一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒

文献发布时间：2023-06-19 11:19:16

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒。

背景技术

冠状病毒(Coronavirus，CoV)是一类具有囊膜，基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒分为α、β、γ和δ共4个属，其中α和β冠状病毒可以感染哺乳动物，而γ和δ冠状病毒主要感染鸟类。此前已经发现有6种冠状病毒可感染人类：α冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-NL63)和β冠状病毒(HCoV-HKU1，HCoV-OC43、MERS-CoV、SARS-CoV)，患者表现从普通感冒到重症肺部感染。新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2，SARS-CoV-2)是一种先前尚未在人类中发现的β属冠状病毒，在人群中具有极强的传染性，主要通过呼吸道飞沫、呼吸道分泌物和直接接触传播。COVID-19患者通常表现出特定的相似症状，例如发烧、全身乏力和咳嗽。大多数患者都表现出轻度的流感样症状，预后良好。但少数患者病情危重，并迅速发展为急性呼吸窘迫综合征、呼吸衰竭、多器官衰竭甚至死亡。

目前病毒的检测方法主要包括病毒分离法、免疫学方法和分子诊断法。病毒分离法耗时长、不能大规模应用于临床快速、准确的检测；免疫学方法(ELISA、抗原抗体检测等)可以快速检出，但灵敏度不足，多在患病后才能检出，比较滞后，不利于筛查，也无法确诊；现代分子生物学诊断方法特异性好、灵敏度高，目前市面上大多采用RT-PCR方法的检测试剂盒。

2019新型冠状病毒传染性强，能引起病毒性肺炎，在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。为了控制疫情，大家都在积极研发相应的诊断试剂盒，但由于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的发现时间短，对其基因组特征、结构特征、发病机理等方面还在不断的研究当中。目前的新型冠状病毒抗体检测试剂盒，也因研发周期短，检测试剂盒的灵敏度和特异性都有待提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用实时荧光定量交叉引物等温扩增技术特异、快速、高效地检测新型冠状病毒的试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种检测新型冠状病毒的引物，包括两组引物，每组引物包含一对剥离引物、一对交叉扩增引物、一对检测引物，分别是：

第一组：

剥离引物：如SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.2所示的反向引物；

交叉扩增引物：如所SEQ ID NO.3示的正向引物和SEQ ID NO.4所示的反向引物；

检测引物：如SEQ ID NO.5所示的正向引物和SEQ ID NO.6所示的反向引物；

第二组：

剥离引物：如SEQ ID NO.7所示的正向引物和SEQ ID NO.8所示的反向引物；

交叉扩增引物：如SEQ ID NO.9所示的正向引物和SEQ ID NO.10所示的反向引物；

检测引物：如SEQ ID NO.11所示的正向引物和SEQ ID NO.12所示的反向引物。

优选地，检测新型冠状病毒的两组引物均适用于实时荧光定量交叉引物等温扩增技术。该技术是一种方便快速的检测方法，具有操作简单、耗时短、特异性强、灵敏度高及可视化的优点。

优选地，第一组引物用于检测新型冠状病毒基因组中的ORF1ab基因；第二组引物用于检测新型冠状病毒基因组中的S基因。试剂盒设计两个靶基因和位点检测能有效降低漏检和错检的概率，提高试剂盒检测的准确性。

本发明还公开了一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，包括如上所述的检测新型冠状病毒的引物。本发明新型冠状病毒核酸检测试剂盒的检测原理是利用具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)，使用可视化的实时荧光定量交叉引物等温扩增技术，特异、快速、高效地完成的扩增反应。在扩增反应发生的同时，可以使用荧光实时监测设备监测扩增情况。本发明使用该技术进行核酸检测，不仅可以对样品进行定性定量的检测，还可以实时观测数据的变化，有利于对样品数据的全面收集，方便进行下一步的研究。因此本发明不仅适用于现场快速检测，还适用于以科研为目的的检测。

优选地，本发明新型冠状病毒核酸检测试剂盒还包括缓冲液、dNTPs、Mg

更优选地，新型冠状病毒核酸检测试剂盒还包括环己醇琥珀酸酯。添加环己醇琥珀酸酯可以使扩增更稳定，更容易进行，即使在样本含量极低的情况下也能进行准确的扩增。

更优选地，荧光染料为SYBR Green I。

优选地，新型冠状病毒核酸检测试剂盒还包括阳性对照组和阴性对照组。

更优选地，阳性对照组为携带新型冠状病毒基因组中的ORF1ab基因片段或新型冠状病毒基因组中的S基因片段的质粒。使用携带质粒ORF1ab或S基因片段的质粒作为阳性对照，制备方便并且位点信息准确；相比于使用携带外源基因的RNA假病毒更加准确，相比于临床样品SARS-CoV-2病毒更加容易获取并且不易发生生物安全问题。

更优选地，阴性对照组为无菌去离子水。

更优选地，新型冠状病毒核酸检测试剂盒包括六个容器，分别为：第一容器包括dNTPs、缓冲液；第二容器包括两组引物和荧光染料；第三容器包括Bst DNA聚合酶、逆转录酶和RNase抑制剂；第四容器包括Mg

更优选地，新型冠状病毒核酸检测试剂盒包括六个容器，分别为：第一容器包括dNTPs、缓冲液、环己醇琥珀酸酯；第二容器包括两组引物和荧光染料；第三容器包括BstDNA聚合酶、逆转录酶和RNase抑制剂；第四容器包括Mg

本发明有如下优点：

本发明新型冠状病毒核酸检测试剂盒可以对两个基因靶位同时进行检测，可以有效避免假阴性或者假阳性结果的出现。本发明提供的新型冠状病毒核酸检测试剂盒的操作方法仅需要进行一次加样，有效避免了污染样本，并且还能减少操作人员与样品的接触，尽可能保证操作人员的安全；同时，还能提高检测效率。本发明新型冠状病毒核酸检测试剂盒的检测原理是使用可视化的实时荧光定量交叉引物等温扩增技术和具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)，在恒温条件下反应，即可特异、快速、高效地完成扩增反应。在扩增反应发生的同时，可以使用荧光定量设备实时监测扩增情况。本发明使用该技术进行核酸检测，不仅可以对样品进行定性定量的检测，还可以实时观测数据的变化，有利于对样品数据的全面收集，方便进行下一步的研究。因此本发明不仅适用于现场快速检测，还适用于以科研为目的的检测。本发明新型冠状病毒核酸检测试剂盒在常规缓冲液的基础上添加环己醇琥珀酸酯，可以增强扩增时的稳定性，使扩增更容易进行，即使在样本含量极低的情况下也能进行准确的扩增。

附图说明

图1为新型冠状病毒的核酸检测的扩增结果；

图2为本发明新型冠状病毒核酸检测试剂盒对不同浓度梯度新型冠状病毒检测的扩增结果；

图3为本发明新型冠状病毒核酸检测试剂盒特异性检测结果。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

新型冠状病毒核酸检测试剂盒的研制

一、引物的设计

参照新型冠状病毒诊疗指南，为了确保新型冠状病毒的检出并且避免出现假阳性或假阴性，选择新型冠状病毒ORF1ab基因(Gene ID:43740578)和S基因(Gene ID:43740568)的保守区域为靶点进行检测。

参考交叉引物恒温扩增检测方法的通用技术规程，按下述引物设计要求设计引物：

(1)剥离引物之间的距离在150～200bp之间，剥离引物的长度在17～20bp，温度在48～58℃之间；

(2)交叉扩增引物之间的距离在45～100bp之间，交叉扩增引物的长度在34～42bp，单一片段的温度在65～75℃之间；

(3)检测引物之间的距离在40～80bp之间，检测引物的长度在18～22bp，温度在48～55℃之间；

(4)尽量避免引物之间形成引物二聚体；

(5)所有的引物中应避免出现连续4～5个相同的碱基。根据上述引物设计原则，本发明中选择了ORF1ab基因和S基因多个不同位置分别设计了20组引物，分别对每组引物进行测试并筛选。基于大量引物设计和筛选工作，最终优选出的两组最佳引物。第一组引物用于检测ORF1ab基因，第二组引物用于检测S基因。引物如表1所示。

表1检测新型冠状病毒的引物

二、新型冠状病毒核酸检测试剂盒的组成

新型冠状病毒核酸检测试剂盒的组成及其浓度分别见表2和表3。

表2新型冠状病毒核酸检测试剂盒的组成

表3新型冠状病毒核酸检测试剂盒各组成成分的浓度

实施例2

一、引物的设计

同实施例1。

二、新型冠状病毒核酸检测试剂盒的组成

新型冠状病毒核酸检测试剂盒的组成及其浓度分别见表4和表5。

表4新型冠状病毒核酸检测试剂盒的组成

表5新型冠状病毒核酸检测试剂盒各组成成分的浓度

此外，根据实施例1引物设计要求进行引物设计，本发明中选择了ORF1ab基因和S基因多个不同位置分别设计了20组引物，分别对每组引物进行测试并筛选。由于内容过多，仅选择部分结果作为对比例进行呈现：

对比例1

新型冠状病毒核酸检测试剂盒的研制

一、引物的设计参照实施例1中的引物设计原则，针对新型冠状病毒ORF1ab基因和S基因设计引物如表6所示。

表6对比例1新型冠状病毒的引物

二、新型冠状病毒核酸检测试剂盒的组成

同实施例1。

对比例2

一、引物的设计

参照实施例1中的引物设计原则，针对新型冠状病毒ORF1ab基因和S基因设计引物如表7所示。

表7对比例7新型冠状病毒的引物

二、新型冠状病毒核酸检测试剂盒的组成

同实施例1。

试验例1

新型冠状病毒的核酸检测

一、检测方法

病毒基因组的提取采用美国Fisher Scientific公司的LabServ预分装病毒总核酸提取试剂盒(96×2规格，批号：B21T001)提取，在样本处理区按照说明书操作步骤提取核酸。阴性对照品和阳性对照品均参与提取，作为对环境和PCR检测试剂的质控。

实时荧光定量单交叉引物等温扩增在20μL体系中进行，包括PCR反应液10μL，检测液4μL，酶液2μL，MgCl

整个体系放置于安誉科技AGS8800恒温扩增荧光检测仪进行反应，设置反应温度为63℃，反应时间为75min，每50s检测一次荧光信号。

二、检测结果

本试剂盒的结果判定标准如下：

阴性对照品：无CT值并且无典型的扩增曲线；

阳性对照品：CT值≤36且出现典型的扩增曲线；

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则需重新进行。

若检测样品无CT值并且无典型的扩增曲线，可判样品为未检测到新型冠状病毒；若检测样品与阳性对照品同时出现典型的扩增曲线且CT值≤36，可判样品为新型冠状病毒阳性。

检测结果如图1所示。从图1可以看出，检测样品与阳性对照品同时出现典型的扩增曲线且CT值≤36，因此样品为新型冠状病毒阳性。说明本发明新型冠状病毒核酸检测试剂盒具有检测新型冠状病毒的能力。

试验例2

试剂盒灵敏度检测

将制备的含新型冠状病毒ORF1ab基因和S基因靶标序列的质粒梯度稀释至10

表8新型冠状病毒灵敏度检测结果

由表8可以看出，相比于对比例1和对比例2，本发明实施例1和实施例2新型冠状病毒核酸检测试剂盒能够在样品浓度低至10

试验例3

试剂盒特异性检测

采用本发明实施例1新型冠状肺炎核酸检测试剂盒按照试验例1的方法对甲型流感H1N1，H1N2，呼吸道合胞病毒A型，B型，长翼蝠冠状病毒HKU1，果蝠冠状病毒HKU9和新型冠状病毒分别进行检测，检测结果如图3所示。由图3可以看出，仅新型冠状病毒出现了典型的扩增曲线且CT值≤36，说明本发明试剂盒特异性好。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 杭州安誉科技有限公司

<120> 一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA