水稻高产新株型具有重要的参考价值。

本发明提供水稻转录因子WRKY53在MAPK级联信号通路中的应用。

进一步的，所述水稻转录因子WRKY53是MAPK级联信号通路的底物，正向调控水稻叶倾角。

所述水稻转录因子WRKY53是MAPK级联信号的直接靶基因。所述直接靶基因是指MAPK级联信号下游的直接作用底物。

进一步的，所述水稻转录因子WRKY53是MAPK级联信号通路的底物，正向调控水稻粒型。

所述水稻转录因子WRKY53是MAPK级联信号的微弱靶基因。

由于WRKY53在颖壳发育的调控上，主要调控细胞的延伸，微弱调控细胞的扩增，将其定义为微弱靶基因

所述MAPK级联信号为MAPKKK10-MAPKK4-MAPK6级联信号。

本发明的有益效果：

本发明首次阐明WRKY53是MAPKKK10-MAPKK4-MAPK6信号通路的底物，正向调控水稻叶夹角和粒型。

本发明通过基因敲除和杂交的方式获得CAMAPK6 wrky53和MKP1RNAi wrky53双突变体，表型观察发现双突变体能将CAMAPK6和MKP1RNAi粒型增大的表型进行完全恢复，并在一定程度上使得叶倾角显著变小。说明在叶倾角和粒型的调控上，WRKY53作用于MAPK6和MKP1的遗传学下游。

本发明通过遗传转化手段，将WRKY53基因在smg2-1和dsg1中过量表达，获得smg2-1 WRKY53OE和dsg1 WRKY53OE双突变体，双突变体较单突变体相比，能够将单突变体叶倾角变小、粒型变小的表型进行完全恢复，表现出叶倾角增大、粒型增大的表型。说明在叶倾角和粒型的调控上，WRKY53作用于MAPKKK10和MAPK6的遗传学下游。

本发明通过扫描电镜技术，观察了dsg1 WRKY53OE，smg2-1WRKY53OE，CAMAPK6wrky53和MKP1RNAi wrky53双突变体及其对照的颖壳，发现MAPK6主要参与调控颖壳细胞的数目，微弱调控细胞的大小；而WRKY53主要调控细胞的大小，微弱调控细胞的数目。

细胞学和遗传学相结合所得出的结论是，在水稻叶倾角的调控上，WRKY53是MAPKKK10-MAPKK4-MAPK6级联信号的直接靶基因；在粒型的调控上，WRKY53是MAPKKK10-MAPKK4-MAPK6级联信号的微效靶基因。

本发明首次揭示了WRKY53是MAPKKK10-MAPKK4-MAPK6级联信号的直接底物，正向调控水稻叶倾角和粒型，为水稻株型育种提供重要线索和理论基础，对改造水稻株型，进而提高作物产量提供重要理论依据，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为dsg1 WRKY53OE双突变体及其对照总体形态图

图2为dsg1 WRKY53OE双突变体鉴定结果

图3为dsg1 WRKY53OE双突变体叶倾角形态图

图4为dsg1 WRKY53OE双突变体叶倾角大小统计结果

图5为dsg1 WRKY53OE双突变体及其对照粒型形态图

图6为dsg1 WRKY53OE双突变体及其对照粒长统计结果

图7为dsg1 WRKY53OE双突变体及其对照粒宽统计结果

图8为dsg1 WRKY53OE双突变体外稃纵向细胞长度和细胞数目统计结果

图9为CAMAPK6 wrky53双突变体及其对照总体形态图

图10为CAMAPK6 wrky53双突变体鉴定结果

图11为CAMAPK6 wrky53双突变体叶倾角形态图

图12为CAMAPK6 wrky53双突变体叶倾角大小统计结果

图13为CAMAPK6 wrky53双突变体及其对照粒型形态图

图14为CAMAPK6 wrky53双突变体及其对照粒长统计结果

图15为CAMAPK6 wrky53双突变体及其对照粒宽统计结果

图16为CAMAPK6 wrky53双突变体外稃纵向细胞长度和细胞数目统计结果

图17为MKP1RNAi wrky53双突变体及其对照总体形态图

图18为MKP1RNAi wrky53双突变体鉴定结果

图19为MKP1RNAi wrky53双突变体叶倾角形态图

图20为MKP1RNAi wrky53双突变体叶倾角大小统计结果

图21为MKP1RNAi wrky53双突变体及其对照粒型形态图

图22为MKP1RNAi wrky53双突变体及其对照粒长统计结果

图23为MKP1RNAi wrky53双突变体及其对照粒宽统计结果

图24为smg2-1WRKY53OE双突变体及其对照总体形态图

图25为smg2-1WRKY53OE双突变体鉴定结果

图26为smg2-1WRKY53OE双突变体叶倾角形态图

图27为smg2-1WRKY53OE双突变体叶倾角大小统计结果

图28为smg2-1WRKY53OE双突变体及其对照粒型形态图

图29为smg2-1WRKY53OE双突变体及其对照粒长统计结果

图30为smg2-1WRKY53OE双突变体及其对照粒宽统计结果

图31为smg2-1WRKY53OE双突变体外稃纵向细胞长度和细胞数目统计结果

具体实施方式

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

一、dsg1 WRKY53OE双突变体的获得

1、载体构建：以日本晴cDNA为模板，参照TaKaRa公司的

正向引物F1：5'-GTTACTTCTGCACTAGGTACCATGGCGTCCTCGACGGGG-3'

反向引物R1：5'-TCTTAGAATTCCCGGGGATCCCTAGCAGAGGAGCGACTCGACG-3'

2、以MAPK6突变体dsg1为实验材料，采用农杆菌介导的遗传转化方法获得dsg1WRKY53OE双突变体，转化方法如下：

(1)PC1390U-WRKY53转化农杆菌感受态EHA105：将EHA105感受态从-80℃冰箱取出，置于冰上融化；将500ng～1μg的目的质粒加入100ul EHA105感受态中，冰上放置30min；迅速置于液氮5min；从液氮中取出，迅速置于37℃水预锅中水浴5min；冰上2min；加入800μl液体LB培养基，置于全温震荡器(购自MKN公司)中，28℃，120rpm孵育4～5h；离心，弃大部分上清，将剩余菌液涂抹于含有卡那霉素(50μg/ml)(购自Amresco)和利福平(50μg/ml)(购自Amresco)的LB固体培养基上，28℃培养3天左右。

(2)菌落PCR鉴定：通过PCR的方式鉴定出阳性克隆；挑取阳性克隆至加有相应抗生素和利福平的液体LB培养基中，28℃，180rpm培养16h左右。

(3)侵染水稻愈伤组织：步骤2的菌液培养至肉眼看上去像橙汁一样的颜色(OD＝1.0左右)，方可用来进行转化。取500μl左右菌液至1.5ml离心管中，5000rpm，28℃，离心3min，弃上清，可以看到管底有白色的菌团；用300μl含有终浓度为20ug/ml的乙酰丁香酮(购自Aldrich)的液体共培培养基轻轻吹打管底菌团，使其均匀的悬浮在液体培养基中；挑选生长状态良好的愈伤组织至50ml离心管中，大约至离心管刻度5ml左右；加入20ml含有20μg/ml的乙酰丁香酮的液体共培培养基，然后将上述悬浮好的300ul菌液全部加入到50ml离心管中；持续轻柔混匀2～3min，以进行侵染。将液体共培培养基倒掉，然后将侵染好的愈伤组织转移至铺有滤纸的培养皿中，吸附多余的培养基，这一过程大约需要1min左右；在固体共培培养基上铺一层滤纸，使滤纸浸透，然后将上述侵染好的愈伤组织转移至此固体培养基上；28℃暗培养2～3天。

(4)恢复培养：被侵染的愈伤暗培养2～3天后，将愈伤颗粒转移至50ml离心管中；用含有终浓度为400μg/ml羧卞青霉素(购自Amresco)的无菌水清洗愈伤组织4～5遍，每次持续1min左右，进行除菌；随后，再用无菌水清洗愈伤组织2～3遍，转移至铺有滤纸的培养皿上，吸干多余水分；将上述愈伤组织转移至含有400μg/ml羧卞青霉素的恢复培养基上，28℃人工气候培养箱(24h光培养)恢复培养4～5天。

(5)筛选培养：恢复培养4～5天后，将恢复培养基上的愈伤组织转移至含有400μg/ml羧卞青霉素和50μg/ml潮霉素(购自Roche)的筛选培养基上；将其转移至28℃人工气候培养箱(24h光培养)中培养30天左右。

(6)分化培养：将筛选培养基上的抗性愈伤转移至分化培养基上，每瓶移至一簇愈伤；将其置于28℃人工气候培养箱(24h光培养)中培养30天左右，即可分化出转基因苗。

3、dsg1 WRKY53OE双突变体的鉴定

以F2和R2为引物，通过qRT-PCR的方式对dsg1 WRKY53OE双突变体进行鉴定。

正向引物F2：5'-GAGCGACATCGACATCCT-3'

反向引物R2：5'-TTGTGCTTGCCCTCGTAG-3'

如图1，2所示，是dsg1 WRKY53OE及其对照的总体形态图及其鉴定结果。从图中可以看到，dsg1叶倾角直立、粒型变小；而dsg1 WRKY53OE双突变体叶倾角变大、粒型变大。

二、dsg1 WRKY53OE双突变体叶倾角和粒型的统计分析

挑选生长状态一致，处于抽穗期的水稻的剑叶为实验材料，利用ImageJ进行叶倾角的测量，每种材料统计50棵，最终利用单因素方差分析进行两两比较。在粒型的测量上，挑选成熟饱满的水稻种子，进行拍照，随后利用ImageJ进行粒长、粒宽的测量，每种材料统计50粒，最终利用单因素方差分析进行两两比较。

三、细胞学分析dsg1 WRKY53OE双突变体及其对照颖壳发育机制。

1、挑选成熟饱满的dsg1 WRKY53OE双突变体及其对照的种子，用导电胶固定在扫描电镜的实验台上，采用喷金设备喷金1min。

2、处理好的样品置于扫描电镜下进行扫描观察。

3、选取水稻外稃中心部位，用ImageJ统计纵向细胞数目，再用相应细胞数目下的总长度除以细胞数目，得到平均纵向细胞长度。

如图3，4所示，是dsg1 WRKY53OE及其对照的叶倾角照片和统计结果，统计结果显示WRKY53能将dsg1叶倾角变小的表型进行完全恢复，说明在叶倾角的调控上，WRKY53位于MAPK6的遗传学下游。图5，6，7是dsg1 WRKY53OE及其对照的粒型照片和粒长、粒宽统计结果。从图中可以看到，dsg1 WRKY53OE双突变体较dsg1单突变体相比，粒长和粒宽显著变长，说明WRKY53能将dsg1粒型变小的表型进行完全恢复；图8是dsg1 WRKY53OE及其对照外稃的扫描电镜结果，统计结果显示dsg1突变体细胞数目显著变少，而在dsg1中过表达WRKY53基因后，细胞长度显著变长，细胞数目较细胞长度相比贡献率相对较低。说明在粒型的调控上，WRKY53主要调控细胞的延伸，微量调控细胞的扩增；而根据之前的报道，MAPK6主要参与调控细胞的扩增，我们得出的结论是，在粒型的调控上，WRKY53是MAPK6的微调靶基因。

四、CAMAPK6 wrky53双突变体的获得

1、将WRKY53基因的CDS序列输入CRISPR Primer Designer软件，设计2对靶位点引物(F3和R3；F4和R4)，构建敲除载体CRISPR/Cas9-WRKY53。

正向引物F3：5'-GGCATTCCAGTCGTACCTCTGAGC-3'

反向引物R3：5'-AAACGCTCAGAGGTACGACTGGAA-3'

正向引物F4：5'-GCCGAGCTGGAGGACGGGTACAAC-3'

反向引物R4：5'-AAACGTTGTACCCGTCCTCCAGCT-3'

2、以CAMAPK6转基因水稻为实验材料，采用农杆菌介导的遗传转化手段获得CAMAPK6 wrky53双突变体。(农杆菌介导的遗传转化方法同上)

3、设计MAPK6基因鉴定引物(F5和R5)，对双突变体进行qRT-PCR鉴定；设计涵盖靶点序列的一对测序引物(F6和R6)，对WRKY53基因靶点序列进行扩增，并对PCR产物进行测序；直到获得纯合的CAMAPK6 wrky53双突变体。

正向引物F5：5'-CTTTATCAGATTCTCCGTGGCTT-3'

反向引物R5：5'-TCATAAAATCGGTTTCTGAGGTG-3'

正向引物F6：5'-CGGGGTGCCCAAGTTCAAGTC-3'

反向引物R6：5'-ATGGAGCAGCCGTTGTAGGTG-3'

如图9，10所示，是CAMAPK6 wrky53及其对照的总体形态图及其鉴定结果。从图中可以看到，CAMAPK6 wrky53双突变体与wrky53单突变体相似，叶倾角变小、粒型变小。如图11，12所示，是CAMAPK6 wrky53及其对照的叶倾角照片和统计结果，结果显示在CAMAPK6中敲除WRKY53基因后，使得CAMAPK6叶倾角显著变小，再次说明在叶倾角的调控上，WRKY53位于MAPK6的遗传学下游。图13，14，15是CAMAPK6 wrky53及其对照的粒型照片和粒长、粒宽统计结果。结果显示CAMAPK6 wrky53双突变体较CAMAPK6单突变体相比，粒长和粒宽显著变小，说明wrky53能将CAMAPK6粒型变大的表型进行完全恢复；图16是CAMAPK6 wrky53及其对照外稃的扫描电镜结果，结果显示CAMAPK6细胞长度显著变长；而wrky53突变体细胞长度显著变短，同时还有较低程度的数目变少，再次表明WRKY53主要参与调控细胞延伸，微弱调控细胞分裂；而结合dsg1和CAMAPK6的细胞学统计结果，说明MAPK6主要调控细胞分裂，微弱调控细胞延伸。再次说明在粒型的调控上，WRKY53是MAPK6的微效靶基因。

五、MKP1RNAi wrky53双突变体的获得

1、以MKP1RNAi和wrky53为实验材料，进行杂交，获得杂交粒。

2、将杂交粒催芽、种植、鉴定，获得F1代种子。

3、对获得的F1代种子催芽种植，分离鉴定出WT，MKP1RNAi，wrky53和MKP1RNAiwrky53。wrky53鉴定引物同上，MKP1鉴定引物为(F7和R7)。并对分离后代进行表型观察。

正向引物F7：5'-ACCGTAGGGTGGAATCTTATG-3'

反向引物R7：5'-AACTTGCGCCTTAGTGAACTC-3'

如图17，18所示，是MKP1RNAi wrky53及其对照的总体形态图及其鉴定结果。从图中可以看到，MKP1RNAi wrky53双突变体与wrky53单突变体相似，叶倾角变小、粒型变小。如图19，20所示，是MKP1RNAi wrky53及其对照的叶倾角照片和统计结果，统计结果显示在MKP1RNAi中敲除WRKY53基因后，使得MKP1RNAi叶倾角显著变小，由于MKP1是抑制MAPK6的磷酸酶，再次表明在叶倾角的调控上，WRKY53位于MAPK6的遗传学下游。图21，22，23是MKP1RNAi wrky53及其对照的粒型照片和粒长、粒宽统计结果。从图中可以看到，MKP1RNAiwrky53双突变体较MKP1RNAi单突变体相比，粒长和粒宽显著变小，说明wrky53能将MKP1RNAi粒型变大的表型进行完全恢复；进一步证实WRKY53是MAPK级联信号的微效靶基因。

六、smg2-1 WRKY53OE双突变体的获得

1、以smg2-1(MAPKKK10突变体)为实验材料，采用农杆菌介导的遗传转化手段获得smg2-1 WRKY53OE双突变体。(农杆菌介导的遗传转化方法及载体构建同上)

2、通qRT-PCR的方式对双突变体进行鉴定。

如图24，25所示，是smg2-1 WRKY53OE及其对照的总体形态图及其鉴定结果。从图中可以看到，smg2-1叶倾角直立、粒型变小；而smg2-1 WRKY53OE双突变体叶倾角变大、粒型变大。如图26，27所示，是dsg1 WRKY53OE及其对照的叶倾角照片和统计结果，统计结果显示WRKY53能将smg2-1叶倾角变小的表型进行完全恢复，说明在叶倾角的调控上，WRKY53位于MAPK级联信号的遗传学下游。图28，29，30是smg2-1 WRKY53OE及其对照的粒型照片和粒长、粒宽统计结果。从图中可以看到，smg2-1 WRKY53OE双突变体较smg2-1单突变体相比，粒长和粒宽显著变长，说明WRKY53能将smg2-1粒型变小的表型进行完全恢复。图31是smg2-1WRKY53OE及其对照外稃的扫描电镜结果，统计结果显示smg2-1突变体细胞数目显著变少，而在smg2-1中过表达WRKY53后，细胞长度显著变长，细胞数目较细胞长度相比贡献率相对较低。再次说明在粒型的调控上，WRKY53是MAPK级联信号下游的微效靶基因。

序 列 表

<110> 中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>水稻转录因子WRKY53在MAPK级联信号通路中的应用

<160> 14

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F1

<400> 1

gttacttctgcactaggtaccatggcgtcctcgacgggg 39

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R1

<400> 2

tcttagaattcccggggatccctagcagaggagcgactcgacg 43

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F2

<400> 3

gagcgacatcgacatcct 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R2

<400> 4

ttgtgcttgccctcgtag 18

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F3

<400> 5

ggcattccagtcgtacctctgagc 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R3

<400> 6

aaacgctcagaggtacgactggaa 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F4

<400> 7

gccgagctggaggacgggtacaac 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R4

<400> 8

aaacgttgtacccgtcctccagct 24

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F5

<400> 9

ctttatcagattctccgtggctt 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R5

<400> 10

tcataaaatcggtttctgaggtg 23

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F6

<400> 11

cggggtgcccaagttcaagtc 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R6

<400> 12

atggagcagccgttgtaggtg 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F7

<400> 13

accgtagggtggaatcttatg 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R7

<400> 14

aacttgcgccttagtgaactc 21