一种快速检测待测菌株生产E4P能力的方法及其使用的生物传感器
文献发布时间:2023-06-19 11:16:08
技术领域
本发明属于分子检测领域,具体涉及一种快速检测待测菌株生产E4P能力的方法及其使用的生物传感器。
背景技术
微生物合成途径利用廉价的可再生资源可生产众多有价值的代谢产物,如药品、饲料、食品添加剂等。识别代谢途径潜在的限速步骤对调控目标产物的代谢流具有非常重要的指导意义,特别是检测代谢途径中的关键酶或者中间代谢物对代谢途径改造及评价至关重要。赤藓糖-4-磷酸(Erythrose 4-phosphate,E4P)是丁糖赤藓糖的磷酸化衍生物,是卡尔文循环和磷酸戊糖途径的中间产物。此外,E4P也是生物合成芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)和磷酸吡哆醛(PLP)等众多化合物的重要合成前体。截止目前,E4P可通过代谢组学和气相-质谱联用进行定量,但耗时较长。因此,建立一种快速检测E4P的方法对众多有价值的代谢产物的生产具有重要意义。
生物传感器具有稳定性好、易于操作等优点,并且在筛选时具有高通量鉴别小分子的优势,为昂贵的体外筛选提供了廉价的替代品。另外,计算机改造及优化蛋白技术的不断成熟也为生物传感器的开发提供了重要的技术支持。
发明内容
本发明的目的是快速检测E4P。
本发明首先保护蛋白质,为C1)或C2)或C3)或C4):
C1)氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的蛋白质;
C2)将C1)所示的蛋白质氨基酸序列中第7位的G进行置换,得到的蛋白质;
C3)将C1)所示的蛋白质氨基酸序列中第19位、第105位、第106位、第138位、第207位、第86位、第83位、第124位、第154位、第125位、第191位、第29位、第33位、第43位和第31位这15位中至少一位的氨基酸残基进行置换,得到的蛋白质;
C4)在C1)或C2)或C3)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
所述蛋白质可满足(X1)和/或(X2):
(X1)可与E4P结合;
(X2)“蛋白质与E4P”的亲和力高于“氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的T0蛋白”与E4P”的亲和力。
所述(X1)中,蛋白质可与E4P结合具体可为蛋白质可与E4P特异结合。
所述C2)中,第7位的G置换为L、M、Q、A、R、N、D、C、E、H、I、K、F、P、S、T、W、Y或V。
所述C3)中,第19位的L置换为P。所述第105位的I置换为Y。所述第106位的N置换为A或C。所述第138位的I置换为D。所述第207位的V置换为A。所述第86位的D置换为Y。所述第83位的K置换为R。所述第124位的T置换为M。所述第154位的D置换为S。所述第125位的K置换为E。所述第191位的Y置换为C。所述第29位的A置换为V。所述第33位的E置换为K。所述第43位的M置换为V。所述第31位的D置换为V。
上述任一所述蛋白质可为蛋白质a1至蛋白质a41中的任一种。
所述蛋白质a1可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a2可为SEQ ID NO:6中第106位的N置换为C、第138位的I置换为D且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a3可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第207位的V置换为A且第106位的N置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a4可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第207位的V置换为A且第106位的N置换为C,得到的蛋白质。
所述蛋白质a5可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P且第105位的I置换为Y,得到的蛋白质。
所述蛋白质a6可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P且第106位的N置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a7可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P且第106位的N置换为C,得到的蛋白质。
所述蛋白质a8可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P且第138位的I置换为D,得到的蛋白质。
所述蛋白质a9可为SEQ ID NO:6中第138位的I置换为D且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a10可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第105位的I置换为Y且第106位的N置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a11可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第105位的I置换为Y且第106位的N置换为C,得到的蛋白质。
所述蛋白质a12可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第105位的I置换为Y且第138位的I置换为D,得到的蛋白质。
所述蛋白质a13可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第105位的I置换为Y且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a14可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第105位的I置换为Y、第106位的N置换为A且第138位的I置换为D,得到的蛋白质。
所述蛋白质a15可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第105位的I置换为Y、第106位的N置换为A且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a16可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第105位的I置换为Y、第106位的N置换为C且第138位的I置换为D,得到的蛋白质。
所述蛋白质a17可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第105位的I置换为Y、第106位的N置换为C且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a18可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第105位的I置换为Y、第106位的N置换为A、第138位的I置换为D且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a19可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第105位的I置换为Y、第106位的N置换为C、第138位的I置换为D且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a20可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第106位的N置换为A且第138位的I置换为D,得到的蛋白质。
所述蛋白质a21可为SEQ ID NO:6中第124位的T置换为M、第154位的D置换为S且第125位的K置换为E,得到的蛋白质。
所述蛋白质a22可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第106位的N置换为C且第138位的I置换为D,得到的蛋白质。
所述蛋白质a23可为SEQ ID NO:6中第29位的A置换为V、第33位的E置换为K且第43位的M置换为V,得到的蛋白质。
所述蛋白质a24可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第106位的N置换为A、第138位的I置换为D且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a25可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第106位的N置换为C、第138位的I置换为D且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a26可为SEQ ID NO:6中第19位的L置换为P、第138位的I置换为D且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a27可为SEQ ID NO:6中第105位的I置换为Y且第106位的N置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a28可为SEQ ID NO:6中第105位的I置换为Y且第106位的N置换为C,得到的蛋白质。
所述蛋白质a29可为SEQ ID NO:6中第105位的I置换为Y且第138位的I置换为D,得到的蛋白质。
所述蛋白质a30可为SEQ ID NO:6中第105位的I置换为Y且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a31可为SEQ ID NO:6中第105位的I置换为Y、第106位的N置换为A且第138位的I置换为D,得到的蛋白质。
所述蛋白质a32可为SEQ ID NO:6中第105位的I置换为Y、第106位的N置换为A且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a33可为SEQ ID NO:6中第105位的I置换为Y、第106位的N置换为C且第138位的I置换为D,得到的蛋白质。
所述蛋白质a34可为SEQ ID NO:6中第105位的I置换为Y、第106位的N置换为C且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a35可为SEQ ID NO:6中第105位的I置换为Y、第106位的N置换为A、第138位的I置换为D且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a36可为SEQ ID NO:6中第105位的I置换为Y、第106位的N置换为C、第138位的I置换为D且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a37可为SEQ ID NO:6中第106位的N置换为A且第138位的I置换为D,得到的蛋白质。
所述蛋白质a38可为SEQ ID NO:6中第106位的N置换为A且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a39可为SEQ ID NO:6中第106位的N置换为C且第138位的I置换为D,得到的蛋白质。
所述蛋白质a40可为SEQ ID NO:6中第106位的N置换为C且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
所述蛋白质a41可为SEQ ID NO:6中第106位的N置换为A、第138位的I置换为D且第207位的V置换为A,得到的蛋白质。
其中,SEQ ID NO:6由218个氨基酸残基组成。
为了使蛋白质便于纯化和检测,可在上述任一所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上Poly-Arg标签(RRRRR)、Poly-His标签(HHHHHH)、FLAG标签(DYKDDDDK)、Strep-tagII标签(WSHPQFEK)和c-myc标签(EQKLISEEDL)。
上述任一所述蛋白质可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。上述任一所述蛋白质的编码基因可通过将DNA序列在其5'端和/或3'端连上标签的编码序列得到。
编码上述任一所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。所述核酸分子可以是DNA,如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可以是RNA,如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法,例如定向进化和点突变的方法,对本发明的编码所述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的,具有与本发明分离得到的所述蛋白质的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸,只要编码所述蛋白质,均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与上述任一所述蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高,或80%或更高,或85%或更高,或90%或更高,或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件,两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(%)表示,其可以用来评价相关序列之间的同一性。
含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为向表达载体或克隆载体插入所述核酸分子得到的重组质粒。
所述重组微生物为将所述重组载体导入出发微生物得到的重组菌。
所述出发微生物可为大肠杆菌。所述大肠杆菌具体可为菌株MG1655。
所述转基因细胞系可为将所述重组载体转化受体细胞获得的。所述转基因细胞系为非植物繁殖材料。
本发明还保护上述任一所述蛋白质、上述任一所述核酸分子、或、含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系的应用,可为Y1)-Y6)中的至少一种:
Y1)检测E4P;
Y2)制备用于检测E4P的生物传感器;
Y3)检测菌株生产E4P的能力;
Y4)评价菌株生产E4P下游产物的能力;
Y5)制备生产E4P或E4P下游产物的生物材料;
Y6)生产E4P或E4P的下游产物。
本发明还保护一种用于检测E4P的生物传感器,可包括表达盒;所述表达盒从上游至下游依次可包括启动子、融合基因和终止子;
所述融合基因包括编码上述任一所述蛋白质的核酸分子和编码标记蛋白的基因。
所述融合基因具体可由编码上述任一所述蛋白质的核酸分子和编码标记蛋白的基因组成。
所述表达盒从上游至下游具体可由启动子、融合基因和终止子组成。
上述任一所述标记蛋白可为荧光蛋白、抗性蛋白或毒素蛋白。在本发明的一个实施例中,所述荧光蛋白具体可为荧光蛋白GFPmut2。
上述任一所述启动子可为诱导性启动子或组成型启动子。在本发明的一个实施例中,启动子具体为tac启动子(tac启动子属于诱导性启动子),tac启动子需要诱导剂IPTG诱导启动。
所述融合基因中,编码上述任一所述蛋白质的核酸分子和编码标记蛋白的基因通过连接肽的编码基因偶联;所述连接肽由5-30个(如5-18个、18-30、5个、18个或30个)氨基酸组成。所述连接肽的氨基酸序列具体可如SEQ ID NO:9所示。所述连接肽的编码基因可如SEQ ID NO:5所示。
所述融合基因具体可由编码上述任一所述蛋白质的核酸分子、所述连接肽的编码基因和编码所述标记蛋白的基因组成。
上述任一所述生物传感器可为含有所述表达盒的质粒。在本发明的一个实施例中,所述生物传感器具体可为传感器质粒Te01。在本发明的实施例中,所述生物传感器具体可为传感器质粒EP1—传感器质粒EP75中的任一种。
本发明还保护上述任一所述的生物传感器的应用,可为Y1)、Y3)、Y4)、Y5)或Y6):
Y1)检测E4P;
Y3)检测菌株生产E4P的能力;
Y4)评价菌株生产E4P下游产物的能力;
Y5)制备生产E4P或E4P下游产物的生物材料;
Y6)生产E4P或E4P的下游产物。
上述任一所述Y5)中,生物材料可为菌株。
上述任一所述E4P下游产物可为维生素B6、莽草酸和芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)或其下游次级代谢产物(如脱氧紫色杆菌素、苯丙酮酸、多巴胺、黑色素)等。
本发明还保护一种检测待测菌株生产E4P能力的方法,可包括如下步骤:
(1)将上述任一所述的生物传感器导入待测菌株,得到重组菌;
(2)完成步骤(1)后,培养重组菌;
(3)向完成步骤(2)的体系中加入诱导剂,诱导培养;所述诱导剂诱导启动子启动;
(4)检测完成步骤(3)的体系荧光强度AFU和OD
上述方法中,所述诱导剂可为IPTG,相应的启动子可为tac启动子。
所述步骤(3)中,“完成步骤(2)的体系”的OD
所述步骤(3)中,诱导培养初始,诱导剂(如IPTG)的浓度可为0.5-1.5mM(如0.5-1.0mM、1.0-1.5mM、0.5mM、1.0mM或1.5mM)。诱导培养具体可为35-39℃(如35-37℃、37-39℃、35℃、37℃或39℃)诱导5-9h(如5-7h、7-9h、5h、7h或9h)。
本发明的发明人经过大量实验,对现有的T0蛋白进行突变,制备了一系列可与E4P结合且与E4P的亲和力高于T0蛋白的蛋白质,并用这些蛋白质制备可以快速检测待测菌株生产E4P能力的生物传感器。该生物传感器可以用于筛选与生产E4P或E4P的下游产物的菌株。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为传感器质粒Tp01对E4P的响应效果。
图2为传感器质粒Te01和传感器质粒Te02的图谱。
图3为传感器质粒Te01和传感器质粒Te02对E4P的响应效果。
图4为Te1.0蛋白对E4P梯度的响应效果。
图5为E4P生物传感器的特异性检测。
图6为采用LC-MS检测菌株PE2和菌株PE1中E4P的含量。
图7为传感器质粒EP66对菌株PE2和菌株PE1中E4P的响应效果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
人源HGPRT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
GFPmut2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。GFPmut2蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:3所示。
荧光蛋白GFPmut2记载于如下文献中:Cormack,B.P.,Valdivia,R.H.&Falkow,S.FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein(GFP).Gene 173,33-38(1996).
p15ASI载体记载于如下文献中:Fang,H.et al.Metabolic engineering ofEscherichia coli for de novo biosynthesis of vitamin B12.Naturecommunications 9,4917(2018).
实施例1、传感器质粒Tp01的构建和测试
一、传感器质粒Tp01的构建
用于生物传感器的配体结合蛋白应与配体具有高度的亲和力和特异性。HGPRT蛋白以PRPP和嘌呤为底物,通过催化PRPP上的磷酸核糖转移到嘌呤上,使嘌呤磷酸核糖化形成嘌呤核苷酸。人源HGPRT蛋白对PRPP的Km值很低(<0.1mM)。通过随机突变,Hemalatha等获得了一个HGPRT突变体F36L,该突变体进一步降低了对PRPP的Km(<1μM)且在60℃仍能够保持80%以上的活性(Raman,J.,Sumathy,K.,Anand,R.P.&Balaram,H.A non-active sitemutation in human hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase expandssubstrate specificity.Archives of biochemistry andbiophysics 427,116-122(2004).)。因此,本发明的发明人在人源HGPRT蛋白的基础上,引入了F36L突变点,将突变后的蛋白命名为T0蛋白。T0蛋白作为配体结合蛋白。
1、将T0蛋白进行密码子优化并进行基因合成,基因合成时在T0蛋白的3’端加上18个氨基酸(KESGSVSSEQLAQFRSLD)作为连接肽(即l inker),基因合成后克隆至载体pUC57-Kan(金唯智生物科技有限公司)。得到重组质粒pUC57-T0。
2、以重组质粒pUC57-T0模板,采用引物T0-F和引物T0-R组成的引物对进行PCR扩增,得到约746bp的T0片段。
3、将荧光蛋白GFPmut2进行基因合成并克隆至载体pUC57-Kan上,得到重组质粒pUC57-GFPmut2。
4、以重组质粒pUC57-GFPmut2模板,采用引物GFPmut2-F和引物GFPmut2-R组成的引物对进行PCR扩增,得到约766bp的GFPmut2片段。
5、以p15ASI载体为模板,采用引物p15-ver-F和引物p15-ver-R组成的引物对进行PCR扩增,得到约3866bp的质粒骨架p15ASI-Gibson。
6、将T0片段、GFPmut2片段和质粒骨架p15ASI-Gibson进行Gibson assembly,得到传感器质粒Tp01。
将传感器质粒Tp01进行测序。测序结果表明,传感器质粒Tp01中含有特异DNA分子,特异DNA分子中包括T0蛋白的编码基因(简称T0基因)、连接肽(即linker)的编码基因和荧光蛋白GFPmut2的编码基因(即GFPmut2基因)。
T0蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
连接肽(即linker)的编码基因如SEQ ID NO:5所示。
连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
引物T0-F、引物T0-R、引物GFPmut2-F、引物GFPmut2-R、引物p15-ver-F和引物p15-ver-R的核苷酸序列见表1。
表1
各个质粒的相关性质见表2。
表2
二、传感器质粒Tp01的测试
1、将传感器质粒Tp01转入菌株MG1655的感受态,得到重组菌MG1655-Tp01。
菌株MG1655和重组菌MG1655-Tp01的相关性质见表2。
2、完成步骤1后,将重组菌MG1655-Tp01的单克隆接种于5mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基,37℃、800rpm过夜培养,得到种子液。
3、完成步骤2后,将20μL种子液转接至2mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基,37℃、800rpm培养,得到OD
4、完成步骤3后,向培养菌液中加入IPTG,得到培养体系1;培养体系1中IPTG的浓度为1mM。向培养菌液中加入IPTG和PRPP,得到培养体系2;培养体系2中IPTG的浓度为1mM,PRPP的浓度为0.5mM。向培养菌液中加入IPTG和E4P,得到培养体系3;培养体系3中IPTG的浓度为1mM,E4P的浓度为0.5mM。PRPP可以结合T0蛋白,作为对照。
5、完成步骤4后,取培养体系1、培养体系2、培养体系3或培养菌液,37℃诱导5-9h,然后测定荧光强度(AFU)和在600nm处的吸光度值(OD
检测结果见图1。结果表明,与PRPP相比,传感器质粒Tp01对E4P没有响应。由此可见,T0蛋白对E4P没有结合能力。
实施例2、传感器质粒Te01和传感器质粒Te02的构建及测试
一、蛋白E30和蛋白E89的获得
本发明的发明人在蛋白T0的基础上,将配体E4P对接并匹配到结合口袋区域,通过计算手段对配体周围残基进行模拟突变,并评估突变效果,以稳定配体并增加结合为主要参考手段,通过计算优化,获得蛋白E30和蛋白E89。
蛋白E30的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。将蛋白E30进行密码子优化并进行基因合成,得到蛋白E30的编码基因(即E30基因)。
蛋白E89的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。将蛋白E89进行密码子优化并进行基因合成,得到蛋白E89的编码基因(即E89基因)。
二、传感器质粒Te01的构建
1、将E30基因克隆至载体pUC57-Kan上,得到重组质粒pUC57-E30。
2、以重组质粒pUC57-E30为模板,采用引物E30-F和引物E30-R组成的引物对进行PCR扩增,得到约746bp的E30片段。
3、以传感器质粒Tp01为模板,采用引物E30-ver-F和引物E30-ver-R组成的引物对进行PCR扩增,得到约4584bp的质粒骨架Tp01-Gibson1。
4、将E30片段和质粒骨架Tp01-Gibson1进行Gibson assembly,得到传感器质粒Te01。
传感器质粒Te01的图谱见图2中a。
与传感器质粒Tp01相比,传感器质粒Te01的唯一不同在于将T0基因替换为了E30基因。
三、传感器质粒Te02的构建
1、将E89基因克隆至载体pUC57-Kan上,得到重组质粒pUC57-E89。
2、以重组质粒pUC57-E89模板,采用引物E89-F和引物E89-R组成的引物对进行PCR扩增,得到约747bp的E89片段。
3、以传感器质粒Tp01为模板,采用引物E89-ver-F和引物E89-ver-R组成的引物对进行PCR扩增,得到约4584bp的质粒骨架Tp01-Gibson2。
4、将E89片段和质粒骨架Tp01-Gibson2进行Gibson assembly,得到传感器质粒Te02。
传感器质粒Te02的图谱见图2中b。
与传感器质粒Tp01相比,传感器质粒Te02的唯一不同在于将T0基因替换为了E89基因。
引物E30-F、引物E30-R、引物E30-ver-F、引物E30-ver-R、引物E89-F、引物E89-R、引物E89-ver-F和引物E89-ver-R的核苷酸序列见表3。
表3
各个质粒的相关性质见表4。
表4
四、传感器质粒Te01和传感器质粒Te02的测试
1、将传感器质粒Te01转入菌株MG1655的感受态,得到重组菌,命名为MG1655-Te01。将传感器质粒Te02转入菌株MG1655的感受态,得到重组菌,命名为MG1655-Te02。
2、完成步骤1后,将MG1655-Te01的单克隆接种于5mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基中,37℃、800rpm过夜培养,得到种子液。
3、完成步骤2后,将20μL种子液转接至2mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基,37℃、800rpm培养,得到OD
4、完成步骤3后,向培养菌液中加入IPTG,得到培养体系1;培养体系1中IPTG的浓度为1mM。向培养菌液中加入IPTG和E4P,得到培养体系2;培养体系2中IPTG的浓度为1mM,E4P的浓度为0.5mM、1.0mM或1.5mM。
5、完成步骤4后,取培养体系1、培养体系2或培养菌液,37℃诱导5-9h,然后测定荧光强度(AFU)和在600nm处的吸光度值(OD
按照上述步骤2-5,将MG1655-Te01替换为MG1655-Te02,其它步骤均不变,得到相应的AFU/OD
检测结果见图3。结果表明,传感器质粒Te01显示出一定的E4P响应度,传感器质粒Te02则对E4P无响应。
实施例3、E30蛋白的理性改造
与T0蛋白相比,蛋白E30对E4P分子有了一定的响应度。进一步地,为了提高蛋白对E4P响应的灵敏度,对E30蛋白进行一系列的理性设计。设计的原理主要基于传感器作用机理:在配体不存在的情况下,配体结合蛋白会被胞内自身降解机制所降解,因此荧光蛋白无法稳定存在;在配体存在的情况下,配体结合蛋白会与配体结合,配体结合蛋白能够在胞内稳定存在,荧光蛋白可被检测到。因此,对蛋白E30的三维结构进行计算机模拟分析,发现E30蛋白存在多个loop区,并与蛋白结合口袋有较为紧密的关系,对酶活性中心附近的loop区进行改造,可提高配体结合稳定性。
本发明的发明人对E30蛋白进行理性改造,得到E30突变体。E30突变体是将E30蛋白氨基酸序列中的第19位、第105位、第106位、第138位、第207位、第86位、第83位、第124位、第154位、第125位、第191位、第29位、第33位、第43位和第31位这15位中至少一位的氨基酸残基进行置换得到的。
1、本发明的发明人共获得16个E30突变体,分别命名为EP1蛋白-EP16蛋白。与E30蛋白相比,EP1蛋白-EP16蛋白的氨基酸差异见表5中第2列。
表5
2、分别将EP1蛋白-EP16蛋白进行密码子优化并进行基因合成,依次得到EP1蛋白的编码基因(即EP1基因)-EP16蛋白的编码基因(即EP16基因)。
3、分别构建传感器质粒EP1—传感器质粒EP16。与传感器质粒Te01相比,传感器质粒EP1—传感器质粒EP16的不同在于将E30基因依次替换为了EP1基因-EP16基因。
4、分别将传感器质粒EP1—传感器质粒EP16转入菌株MG1655的感受态,得到重组菌,依次命名为MG1655-EP1—MG1655-EP16。
5、将重组菌(MG1655-Te01、MG1655-EP1、MG1655-EP2、MG1655-EP3、MG1655-EP4、MG1655-EP5、MG1655-EP6、MG1655-EP7、MG1655-EP8、MG1655-EP9、MG1655-EP10、MG1655-EP11、MG1655-EP12、MG1655-EP13、MG1655-EP14、MG1655-EP15或MG1655-EP16)的单克隆接种于5mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基,37℃、800rpm过夜培养,得到种子液。
6、将20μL种子液转接至2mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基,37℃、800rpm培养,得到OD
7、向培养菌液中加入IPTG和E4P,得到培养体系;培养体系中IPTG的浓度为1mM,E4P的浓度为1.5mM。
8、取培养体系,37℃诱导5-9h,然后测定荧光强度(AFU)和在600nm处的吸光度值(OD
实验结果见表5中第4列。结果表明,通过定点突变获得了多个能够结合E4P的E30突变体,用体外添加不同浓度E4P进行响应度验证,获得的最优突变体使得响应度提高了2.27倍。
9、为进一步提高突变体对E4P的响应度,进行了有益位点组合及新突变位点的引入,获得了41个突变体,分别命名为EP17蛋白-EP57蛋白。与E30蛋白相比,EP17蛋白-EP57蛋白的氨基酸差异见表6中第2列。
表6
10、分别将EP17蛋白-EP57蛋白进行密码子优化并进行基因合成,依次得到EP17蛋白的编码基因(即EP17基因)-EP57蛋白的编码基因(即EP57基因)。
11、分别构建传感器质粒EP17—传感器质粒EP57。与传感器质粒Te01相比,传感器质粒EP17—传感器质粒EP57的不同在于将E30基因依次替换为了EP17基因-EP57基因。
12、分别将传感器质粒EP17—传感器质粒EP57转入菌株MG1655的感受态,得到重组菌,依次命名为MG1655-EP17—MG1655-EP57。
13、按照步骤5-8的方法,将重组菌分别替换为MG1655-EP17—MG1655-EP57,其它步骤均不变,得到相应的响应度的提高倍数。
实验结果见表6中第4列。结果表明,通过有益突变组合,获得了多个响应度提高的突变位点组合,获得的最优突变体使得响应度提高了2.36倍。
上述突变体是在E30蛋白的基础上,通过定点突变的方法进行突变,从而改变其氨基酸序列,实现蛋白质结构和功能的改变,具有更高的E4P响应度。
实施例4、Te1.0蛋白的筛选及其对E4P梯度的响应
一、E30突变库的构建
1、将E30基因用TIANDZ即时易错PCR试剂盒v 1.3进行突变建库,得到E30突变蛋白库,具体步骤参照TIANDZ即时易错PCR试剂盒v 1.3的说明书进行。
易错PCR反应体系具体见表7,易错PCR Mix、易错PCR专用dNTP、MnCl
表7
易错PCR反应程序为:94℃3min;94℃1min,45℃1min,72℃1min,40个循环。
2、完成步骤1后,将E30突变蛋白库与GFPmut2通过overlap融合到一块,并通过Gibson-assemble与质粒骨架p15ASI-Gibson连接形成质粒突变库E30-GFPmut2,然后转入菌株DH5α的感受态并涂布于含有氯霉素抗性的LB固体平板上,由所有的单菌落组成E30突变库。
随机挑取20个单菌落,进行E30蛋白DNA测序。测序结果显示,突变率为0-4个突变/kb。
二、E30突变库筛选
对步骤一构建的E30突变库进行两轮流式筛选。具体如下:
1、第一轮筛选
(1)刮取E30突变库的菌落并置于装有10mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基的摇瓶(规格为100mL)中,然后加入IPTG和E4P,得到培养体系;培养体系中,IPTG的浓度为1mM,E4P的浓度为300μM。
(2)取步骤(1)得到的培养体系,37℃、200rpm过夜培养,然后用1×PBS缓冲液稀释100倍,之后流式分选,收集荧光激活率最高的0.03%细胞。
2、第二轮筛选
将第一轮筛选收集的细胞转接至含30mg/L氯霉素和1mM IPTG的LB液体培养基,37℃、200rpm过夜培养,然后用1×PBS缓冲液稀释100倍,之后流式分选,收集荧光激活率最低的3.81%细胞。
3、将第二轮筛选收集的细胞在LB液体培养基中进行复苏,然后涂布于耐氯霉素的固体培养基上,培养,之后对固体培养基上的单菌落进行验证。
(1)将单菌落接种于装有500μL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基的96孔板中,37℃、800rpm过夜培养,然后以1:100比例转接入两个装有200μL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基的细胞培养板中,37℃培养。
(2)待细胞培养至OD
根据测定结果,挑选AFU/OD600(即AFU和OD
三、Te1.0蛋白对E4P梯度的响应
1、将MG1655-F9或MG1655-Te01的单克隆接种于5mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基,37℃、200rpm过夜培养,得到培养菌液1。
2、完成步骤1后,将20μL培养菌液1转接至2mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基,37℃、200rpm培养,得到OD
3、完成步骤2后,向培养菌液2中加入IPTG,得到培养体系1;培养体系1中IPTG的浓度为1mM。向培养菌液2中加入IPTG和E4P,得到培养体系2;培养体系2中IPTG的浓度为1mM,E4P的浓度为0.5mM、1.0mM、1.5mM或2.0mM。
4、完成步骤3后,37℃诱导5-9h,取培养体系1、培养体系2或培养菌液2,然后测定荧光强度(AFU)和在600nm处的吸光度值(OD
检测结果见图4。结果表明,Te1.0蛋白对E4P的响应提高了3倍,E4P浓度和“AFU和OD
实施例5、对E30蛋白的氨基酸序列中的第7位氨基酸进行饱和突变
1、本发明的发明人对E30蛋白氨基酸序列中第7位的甘氨酸残基进行饱和突变,突变形式分别为G7R、G7N、G7D、G7C、G7E、G7Q、G7H、G7I、G7L、G7K、G7M、G7F、G7P、G7S、G7T、G7W、G7Y和G7V,共获得18个E30突变体,分别命名为EP58蛋白-EP75蛋白。与E30蛋白相比,EP58蛋白-EP75蛋白的氨基酸差异见表8中第2列。
表8
2、分别将EP58蛋白-EP75蛋白进行密码子优化并进行基因合成,依次得到EP58蛋白的编码基因(即EP58基因)-EP75蛋白的编码基因(即EP75基因)。
3、分别构建传感器质粒EP58—传感器质粒EP75。与传感器质粒Te01相比,传感器质粒EP58—传感器质粒EP75的不同在于将E30基因依次替换为了EP58基因-EP75基因。
4、分别将传感器质粒EP58—传感器质粒EP75转入菌株MG1655的感受态,得到重组菌,依次命名为MG1655-EP58—MG1655-EP75。
5、按照实施例3步骤5-8的方法,将重组菌分别替换为MG1655-EP58—MG1655-EP75,其它步骤均不变,得到相应的响应度的提高倍数。
实验结果见表8中第4列。结果表明,当E30蛋白氨基酸序列中第7位的甘氨酸残基分别突变为亮氨酸残基、谷氨酰胺残基和甲硫氨酸残基时(对应菌株为MG1655-EP66、MG1655-EP63和MG1655-EP68),响应度分别提高了3.6、3.47和3.54倍。
实施例6、检测E4P生物传感器(即传感器质粒EP66)的特异性
1、将MG1655-EP66的单克隆接种于装有5mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基的96孔板,37℃、800rpm过夜培养,得到种子液。
2、将20μL种子液转接至2mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基,37℃、800rpm培养,得到OD
3、向培养菌液中加入IPTG和代谢物,得到培养体系;培养体系中IPTG的浓度为1mM,代谢物的名称及其在培养体系中的浓度见表9。
表9
4、分别取步骤3得到的培养体系和步骤2得到的培养菌液,37℃诱导5-9h,然后测定荧光强度(AFU)和在600nm处的吸光度值(OD
实验结果见图5。结果表明,E4P生物传感器(即传感器质粒EP66)对E4P具有最大的动态范围和选择性。
实施例7、E4P生物传感器(即传感器质粒EP66)高通量检测菌株E4P的生产能力及其在改造菌株中的应用
在苯丙氨酸代谢途径中,E4P是一个重要的前体物。提高E4P的供应量对苯丙氨酸的生产具有重要意义。本发明的发明人将菌株HDH6进行诱变,然后经过筛选,获得菌株HDH6-D12;菌株HDH6和菌株HDH6-D12的苯丙氨酸产量分别为5.79g/L和9.29g/L;与菌株HDH6相比,菌株HDH6-D12的苯丙氨酸产量提高了60.4%(Liu,Y.et al.Biosensor-BasedEvolution and Elucidation of a Biosynthetic Pathway in Escherichia coli.ACSsynthetic biology6,837-848(2017).)。本发明的发明人进一步发现,与菌株HDH6相比,菌株HDH6-D12中与E4P合成相关的tktA基因存在一个点突变,即T524A。
E4P转化为苯丙氨酸的第一步需要3个蛋白,分别为aroG蛋白(即aroG基因编码的蛋白)、aroF蛋白(即aroF基因编码的蛋白)和aroH蛋白(即aorH基因编码的蛋白)。为了富集E4P同时不影响菌株生长,本发明的发明人敲除了aroG蛋白和aroE蛋白,具体进行如下实验:
1、分别将菌株HDH6-D12和菌株HDH6中的aroG基因和aroF基因进行敲除并丢掉质粒p15A,依次获得菌株PE2和菌株PE1。敲除采用CRISPR-Cas9编辑技术(具体参考如下文献:Zhao,D.et al.Development of a fast and easy method for Escherichia coligenome editing with CRISPR/Cas9.Microbial cell factories 15,205(2016).)进行。敲除aroG基因的引物包括aroG-F、aroG-R、aroG-ver-F、aroG-ver-R、aroG-N20-F和aroG-N20-R,敲除aroF基因的引物包括aroF-F、aroF-R、aroF-ver-F、aroF-ver-R、aroF-N20-F和aroF-N20-R(引物序列见表10),构建的敲除质粒cas9-aroG和敲除质粒cas9-aroF如表11所示。
表10
表11
2、采用LC-MS检测菌株PE2和菌株PE1中E4P的含量。
检测结果见图6。结果表明,与菌株PE1相比,菌株PE2中E4P的含量显著增加,即菌株PE2的E4P生产能力优于菌株PE1。
3、采用E4P生物传感器(即传感器质粒EP66)检测菌株对E4P的响应度
(1)将传感器质粒EP66转入菌株PE2的感受态,得到重组菌,命名为PE2-EP66。将传感器质粒EP66转入菌株PE1的感受态,得到重组菌,命名为PE1-EP66。
(2)将PE1-EP66或PE2-EP66的单克隆接种于5mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基的,37℃、800rpm过夜培养,得到种子液。
(3)将1mL种子液接种至装有20mL含30mg/L氯霉素的LB液体培养基的三角瓶(规格为250mL),37℃、800rpm培养,得到OD
(4)向培养菌液中加入IPTG,得到培养体系;培养体系中IPTG的浓度为1mM。
(5)取步骤(4)得到的培养体系,37℃诱导5-9h,然后测定荧光强度(AFU)和在600nm处的吸光度值(OD
检测结果见图7。结果表明,与PE1-EP66相比,PE2-EP66的AFU/OD
由此可见,采用本发明构建的E4P生物传感器可以高通量检测及评价菌株E4P的生产能力;还可以据此对目的菌株进行改造,获得高产“E4P的下游产物(如苯丙氨酸)”的菌株。本发明在菌株改造和代谢工程中具有重要的应用价值。
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种快速检测待测菌株生产E4P能力的方法及其使用的生物传感器
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Met Ala Thr Arg Ser Pro Gly Val Val Ile Ser Asp Asp Glu Pro Gly
1 5 10 15
Tyr Asp Leu Asp Leu Phe Cys Ile Pro Asn His Tyr Ala Glu Asp Leu
20 25 30
Glu Arg Val Phe Ile Pro His Gly Leu Ile Met Asp Arg Thr Glu Arg
35 40 45
Leu Ala Arg Asp Val Met Lys Glu Met Gly Gly His His Ile Val Ala
50 55 60
Leu Cys Val Leu Lys Gly Gly Tyr Lys Phe Phe Ala Asp Leu Leu Asp
65 70 75 80
Tyr Ile Lys Ala Leu Asn Arg Asn Ser Asp Arg Ser Ile Pro Met Thr
85 90 95
Val Asp Phe Ile Arg Leu Lys Ser Tyr Cys Asn Asp Gln Ser Thr Gly
100 105 110
Asp Ile Lys Val Ile Gly Gly Asp Asp Leu Ser Thr Leu Thr Gly Lys
115 120 125
Asn Val Leu Ile Val Glu Asp Ile Ile Asp Thr Gly Lys Thr Met Gln
130 135 140
Thr Leu Leu Ser Leu Val Arg Gln Tyr Asn Pro Lys Met Val Lys Val
145 150 155 160
Ala Ser Leu Leu Val Lys Arg Thr Pro Arg Ser Val Gly Tyr Lys Pro
165 170 175
Asp Phe Val Gly Phe Glu Ile Pro Asp Lys Phe Val Val Gly Tyr Ala
180 185 190
Leu Asp Tyr Asn Glu Tyr Phe Arg Asp Leu Asn His Val Cys Val Ile
195 200 205
Ser Glu Thr Gly Lys Ala Lys Tyr Lys Ala
210 215
<210> 2
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60
gacgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120
aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180
gtcactactc tgacttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaaacag 240
catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300
aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360
aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420
ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480
atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540
cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc tttcaccaga caaccattac 600
ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660
cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaatag 717
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<211> 238
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 3
Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
50 55 60
Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln
65 70 75 80
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
85 90 95
Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
115 120 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
130 135 140
Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
145 150 155 160
Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val
165 170 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Ser Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser
195 200 205
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
210 215 220
Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
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<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 4
Met Ala Thr Arg Ser Pro Gly Val Val Ile Ser Asp Asp Glu Pro Gly
1 5 10 15
Tyr Asp Leu Asp Leu Phe Cys Ile Pro Asn His Tyr Ala Glu Asp Leu
20 25 30
Glu Arg Val Leu Ile Pro His Gly Leu Ile Met Asp Arg Thr Glu Arg
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Leu Ala Arg Asp Val Met Lys Glu Met Gly Gly His His Ile Val Ala
50 55 60
Leu Cys Val Leu Lys Gly Gly Tyr Lys Phe Phe Ala Asp Leu Leu Asp
65 70 75 80
Tyr Ile Lys Ala Leu Asn Arg Asn Ser Asp Arg Ser Ile Pro Met Thr
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100 105 110
Asp Ile Lys Val Ile Gly Gly Asp Asp Leu Ser Thr Leu Thr Gly Lys
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Thr Leu Leu Ser Leu Val Arg Gln Tyr Asn Pro Lys Met Val Lys Val
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Ala Ser Leu Leu Val Lys Arg Thr Pro Arg Ser Val Gly Tyr Lys Pro
165 170 175
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Leu Asp Tyr Asn Glu Tyr Phe Arg Asp Leu Asn His Val Cys Val Ile
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<211> 54
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aaggaatcag gcagcgtgtc atcagaacaa ctggctcaat tccgctcact tgac 54
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 6
Met Ala Thr Arg Ser Pro Gly Val Val Ile Ser Asp Asp Glu Pro Gly
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Leu Cys Ala Leu Gly Gly Val Tyr Lys Phe Phe Ala Asp Leu Leu Asp
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<213> Artificial sequence
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1 5 10 15
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Met Ala Thr Arg Ser Pro Ala Val Val Ile Ser Asp Asp Glu Pro Gly
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Leu Cys Ala Leu Gly Gly Val Tyr Lys Phe Phe Ala Asp Leu Leu Asp
65 70 75 80
Tyr Ile Lys Ala Leu Asn Arg Asn Ser Asp Arg Ser Ile Pro Met Thr
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Asp Ile Lys Val Ile Gly Gly Asp Asp Leu Ser Thr Leu Thr Gly Lys
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Asn Val Leu Ile Val Asp Asp Leu Ile Ile Thr Gly Lys Arg Met Gln
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Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
- 一种快速检测待测菌株生产E4P能力的方法及其使用的生物传感器
- 一种快速检测待测菌株生产E4P能力的方法及其使用的生物传感器