一种皮肤年轻化蛋白标志物—HP蛋白及其无创性提取方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种皮肤年轻化蛋白标记物—肝珠蛋白HP及其无创性提取方法。

背景技术

皮肤老化，也即皮肤衰老，是指皮肤功能衰老性损伤，使皮肤对机体的防护能力，调节能力等减退，由此皮肤不能适应内外环境的变化，出现颜色、色泽、形态、质感等外观整体状况的改变。皮肤的老化分为内源性老化和外源性老化。内源性老化是指皮肤随年龄增长的自然老化。表现为皮肤变白，出现细小皱纹、弹性下降、皮肤松弛等。外源性老化的最主要原因是日晒所致的光老化。表现为皱纹、皮肤松弛、粗糙、淡黄或灰黄色的皮肤变色、毛细血管扩张、色素斑形成等。

随着人们生活水平的提高，人们越来越重视皮肤保养，但通常只是关注皮肤衰老的外在表现，比如皱纹、色斑、以及毛孔粗细程度等信息，并由此来判断皮肤的衰老程度，这种判断皮肤衰老程度的方法不能从根源上找到导致皮肤衰老的内在因素，无法在皮肤老化外在表现出现前提前干预皮肤衰老，另外正确判断皮肤的衰老程度以及判断衰老的生理年龄是否与实际年龄相符，也是美容或者医学美容的前提。

肝珠蛋白(haptoglobin，Hp)是结合游离血红蛋白并保护组织免受氧化损伤的血浆蛋白，2010年文章中(意大利中部人群)(PMID：21147083)可以清除游离的细胞毒性血红蛋白，并在血管外组织中具有抗炎和免疫调节功能。可能是研究预期寿命的优秀候选基因。HP是一种有效的抗氧化剂，可清除急性期积累的无毒血红蛋白和炎症反应。HP还可以在血管外组织和体液中发挥直接的血管生成，抗炎和免疫调节功能。实际上，HP能够响应各种刺激而迁移穿过血管壁，并在不同的组织中表达。此外，HP可以从中性粒细胞粒细胞的以下部位释放，损伤或发炎并局部减轻组织损伤。HP受体包括在单核巨噬细胞上表达的 CD163系统和CD11b(CR3)存在于粒细胞，自然杀伤细胞和在小淋巴细胞亚群中。HP还被证明可以直接与大多数CD4+和CD8+T淋巴细胞结合抑制它们的增殖并修饰T辅助(Th)Th1/Th2平衡。

目前没有将肝珠蛋白(haptoglobin，Hp)用于辅助判断皮肤衰老程度的先例。

发明内容

本发明的目的是提供HP(肝珠蛋白)(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)在辅助判断衰老程度中的应用。

本发明提供了用于检测HP(肝珠蛋白)含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为辅助判断衰老程度。

本发明提供了用于检测HP(肝珠蛋白)含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为辅助判断皮肤衰老程度。

所述用于检测HP(肝珠蛋白)含量的物质具体可为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；更具体可为轨道阱高分辨率质谱仪。

所述用于检测HP(肝珠蛋白)含量的物质还包括从皮肤表面取样所用的物质。

以上任一所述应用中，所述产品为试剂盒或芯片。

本发明还保护一种产品，包括用于检测HP(肝珠蛋白)含量的物质；所述产品的功能为如下(a)或(b)：

(a)辅助判断衰老程度；

(b)辅助判断皮肤衰老程度。

所述产品中，所述用于检测HP(肝珠蛋白)含量的物质具体可为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；更具体可为轨道阱高分辨率质谱仪。

所述产品中，所述用于检测HP(肝珠蛋白)含量的物质还包括从皮肤表面取样所用的物质。

所述产品还包括记载有如下检测方法的载体：

1)取受试者表皮皮肤样本；

2)检测所得受试者皮肤样本中HP(肝珠蛋白)含量；

3)将步骤2)测得的HP(肝珠蛋白)含量与该年龄段正常衰老的人员皮肤中的 HP含量值进行比较，根据比较结果，判断受试者的皮肤衰老程度。

还可进一步包括4)将步骤2)测得的HP(肝珠蛋白)含量与各年龄段正常衰老的人员皮肤中的HP含量标准曲线进行比较，根据比较结果，判断受试者皮肤的生理年龄，

若受试者的皮肤衰老程度较快，或受试者皮肤生理年龄大于其实际年龄，则采用相应的干预措施，延缓皮肤衰老，达到美容的效果。

本发明还提供一种辅助判断衰老程度的系统。

本发明所提供的辅助判断衰老程度的系统，可包括如下模块：

(1)数据接收模块；所述数据接收模块被配置为接收受试者皮肤样本中HP(肝珠蛋白)含量数据；

(2)数据存储模块：所述数据存储模块被配置为存储与受试者年龄段一致的正常衰老的人员皮肤中的HP含量数据或所述数据存储模块被配置为存储各年龄段正常衰老的人员皮肤中的HP含量标准曲线；

(3)数据比较模块：所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中HP(肝珠蛋白)含量数据与数据存储模块中存储的与受试者年龄段一致的正常衰老的人员皮肤中的HP含量数据进行比较；或所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中HP(肝珠蛋白)含量数据与数据存储模块中存储的各年龄段正常衰老的人员皮肤中的HP含量标准曲线进行比较；

(4)判断模块；所述判断模块被配置为接收由所述数据比较模块发送的比较结果，并对比较结果进行判定，判定受试者的皮肤衰老程度，或判定受试者皮肤生理年龄是否大于其实际年龄，并输出判定结果。

上述辅助判断衰老程度的系统还进一步包括检测受试者皮肤样本中HP(肝珠蛋白)含量的仪器，所述仪器具体可为轨道阱高分辨率质谱仪；

上述辅助判断衰老程度的系统还进一步包括用于获取受试者表皮皮肤样本的物质。具体说，该物质为胶贴，更具体地，该胶贴可以为3M胶。

本发明提供的辅助判断皮肤衰老程度的方法，包括以下步骤：

1)用胶贴贴在皮肤表面，然后撕下，获得受试者表皮皮肤样本；该步骤具体为用3M胶贴在受试者前臂曲侧部位，然后轻轻撕下胶贴，保证不对受试者皮肤造成伤害，仅仅沾下受试者皮肤表面的脱落层；

2)检测所得受试者皮肤样本中肝珠蛋白含量；

3)将步骤2)测得的肝珠蛋白含量与受试者年龄相同的正常人皮肤中的HP含量值进行比较，根据比较结果，判断受试者的皮肤衰老程度；

或4)将步骤2)测得的肝珠蛋白含量与各年龄段正常人皮肤中的HP含量标准曲线进行比较，根据比较结果，判断受试者皮肤的生理年龄；

受试者皮肤中HP含量低于正常人皮肤中HP含量的，判定受试者皮肤的生理年龄比实际年龄年老；受试者皮肤中HP含量高于正常人皮肤中HP含量的，判定受试者皮肤的生理年龄比实际年龄年轻。

本发明还提供一种无创获得皮肤中肝珠蛋白的方法，包括：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT 在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品。

本发明进一步提供一种表皮皮肤样本中肝珠蛋白基于质谱的相对含量的测定方法，包括如下步骤：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT 在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品；

(3)检测

将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样；通过UHPLC进行分离；样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装 C18柱串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行：

分离：0-5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5-160min，流动相B从5％线性升至35％；160-170min，流动相B从35％升至80％；170-175min，80％流动相B； 176-180min，5％流动相B；纳升液相分离末端直接连接质谱仪；

DDA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为60,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率15,000。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s；AGC 设置为：一级3E6，二级1E5；

DIA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120,000；将350-1500Da均分为40个窗口进行碎裂及信号采集；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s；AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

本发明通过检测皮肤中HP含量，辅助判断皮肤衰老程度，从根源上找到导致皮肤衰老的内在因素，在皮肤老化外在表现出现前提前干预皮肤衰老，另外可以正确判断皮肤的衰老程度以及判断衰老的生理年龄是否与实际年龄相符，为美容或者医学美容提供参考和方向。该方法简单易行，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1为检测得到的HP的特征肽段(SPVGVQPILNEHTFCAGMSK)的质谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供HP(肝珠蛋白)在辅助判断衰老程度中的应用。

本发明提供了用于检测HP(肝珠蛋白)含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为辅助判断衰老程度。

本发明提供了用于检测HP(肝珠蛋白)含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为辅助判断皮肤衰老程度。

所述用于检测HP(肝珠蛋白)含量的物质具体可为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；更具体可为轨道阱高分辨率质谱仪。

所述用于检测HP(肝珠蛋白)含量的物质还包括从皮肤表面取样所用的物质。

以上任一所述应用中，所述产品为试剂盒或芯片。

本发明还保护一种产品，包括用于检测HP(肝珠蛋白)含量的物质；所述产品的功能为如下(a)或(b)：

(a)辅助判断衰老程度；

(b)辅助判断皮肤衰老程度。

所述产品中，所述用于检测HP(肝珠蛋白)含量的物质具体可为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；更具体可为轨道阱高分辨率质谱仪。

所述产品中，所述用于检测HP(肝珠蛋白)含量的物质还包括从皮肤表面取样所用的物质。

所述产品还包括记载有如下检测方法的载体：

1)取受试者皮肤样本；

2)检测所得受试者皮肤样本中HP(肝珠蛋白)含量；

3)将步骤2)测得的HP(肝珠蛋白)含量与该年龄段正常衰老的人员皮肤中的 HP含量值进行比较，根据比较结果，辅助判断受试者的皮肤衰老程度。

还可进一步包括4)将步骤2)测得的HP(肝珠蛋白)含量与各年龄段正常衰老的人员皮肤中的HP含量标准曲线进行比较，根据比较结果，判断受试者皮肤的生理年龄，

若受试者的皮肤衰老程度较快，或受试者皮肤生理年龄大于其实际年龄，则采用相应的干预措施，延缓皮肤衰老，达到美容的效果。

本发明还提供一种辅助判断衰老程度的系统。

本发明所提供的辅助判断衰老程度的系统，可包括如下模块：

(1)数据接收模块；所述数据接收模块被配置为接收受试者皮肤样本中HP(肝珠蛋白)含量数据；

(2)数据存储模块：所述数据存储模块被配置为存储与受试者年龄段一致的正常衰老的人员皮肤中的HP含量数据或所述数据存储模块被配置为存储各年龄段正常衰老的人员皮肤中的HP含量标准曲线；

(3)数据比较模块：所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中HP(肝珠蛋白)含量数据与数据存储模块中存储的与受试者年龄段一致的正常衰老的人员皮肤中的HP含量数据进行比较；或所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中HP(肝珠蛋白)含量数据与数据存储模块中存储的各年龄段正常衰老的人员皮肤中的HP含量标准曲线进行比较；

(4)判断模块；所述判断模块被配置为接收由所述数据比较模块发送的比较结果，并对比较结果进行判定，判定受试者的皮肤衰老程度，或判定受试者皮肤生理年龄是否大于其实际年龄，并输出判定结果。

上述辅助判断衰老程度的系统还进一步包括检测受试者皮肤样本中HP(肝珠蛋白)含量的仪器，所述仪器具体可为轨道阱高分辨率质谱仪；

上述辅助判断衰老程度的系统还进一步包括用于获取受试者皮肤样本的物质。

实施例

以生活环境比较接近、身体健康的人群为样本，无创法进行前臂曲侧部位皮肤样本取样(用3M胶粘皮取样)。

本发明对受试者皮肤样本中不同蛋白质含量的测定方法，按照如下步骤：

(1)高效液相

样品的获得：将3M医用胶贴贴于受试者前臂曲侧部位，排除光老化因素。(3M 医用胶贴为2.4cm，生产厂家：3M Health Care 3M Brookings.)，1分钟后，轻轻揭下 3M胶贴，保证受试者的皮肤没有损伤，得到胶带状皮肤样品；

(1)将胶带状皮肤样品切成小块(0.5x0.5厘米)用无菌刀片并沉积在玻璃板上再转移到1.5毫升离心管内；(2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟。然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜； (3)在25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM DTT处理在56℃的水浴中放置1小时；(4)然后用55mMIAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液。蛋白质浓度使用 Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控(包括蛋白提取是否充分，有无降解及定量预估)。为了进行蛋白水解，每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时(蛋白质：酶之比＝40：1)。随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时。水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品；

将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样。通过Thermo公司UltiMate 3000UHPLC进行分离。样品首先进入trap 柱富集并除盐，随后与自装C18柱(150μm内径，1.8μm柱料粒径，25cm柱长)串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行：

分离：0-5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5-160min，流动相B从5％线性升至35％；160-170min，流动相B从35％升至80％；170-175min，80％流动相B； 176-180min，5％流动相B。纳升液相分离末端直接连接质谱仪。

(2)DDA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF(Thermo Fisher Scientific，San Jose,CA)进行DDA(data-dependent acquisition)模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为60,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率15,000。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子。离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间设定为30s。AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

(3)DIA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)进行DIA(data-independent acquisition)模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120,000；将350-1500Da均分为40个窗口进行碎裂及信号采集。离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间设定为30s。AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

图1为检测得到的HP的特征肽段(SPVGVQPILNEHTFCAGMSK)的质谱图。

受试者皮肤样本中HP(肝珠蛋白)相对含量数据如下：

由上表中数据可以看出，随着年龄的增长，受试者皮肤样本中HP(肝珠蛋白)相对含量减少。

在实际应用中，首先采集数量上有统计学意义的各个年龄正常人的皮肤为样本，分别测定各皮肤样本中HP相对含量，绘制年龄-HP相对含量标准曲线，再测定受试者皮肤样本中的HP相对含量，与标准曲线比较，判定受试者的皮肤衰老程度，即可。也可以是对某个特定年龄的人群进行操作。比如要为某个城市中55岁的人群进行服务，那么首先采集数量上有统计学意义的这个城市生活的55岁正常人的皮肤样本，测定各皮肤样本中HP相对含量，并且取得平均值。这个平均值，就是一个衡量受试者皮肤衰老程度的阈值，当有受试者来进行评估的时候，采用与获得阈值相同的方法测量去皮肤中HP的含量，当HP的含量低于阈值的时候，说明该受试者皮肤的生理年龄比实际年龄年老；受试者皮肤中HP含量高于阈值的时候，判定受试者皮肤的生理年龄比实际年龄年轻。

至于说怎样测量皮肤中HP的含量，除了本实施例中质谱的方法以外，其余的任何能够测定蛋白的绝对和相对含量的方法，比如抗原抗体结合法等，都是可以的，并且应受到本发明的保护。

除了皮肤以外，HP的含量，也可作为辅助判断人整体衰老程度的指标。

Gene:HP

Protein:Haptoglobin,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

MSALGAVIALLLWGQLFAVDSGNDVTDIADDGCPKPPEIAHGYVEHSVRYQCKNYYKLRT EGDGVYTLNDKKQWINKAVGDKLPECEADDGCPKPPEIAHGYVEHSVRYQCKNYYKLRTE GDGVYTLNNEKQWINKAVGDKLPECEAVCGKPKNPANPVQRILGGHLDAKGSFPWQAKMV SHHNLTTGATLINEQWLLTTAKNLFLNHSENATAKDIAPTLTLYVGKKQLVEIEKVVLHP NYSQVDIGLIKLKQKVSVNERVMPICLPSKDYAEVGRVGYVSGWGRNANFKFTDHLKYVM LPVADQDQCIRHYEGSTVPEKKTPKSPVGVQPILNEHTFCAGMSKYQEDTCYGDAGSAFA VHDLEEDTWYATGILSFDKSCAVAEYGVYVKVTSIQDWVQKTIAEN 。

SEQUENCE LISTING

<110> 杨森

<120> 一种皮肤年轻化蛋白标志物—HP蛋白及其无创性提取方法

<130> GNCAQ211031

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ser Ala Leu Gly Ala Val Ile Ala Leu Leu Leu Trp Gly Gln Leu

1 5 10 15

Phe Ala Val Asp Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ala Asp Asp Gly

20 25 30

Cys Pro Lys Pro Pro Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val

35 40 45

Arg Tyr Gln Cys Lys Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly

50 55 60

Val Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly

65 70 75 80

Asp Lys Leu Pro Glu Cys Glu Ala Asp Asp Gly Cys Pro Lys Pro Pro

85 90 95

Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val Arg Tyr Gln Cys Lys

100 105 110

Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val Tyr Thr Leu Asn

115 120 125

Asn Glu Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly Asp Lys Leu Pro Glu

130 135 140

Cys Glu Ala Val Cys Gly Lys Pro Lys Asn Pro Ala Asn Pro Val Gln

145 150 155 160

Arg Ile Leu Gly Gly His Leu Asp Ala Lys Gly Ser Phe Pro Trp Gln

165 170 175

Ala Lys Met Val Ser His His Asn Leu Thr Thr Gly Ala Thr Leu Ile

180 185 190

Asn Glu Gln Trp Leu Leu Thr Thr Ala Lys Asn Leu Phe Leu Asn His

195 200 205

Ser Glu Asn Ala Thr Ala Lys Asp Ile Ala Pro Thr Leu Thr Leu Tyr

210 215 220

Val Gly Lys Lys Gln Leu Val Glu Ile Glu Lys Val Val Leu His Pro

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Gln Val Asp Ile Gly Leu Ile Lys Leu Lys Gln Lys Val

245 250 255

Ser Val Asn Glu Arg Val Met Pro Ile Cys Leu Pro Ser Lys Asp Tyr

260 265 270

Ala Glu Val Gly Arg Val Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Asn Ala

275 280 285

Asn Phe Lys Phe Thr Asp His Leu Lys Tyr Val Met Leu Pro Val Ala

290 295 300

Asp Gln Asp Gln Cys Ile Arg His Tyr Glu Gly Ser Thr Val Pro Glu

305 310 315 320

Lys Lys Thr Pro Lys Ser Pro Val Gly Val Gln Pro Ile Leu Asn Glu

325 330 335

His Thr Phe Cys Ala Gly Met Ser Lys Tyr Gln Glu Asp Thr Cys Tyr

340 345 350

Gly Asp Ala Gly Ser Ala Phe Ala Val His Asp Leu Glu Glu Asp Thr

355 360 365

Trp Tyr Ala Thr Gly Ile Leu Ser Phe Asp Lys Ser Cys Ala Val Ala

370 375 380

Glu Tyr Gly Val Tyr Val Lys Val Thr Ser Ile Gln Asp Trp Val Gln

385 390 395 400

Lys Thr Ile Ala Glu Asn

405