猫常见病毒多重PCR快速检测试剂盒及其引物组

文献发布时间：2023-06-19 11:19:16

技术领域

本发明属于猫呼吸道及肠道病毒核酸检测技术领域，尤其涉及一种猫常见病毒多重PCR快速检测试剂盒及其引物组。

背景技术

近年来，随着宠物行业的兴起，猫群发生多种病原混合感染的情况愈加普遍。猫杯状病毒(FCV)、猫细小病毒(FPV)、猫流感病毒(FIV)和猫疱疹病毒Ⅰ型病毒(FHV-1)是在猫科动物中流行的主要病原体，由于其病理变化在临床症状及流行病学上的相似性，难以区分这些疾病。同时，根据发明人对猫疱疹病毒Ⅰ型病毒(FHV-1)的监测发现，其在临床病例中较为常见，且呼吸道病毒感染的协同性、继发性会严重危害患猫的身体健康。上述疾病在猫科动物中的混合感染给实验室诊断和临床治疗带来巨大的挑战。

猫杯状病毒(Feline calicivirus，FCV)是猫的一种高度传染性病原体，在猫科动物中广泛分布。该病主要引起猫科动物上呼吸道疾病及口腔溃疡等临床症状，死亡率高达50％左右。除呼吸道症状外，感染的猫还可出现发热、黄疸、皮肤水肿、皮肤水肿和溃疡性皮炎等症状，且该病毒基因组变异性强，接种疫苗常缺乏有效的保护作用，对猫科动物的健康造成严重的威胁。

猫细小病毒(Feline parvovirus，FPV)是猫及猫科动物的一种高度传染性和致死性疾病病原体，患猫常出现高热、呕吐、腹泻，肠炎等，使白细胞大大减少，故又称猫泛白细胞减少症病毒。6月龄以下的幼猫更易感，发病率和死亡率均高于成年猫，通过呼吸道或消化道均可传播。此外，妊娠期母猫感染可导致流产或木乃伊胎，甚至导致胎儿中枢神经、大脑、小脑和视神经等损伤，致其残疾。虽然疫苗免疫和抗体治疗对细小病毒病的预防和治疗起到了至关重要的作用，但该病毒对外界的抵抗力较强，以及宠物主错误的认为室内猫无需接种疫苗，所以该病仍然普遍流行，严重危害猫科动物的健康。

猫流感病毒(Feline influenza virus，FIV)主要在猫及猫科动物中通过呼吸道传播，患猫可能表现为咳嗽、打喷嚏、流鼻涕、高热、气喘和精神沉郁，甚至死亡。目前，已从猫及猫科动物身上分离到的流感病毒亚型包括：H1N1、H5N1、H3N2、H5N6及H7N2等。这说明，流感病毒在哺乳动物中突破种间屏障的情况愈发常见。猫被证实对流感病毒较为易感，是否意味着猫可以作为流感病毒潜在的“混合容器”，需要通过建立快速敏感的方法进行监测，为流感病毒从猫传播给人提供提前预警。

猫疱疹病毒I型(Felidherpesvirus1，FHV-1)可引起猫传染性鼻气管炎，是一种以侵害猫科动物上呼吸道和眼结膜为主的急性、高度接触性传染病。该病在临床上发病率接近100％，病死率约为50％，除接触和飞沫传播外，还可通过发情期交配传播和垂直传播。幼猫对该病毒更易感，病猫主要表现为发热、体温升高、精神沉郁、眼鼻分泌物增多、打喷嚏，呈典型上呼吸道感染症状；有些病猫表现出舌和硬腭溃疡、呼吸困难等症状；此外，疱疹性角膜炎表现出的严重树枝状溃疡常作为示病症状。疱疹病毒一般潜伏于动物的三叉神经中，免疫力低下及应激的时候可发病，且治愈后终生会复发感染，损害猫科动物的健康，所以监测FHV-1流行情况是很有必要的。

目前检测FPV、FCV和FHV-I的主要方法有病原分离鉴定、血清学诊断、单一PCR等，而且FCV和FHV根据临床症状和流行病学较难区分，必须依靠实验室检测技术进行鉴别诊断。其中，电镜观察、病毒分离、荧光抗体技术等常用诊断技术成本较高、操作复杂、难度较大；血清学方法准确率较低，常用的单一PCR方法耗时长。因此，有必要建立能同时检测上述四种病毒的早期快速诊断方法，以便尽快采取有效的治疗方案，减少这些疾病对猫科动物造成的危害。

2004年报道了家猫及动物园猫科动物吃了感染H1N1禽流感的鸡后发病死亡，这证明猫科动物对流感病毒也是极易感的。甚至有研究指出，2009-2010年美国俄勒冈州对家猫的血清学调查显示，大流行H1N1/2009、季节性H1N1和H3N2的阳性率分别为22.5％、33％和43.5％；2012-2013年对东北地区1255只家猫血清学调查显示大流行H1N1/2009阳性率可达21％，以上研究均表明流感病毒已在猫中稳定传播，甚至可通过由犬到猫的传播。虽还未有由犬猫流感传染给人的报道，但犬猫可作为中间宿主的作用愈加明显，多种亚型的犬猫流感病毒与人流感病毒之间可能发生重排从而获得突破种间屏障的能力从而传染给人或其他哺乳动物。此外，由于经济迅速发展，伴侣动物在人们生活中扮演了重要的角色，与人的接触越来越密切。并且，犬猫流感病毒通过全球贸易逐渐突破地理屏障传播到世界各地，增加了全球大流行的风险，对公共卫生健康产生潜在的威胁。因此，建立相关的检测技术，加强对犬猫流感病毒的监测，降低犬猫流感病毒爆发带来的风险是十分有必要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速简便、准确特异的猫常见病毒多重PCR快速检测试剂盒及其引物组，以便临床及科研中对四种猫呼吸道、肠道病毒(FCV、FPV、FIV、FHV-1)的快速检测及流行病学调查。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

猫常见病毒多重PCR快速检测引物组，包括针对FCV、FPV、FIV、FHV-1四种猫呼吸道及肠道病毒的四对PCR引物，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。

上述引物组在制备猫常见病毒多重PCR快速检测试剂盒中的应用。

猫常见病毒多重PCR快速检测试剂盒，主要由PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品和引物组成，引物包括针对FCV、FPV、FIV、FHV-1四种猫呼吸道及肠道病毒的四对PCR引物，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。

PCR标准品包括ORF2-FCV标准品、NS1-FPV标准品、M-FIV标准品和gB-FHV-1标准品；阳性对照品是含ORF2-FCV、NS1-FPV、M-FIV、gB-FHV-1四种病毒阳性质粒的混合物；阴性对照品是灭菌后的去离子水；四对PCR引物中所有上游引物同管包装，所有下游引物同管包装。

质粒混合物的浓度为4.45×10

四对PCR引物的体系终浓度占比为2：2：2：3。

上述引物组或试剂盒在PCR扩增FCV、FPV、FIV、FHV-1四种猫呼吸道及肠道病毒的ORF2、NS1、M、gB基因中的应用。

PCR扩增的程序为先95℃预变性5min，40个循环的反应条件为95℃变性35s，56℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。

针对四种猫常见病毒存在交叉感染、混合感染、难以区分且病程短毒力强的问题，发明人运用多重PCR技术，针对性地设计了相应的特异性引物，共同构成了猫常见病毒多重PCR快速检测引物组，包括针对FCV、FPV、FIV、FHV-1四种猫呼吸道及肠道病毒的四对PCR引物，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。据此，发明人还研制了对应的快速检测试剂盒。应用本发明可在同一反应管内同时检测FCV、FPV、FIV、FHV-1四种猫常见病毒的单个或混合感染，具有特异性高、敏感性好、耗时短且成本低的特点，它对重组质粒标准品的检出量可低至4.45×10

附图说明

图1是应用本发明的四重PCR检测的电泳图，图中：M：DL2000 DNA Marker；2、3、4和5泳道分别对应用FCV、FPV、FIV、FHV-1阳性质粒扩增的目的条带。

图2是应用本发明的四重PCR检测的温度梯度试验电泳图，图中：泳道从左至右依次为M：DL2000 DNA Marker；1：48℃；2：50℃；3：52℃；4：54℃；5：56℃；6：58℃；7：60℃。

图3是应用本发明的四重PCR检测的重复性试验电泳图，图中：泳道从左至右依次为M：DL2000 DNA Marker；1-5：同一体系及反应条件下电泳图。

图4是应用本发明的四重PCR检测的多重敏感性试验电泳图，图中：泳道从左至右依次为M：DL2000 DNA Marker；1：4.45×10

图5是应用本发明的四重PCR检测的多重特异性试验电泳图，包括混合引物检测单一模板(对应泳道3、4、5、6)和混合引物检测其他病毒(对应7)，图中：泳道从左至右依次为M：DL2000 DNA Marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3：FCV质粒单一模板；4：FPV质粒单一模板；5：FIV质粒单一模板；6：FHV-1质粒单一模板；7：FCoV质粒单一模板。

具体实施方式

实施例1、试剂盒组装和使用

为方便使用，将本发明所用试剂组装成四种猫常见病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒，主要由PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品、引物以及盒体组成。盒体中设有相应的容器孔，用于分别放置各试剂。

引物包括表1所示四对PCR引物(由北京擎科新业生物技术有限公司合成，合成量为每管引物1OD)，它们分别针对FCV、FPV、FIV、FHV-1四种猫常见病毒，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。四对PCR引物中的所有上游引物同管包装，所有下游引物同管包装。

表1本发明中所设计的多重PCR引物

本发明的引物设计与现有的PCR检测区别较大：一方面，由于猫细小病毒和猫疱疹病毒Ⅰ型的NS1基因、UL27(gB)基因保守性很强，是设计鉴定引物的良好靶位。另一方面，FCV的基因组变异性强，其基因组序列极其不保守，发明人研究了国内外三十余株序列并进行了比对，最后选定ORF2来设计引物，然而，ORF2变异性也很大，为增强本发明检测的特异性，发明人将其检测引物的扩增片段设计为待测四个扩增片段中的最小值。此外，在比较了NCBI登录的11株FIV的NP基因以及16株FIV的M基因之后，发明人发现M基因保守性更强，故决定以其为靶点设计相应检测引物。验证过程中，发明人发现设计的引物存在错配问题，极大的影响了检测的特异性和敏感性，为此，通过人工调整减少兼并碱基的使用，从而得到了上述特异性好、敏感性高、准确高效的引物组。

PCR标准品包括FCV标准品、FPV标准品、FIV标准品和FHV-1标准品；阳性对照品是含FCV、FPV、FIV、FHV-1四种病毒的阳性质粒混合物(浓度约为4.45×10

其中，四种病毒标准品的序列为序列表SEQ.ID.NO.9至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。(登录号分别为KT970059.1、MG924893.1、KC422468.1、NC013590.2)

试剂盒的各试剂均保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

试剂盒的使用方法

每次检测根据具体情况设立阴性对照和阳性对照；标准品用无菌超纯水稀释为10

DNA/RNA病毒样品提取：根据产品使用说明书，用病毒DNA/RNA抽提试剂盒AxyPrepBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(Axygen)从细胞株、新鲜或冷冻的样品中提取病毒核酸。

反转录反应：

1.猫杯状病毒反转录合成cDNA；在高压灭菌的0.2mL PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA模板8μL,5×Reversa Transcriptase M-MLV Buffer(TaKaRa)2.5μL,dNTPMixture(TaKaRa)1μL,FCV-R 0.5μL,Reversa Transcriptase M-MLV(TaKaRa)0.25μL,Ribolock RNase Inhibitor(Vazyme)0.25μL,总体积为12.5μL，反应条件为42℃反应1h，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA模板。

2.猫流感病毒反转录合成cDNA：在高压灭菌的0.2mL PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA模板8μL,5×Reversa Transcriptase M-MLV Buffer(TaKaRa)2.5μL,dNTPMixture(2.5mM,TaKaRa)1μL,Uni12 0.5μL,Reversa Transcriptase M-MLV(TaKaRa)0.25μL,Ribolock RNase Inhibitor(Vazyme)0.25μL,总体积为12.5μL，反应条件为42℃反应1h，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA模板。

核酸的检测：取2μL提取FHV-1的DNA、1.5μL提取FPV的DNA、已制备FCV和FIV的cDNA模板1μL进行多重PCR反应，其中Green Taq Mix(Vazyme)14μL，FCV、FPV和FIV上游引物混合物1.5μL，下游引物混合物1.5μL，FHV-1上游引物0.75μL，下游引物0.75μL，ddH

结果报告：在阴性对照与阳性对照成立的条件下，根据FCV、FPV、FIV和FHV-1扩增基因片段的有无，对是否有这四种猫常见病毒进行鉴定。

实施例2、本发明检测五种病毒的特异性实验

按照多重PCR反应体系，Green Taq Mix(Vazyme)14μL，FCV、FPV和FIV上游引物混合物1.5μL，下游引物混合物1.5μL，FHV-1上游引物0.75μL，下游引物0.75μL，ddH

反应在life ProFlex PCR扩增仪进行，反应程序为：先95℃预变性5min，40个循环的反应条件为95℃变性35s，56℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。取10μL PCR产物，点样于2％的琼脂凝胶电泳板孔中，140V电压，电泳约20min，于凝胶成像仪紫外成像后拍照判定，结果参见图5，对应PCR产物大小与表1中FCV、FPV、FIV、FHV-1分别为257bp、380bp、519bp、761bp完全一致，表明本发明构建的猫常见病毒多重PCR检测试剂盒特异性好。

实施例3、本发明检测五种病毒的敏感性实验

多重PCR敏感性检测反应体系：Green Taq Mix(Vazyme)14μL，FCV、FPV和FIV上游引物混合物1.5μL，下游引物混合物1.5μL，FHV-1上游引物0.75μL，下游引物0.75μL，ddH

反应在life ProFlex PCR扩增仪进行，反应程序为：先95℃预变性5min，40个循环的反应条件为95℃变性35s，56℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。取10μL PCR产物，2％琼脂凝胶电泳检测。

实验结果表明，多重PCR反应对FCV、FPV、FIV和FHV-1四种种病毒的最低检出量为24.48copies，可见该检测方法的灵敏度较好，结果参见图4。

实施例4、本发明检测四种猫常见病毒的临床实例

第一步：样本采集

分别将猫细小病毒、猫疱疹病毒Ⅰ型和流感病毒阳性细胞毒分别接种于CRFK、MDCK细胞，扩繁所得阳性细胞病毒液，经过RNA抽提之后用于临床试验检测。

第二步：总RNA小量抽提

根据产品使用说明书，用病毒RNA抽提试剂盒AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(Axygen)从新鲜或冷冻的样品中提取病毒核酸。

第三步：反转录合成cDNA

1.猫杯状病毒反转录合成cDNA：

在高压灭菌的0.2mL PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA模板8μL,5×Reversa Transcriptase M-MLV Buffer(TaKaRa)2.5μL,dNTP Mixture(TaKaRa)1μL,FCV-R0.5μL,Reversa Transcriptase M-MLV(TaKaRa)0.25μL,Ribolock RNase Inhibitor(Vazyme)0.25μL,总体积为12.5μL，反应条件为42℃反应1h，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA模板

2.猫流感病毒反转录合成cDNA：

在高压灭菌的0.2mL PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA模板8μL,5×Reversa Transcriptase M-MLV Buffer(TaKaRa)2.5μL,dNTP Mixture(2.5mM,TaKaRa)1μL,Uni120.5μL,Reversa Transcriptase M-MLV(TaKaRa)0.25μL,Ribolock RNaseInhibitor(Vazyme)0.25μL,总体积为12.5μL，反应条件为42℃反应1h，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA模板。

第四步：本发明多重PCR进行临床病料检测

1、本发明多重PCR检测体系如下：取5.5μL已制备的cDNA模板进行多重PCR反应，其中Green Taq Mix(Vazyme)14μL，FCV、FPV和FIV上游引物混合物1.5μL，下游引物混合物1.5μL，FHV-1上游引物0.75μL，下游引物0.75μL，ddH

第五步：检测结果

本发明检测了来自南宁、河池和柳州共69份临床病料，其中6份FPV单重感染，FCV和FPV混合感染7份，FCV和FHV-1混合感染1份，FCV、FIV和FPV混合感染7份。

综上，本发明可一次性同时可以检出多种混合感染病毒，减少了PCR次数，大大节约了时间和试剂耗材成本，提高了工作效率。设计的FCV、FPV、FIV和FHV-1引物均呈现良好的特异性和敏感性，建立的检测方法对重组质粒标准品的检出量可低至4.45×10

序列表

<110> 广西大学

<120> 猫常见病毒多重PCR快速检测试剂盒及其引物组

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA