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一种基于LNA修饰的环介导等温扩增LAMP技术及其在念珠菌快速检测中的应用

文献发布时间：2023-06-19 11:59:12

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于LNA修饰的LAMP技术及其在女性生殖道分泌物中念珠菌的快速检测中的应用。

背景技术

阴道酵母菌感染，也称为念珠菌性阴道炎和阴道鹅口疮，是由于念珠菌过度生长所致。这些酵母菌通常少量存在于阴道中。最常见的症状是阴道瘙痒，其他症状包括排尿时灼痛，浓厚的白带，症状往往在妇女临产前恶化。大约75％的女性在生命中的某个时刻至少感染一种阴道酵母菌，而近一半的女性至少感染了两种。大约5％的人一年内感染三种以上。这是继细菌性阴道病之后第二大最常见的阴道炎症原因。

虽然白色念珠菌是与阴道鹅口疮相关的最常见的酵母菌，但其他类型酵母菌的感染也会产生类似的症状。一项对370例经确认的阴道酵母菌感染患者的研究确定了以下类型的感染：白色念珠菌(85.7％)、非白色念珠菌(13.2％)、其它(1.1％)。非白色念珠菌常在复杂的阴道鹅口疮病例中发现，其中一线治疗无效。这些情况在免疫力低下的人中更可能发生。

目前，根据我国行业标准“SN/T 2801-2011；传染性念珠菌病检疫技术规范”中的指示，念珠菌性阴道炎和引导鹅口疮通常通过以下三种方式之一进行诊断：阴道湿式显微镜，微生物培养和抗原检测。这些传统的鉴定方法通常需要专业人员和较长的检测时间，并且易受人为因素影响，造成准确度不高等情况，不利于疾病的早期治疗。

环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isotherm amplification，LAMP)是Notomi T.于2000年开发等温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)和多对特异性引物，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下完成核酸扩增反应。其灵敏度高、特异性好，已成为业内共识。

为进一步提高检测的效率和准确性，本领域仍在寻找能够更快速、准确检测女性生殖道念珠菌的检测方法。

鉴于此，提出本发明。

发明内容

本申请的目的之一是寻求一种检测效率和检测准确性都显著提高的针对女性生殖道念珠菌的检测方法；

本申请的目的之二是寻求一种检测效率和检测准确性都显著提高的针对女性生殖道念珠菌检测的试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供了一种基于LNA修饰的环介导等温扩增LAMP技术，该技术将锁核酸(LNA)技术与环介导等温扩增LAMP技术进行组合，建立了用于女性生殖道念珠菌的核酸扩增试剂；利用该试剂可以在一个八连排反应管中扩增生殖道中常见的五种念珠菌，完成对白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌的多重实时荧光检测，实现对女性生殖道念珠菌的特异性区分检测。

具体的：本发明首先提供一种LAMP扩增引物和LNA-Loop引物组，所述LAMP扩增引物和LNA-Loop引物组包含序列如SEQ ID NO.1-30所示的序列。

进一步的，所述LAMP扩增引物和LNA-Loop引物序列的锁核酸修饰如下：

本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含上述的LAMP扩增引物和LNA-Loop引物组。

本发明还提供了一种念珠菌的快速检测试剂/试剂盒，所述试剂/试剂盒包含上述LAMP扩增引物和LNA-Loop引物组；

进一步的，所述核酸扩增试剂包含Bst聚合酶和缓冲液；

更进一步的，所述核酸扩增试剂包括水和如下终浓度的组分：所述核酸扩增试剂包括水和如下终浓度的组分：

优选的，所述核酸扩增试剂包括水和如下终浓度的组分：

进一步的，本发明所述的核酸扩增试剂中，各组分的浓度为工作浓度，在保存、运输的过程中，各组分的浓度可为工作浓度的2～100倍。各组分可以独立存在也可以混合存在，例如，所述核酸试剂包括酶、缓冲液、LAMP检测引物和LNA-Loop引物四个个独立存在的试剂。

进一步的，所述试剂或试剂盒中还可以包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌的核酸DNA等比混合物。

在一些实施方式中，所述试剂盒中包含上述核酸扩增试剂10μL，0.3mmol/L的环介导等温扩增外引物F3/B3各0.12μL；2.4mmol/L的环介导等温扩增内引物FIP/BIP各0.48μL；1.0mmol/L的LNA-Loop引物NLF/NLB各0.4μL；水补足25μL。

本发明还提供了一种女性生殖道分泌物中念珠菌的快速检测方法，所述方法是基于LNA修饰的环介导等温扩增LAMP技术进行检测，进一步的，是基于上述LAMP扩增引物和LNA-Loop引物组或利用上述试剂或试剂盒进行检测。

在一些实施方式中，在提取样品的核酸后，基于所述的核酸扩增试剂和LAMP扩增引物/LNA-Loop引物在荧光扩增检测仪器上进行扩增，根据实时荧光扩增曲线的S型曲线判断是否含有白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌。

进一步的，所述扩增体系包括：样品核酸5μL、上述核酸扩增试剂10μL、0.3mmol/L的环介导等温扩增外引物F3/B3各0.12μL；2.4mmol/L的环介导等温扩增内引物FIP/BIP各0.48μL；1.0mmol/L的LNA-Loop引物NLF/NLB各0.4μL；水补足25μL。

所述扩增条件为：

可以理解，上述念珠菌的快速检测方法中，检测的念珠菌可以来源于机体内或机体外环境；优选的，机体外环境包括各种外部环境或生境中的念珠菌，比如白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌；而机体内可以来源于体内各个组织中，优选的，来自女性生殖道分泌物等，比如白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌。

本发明还提供了一种上述LAMP扩增引物和LNA-Loop引物组在念珠菌的快速检测或制备念珠菌的快速检测试剂盒中的应用。

优选的，上述提及的念珠菌为女性生殖道分泌物中念珠菌。

更优选的，上述女性生殖道分泌物来自阴道拭子。

本发明至少具有以下几点优势：

(1)本发明提供了一种首次应用于念珠菌的快速检测的、新型的LNA修饰的环介导等温扩增LAMP技术。

(2)本发明通过引物体系的筛选优化，获得一套适于常见念珠菌的检测体系，基于该体系检测五种女性生殖道常见的念珠菌，结合荧光检测，使扩增结果可实时辨别，避免复杂传统检测手段，提高了检测效率。

(3)本发明所采用的经LNA修饰的环介导等温LAMP扩增引物及LNA-Loop引物定性试验的检测灵敏度可以达到10copy/μL，检测下限为10个拷贝每反应体系。

(4)本发明的引物体系可以实现对白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌的多重性检测，且检测结果高度特异。

(5)本发明操作简单，方便实用，适于产业推广。

附图说明

图1为CAL组LAMP扩增引物及未经LNA修饰的Loop引物扩增1000copy/μl的白色念珠菌核酸基因组DNA后的结果；

图2为Cgla组LAMP扩增引物及未经LNA修饰的Loop引物扩增1000copy/μl的光滑念珠菌核酸基因组DNA后的结果；

图3为Ctro组LAMP扩增引物及未经LNA修饰的Loop引物扩增1000copy/μl的热带念珠菌核酸基因组DNA后的结果；

图4为Cpa组LAMP扩增引物及未经LNA修饰的Loop引物扩增1000copy/μl的近平滑念珠菌核酸基因组DNA后的结果；

图5为Ckru组LAMP扩增引物及未经LNA修饰的Loop引物扩增1000copy/μl的克柔念珠菌核酸基因组DNA后的结果；

图6为CAL2组LAMP扩增引物及未经LNA修饰的Loop引物扩增1000copy/μl的白色念珠菌核酸基因组DNA后的结果；

图7为Cgla2组LAMP扩增引物及未经LNA修饰的Loop引物扩增1000copy/μl的光滑念珠菌核酸基因组DNA后的结果；

图8为Ctro2组LAMP扩增引物及未经LNA修饰的Loop引物扩增1000copy/μl的热带念珠菌核酸基因组DNA后的结果；

图9为Cpa2组LAMP扩增引物及未经LNA修饰的Loop引物扩增1000copy/μl的近平滑念珠菌核酸基因组DNA后的结果；

图10为Ckru2组LAMP扩增引物及未经LNA修饰的Loop引物扩增1000copy/μl的克柔念珠菌核酸基因组DNA后的结果；

图11为CAL3组LAMP扩增引物及未经LNA修饰的Loop引物扩增1000copy/μl的白色念珠菌核酸基因组DNA后的结果；

图12为Cgla3组LAMP扩增引物及未经LNA修饰的Loop引物扩增1000copy/μl的光滑念珠菌核酸基因组DNA后的结果；

图13为Ctro3组LAMP扩增引物及未经LNA修饰的Loop引物扩增1000copy/μl的热带念珠菌核酸基因组DNA后的结果；

图14为Cpa3组LAMP扩增引物及未经LNA修饰的Loop引物扩增1000copy/μl的近平滑念珠菌核酸基因组DNA后的结果；

图15为Ckru3组LAMP扩增引物及未经LNA修饰的Loop引物扩增1000copy/μl的克柔念珠菌核酸基因组DNA后的结果；

图16为Cal+N1组LAMP扩增引物及LNA-Loop引物扩增结果；

图17为Cal+N2组LAMP扩增引物及LNA-Loop引物扩增结果；

图18为Cgla+N1组LAMP扩增引物及LNA-Loop引物扩增结果；

图19为Cgla+N2组LAMP扩增引物及LNA-Loop引物扩增结果；

图20为Ctro+N1组LAMP扩增引物及LNA-Loop引物扩增结果；

图21为Ctro+N2组LAMP扩增引物及LNA-Loop引物扩增结果；

图22为Cpa+N1组LAMP扩增引物及LNA-Loop引物扩增结果；

图23为Cpa+N2组LAMP扩增引物及LNA-Loop引物扩增结果；

图24为Ckru+N1组LAMP扩增引物及LNA-Loop引物扩增结果；

图25为Ckru+N2组LAMP扩增引物及LNA-Loop引物扩增结果；

图26为实施例1确定的白色念珠菌的LAMP扩增引物及LNA-Loop引物扩增1000copy/μl、100copy/μl和10copy/μl的白色念珠菌核酸基因组DNA、光滑念珠菌核酸基因组DNA、热带念珠菌核酸基因组DNA、近平滑念珠菌基因组DNA和克柔念珠菌基因组DNA混合物后的结果:1000Copy/μl：19.2Cycles；100copy/μl：22.4Cycles；10copy/μl：24.2Cycles。

图27为实施例1确定的光滑念珠菌的LAMP扩增引物及LNA-Loop引物扩增1000copy/μl、100copy/μl和10copy/μl的白色念珠菌核酸基因组DNA、光滑念珠菌核酸基因组DNA、热带念珠菌核酸基因组DNA、近平滑念珠菌基因组DNA和克柔念珠菌基因组DNA混合物后的结果:1000Copy/μl：23.4Cycles；100copy/μl：26.4Cycles；10copy/μl：27.5Cycles。

图28为实施例1确定的热带念珠菌的LAMP扩增引物及LNA-Loop引物扩增1000copy/μl、100copy/μl和10copy/μl的白色念珠菌核酸基因组DNA、光滑念珠菌核酸基因组DNA、热带念珠菌核酸基因组DNA、近平滑念珠菌基因组DNA和克柔念珠菌基因组DNA混合物后的结果:1000Copy/μl：19.6Cycles；100copy/μl：23.4Cycles；10copy/μl：26.8Cycles。

图29为实施例1确定的近平滑念珠菌的LAMP扩增引物及LNA-Loop引物扩增1000copy/μl、100copy/μl和10copy/μl的白色念珠菌核酸基因组DNA、光滑念珠菌核酸基因组DNA、热带念珠菌核酸基因组DNA、近平滑念珠菌基因组DNA和克柔念珠菌基因组DNA混合物后的结果:1000Copy/μl：22.6Cycles；100copy/μl：25.7Cycles；10copy/μl：28.8Cycles。

图30为实施例1确定的克柔念珠菌的LAMP扩增引物及LNA-Loop引物扩增1000copy/μl、100copy/μl和10copy/μl的白色念珠菌核酸基因组DNA、光滑念珠菌核酸基因组DNA、热带念珠菌核酸基因组DNA、近平滑念珠菌基因组DNA和克柔念珠菌基因组DNA混合物后的结果:1000Copy/μl：23.6Cycles；100copy/μl：23.6Cycles；10copy/μl：27.5Cycles。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

定义

除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。

如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。

在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。

本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。

实施例1环介导等温扩增LAMP引物/LNA-Loop引物的设计及筛选

1、核酸扩增试剂的准备

Bst聚合酶中包括：1μL的5U/μL的Bst聚合酶；

缓冲液中包括：2μL的1M KCl；0.5μL的0.4M MgCl

2、LAMP扩增引物及LNA-Loop引物的设计

本发明首先根据GenBank上收录的白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌的标准序列，筛选确定种内保守、种间特异的序列区段，再根据确定的序列区段人工设计LAMP扩增引物及LNA-Loop引物序列，随后比较分析。具体的：针对靶序列设计检测白色念珠菌ITS1-5.8S-ITS2基因的LAMP扩增引物与LNA-Loop引物；针对靶序列设计检测光滑念珠菌ITS1-5.8S-ITS2基因的LAMP扩增引物与LNA-Loop引物；针对靶序列设计检测热带念珠菌ITS1-5.8S-ITS2基因的LAMP扩增引物与LNA-Loop引物；针对靶序列设计检测近平滑念珠菌ITS1-5.8S-ITS2基因的LAMP扩增引物与LNA-Loop引物；针对靶序列设计检测克柔念珠菌ITS1-5.8S-ITS2基因的LAMP扩增引物与LNA-Loop引物；初步设计的引物组的核苷酸序列列于表1。

表1检测女性生殖道分泌物念珠菌的LAMP扩增引物及Loop引物

上述表1中，编号1-6组成Cal组，编号7-12组成Cgla组，编号13-18组成Ctro组，编号19-24组成Cpa组，编号25-30Ckru组。上述表1中，编号31-36组成Cal2组，编号37-42Cgla2组，编号43-48组成Ctro2组，49-52组成Cpa2组，编号53-58组成Ckru2组，编号59-64组成Cal3组，编号65-70组成Cgla3组，编号71-76组成Ctro3组，77-82组成Cpa3组，编号83-88组成Ckru3组。

3、LAMP扩增引物及Loop引物的筛选

分别使用核酸浓度为1000copy/μl的白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌的基因组DNA对上述互相对应LAMP扩增引物及Loop引物进行筛选，反应条件为：

如图1、图6和图11所示，针对白色念珠菌的Cal组、Cal2组和Cal3组进行LAMP扩增检测，Cal组出峰时间最快，即Cal组检测白色念珠菌的速度最快，性能最优异。如图2、图7和图12所示，针对光滑念珠菌的Cgla组、Cgla2组和Cgla3组进行LAMP扩增检测，Cgla组出峰时间最快。如图3、图8和图13所示，针对热带念珠菌的Ctro组、Ctro2组和Ctro3组进行LAMP扩增检测，Ctro组出峰时间最快。如图4、图9和图14所示，针对近平滑念珠菌的Cpa组、Cpa2组和Cpa3组进行LAMP扩增检测，Cpa组出峰时间最快。如图5、图10和图15所示，针对克柔念珠菌的Ckru组、Ckru2组和Ckru3组进行LAMP扩增检测，Ckru组出峰时间最快。

选择Cal组、Cgla组、Ctro组、Cpa组和Ckru组作为初筛引物组，用于女性生殖道分泌物念珠菌的后续检测。

4、LNA-Loop引物复筛

本实施例基于初筛引物组中的Loop引物，以提高Loop引物的保守性、特异性和扩增效率为前提，对已筛选出的Loop引物进行LNA修饰，并与未经LNA修饰的LNA-Loop引物之间进行比较和分析。上述所有Loop引物及经LNA修饰的Loop引物均由中国生工公司合成。具体的修饰设计的LNA-Loop引物的核苷酸序列列于表2。

表2检测女性生殖道分泌物念珠菌的LNA-Loop引物

(注：N代表4种脱氧核酸核苷酸A、T、C、G，+N代表锁核酸修饰)

上述表2中，编号89/90和前述筛选的白色念珠菌LAMP扩增引物组成一个检测组；91/92和前述筛选的白色念珠菌LAMP扩增引物组成一个检测组；93/94和前述筛选的光滑念珠菌LAMP扩增引物组成一个检测组；95/96和前述筛选的光滑念珠菌LAMP扩增引物组成一个检测组；97/98和前述筛选的热带念珠菌LAMP扩增引物组成一个检测组；99/100和前述筛选的热带念珠菌LAMP扩增引物组成一个检测组；101/102和前述筛选的近平滑念珠菌LAMP扩增引物组成一个检测组；103/104和前述筛选的近平滑念珠菌LAMP扩增引物组成一个检测组；105/106和前述筛选的克柔念珠菌LAMP扩增引物组成一个检测组；107/108和前述筛选的克柔念珠菌LAMP扩增引物组成一个检测组。LAMP扩增检测对比结果如下：

从上述结果可以看出，经过LNA修饰的LNA-Loop引物进一步提高了出峰时间，而且+N1组都显著优于+N2组，最终确立本发明最终的引物/探针组合如下。

实施例2 LAMP扩增引物及LNA-Loop引物的性能验证

1、特异性验证

利用实施例1确立的Cal组引物组合SEQ ID NO.1-6、反应体系和检测方法，对1株白色念珠菌基因组DNA和4种其他念珠菌种进行荧光LAMP检测；利用实施例1确定的Cgla组引物组合SEQ ID NO.7-12、反应体系和检测方法，对1株光滑念珠菌基因组DNA和4种其他念珠菌种进行荧光LAMP检测；利用实施例1中得到的Ctro组引物组合SEQ ID NO.13-18、反应体系和检测方法，对1株热带念珠菌基因组DNA和4种其他念珠菌种进行荧光LAMP检测；利用实施例1中得到的Cpa组引物组合SEQ ID NO.19-24、反应体系和检测方法，对1株近平滑年柱苣基因组DNA和4种其他念珠菌种进行荧光LAMP检测；利用实施例1中得到的Ckru组引物组合SEQ ID NO.25-30、反应体系和检测方法，对1株克柔念珠菌基因组DNA和4种其他念珠菌种进行荧光LAMP检测；具体检测结果见表3。

表3、试验用菌种及荧光LAMP扩增检测结果

2、灵敏度验证

将白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌分别接种于YBD液体培养基中，37℃正常培养16h后，取培养的菌液1mL，按常规方法提取念珠菌的基因组DNA。采用NanoDrop2000C超微量分光光度计测定念珠菌基因组DNA浓度及纯度，并计算拷贝数。将白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌的基因组核酸DNA模板混合稀释至拷贝数终浓度分别为：a：1000copy/μl，b:100copy/μl，c:10copy/μl。最后使用本发明的环介导等温LAMP扩增引物及LNA-Loop引物检测方法对上述DNA模板进行测定。

结果表明，当含上述五种念珠菌的基因组核酸DNA拷贝数为10copy/μl时，检测白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌的反应阳性结果判读时间小于30Cycles，结果如图26-图30。可见本发明所采用的环介导等温LAMP扩增引物及LNA-Loop引物定性试验的检测灵敏度可以达到10copy/μL(DNA浓度)，即检测下限为10个拷贝每反应体系。

实施例3临床样本检测及效果对比

1、临床样本的收集及临床样本核酸基因组DNA的制备

收集500例妊娠16周女性的生殖道分泌物样本(即阴道拭子)，由北京妇产医院提供。临床样本的DNA提取：采用天根公司的磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP705)进行临床样本基因组DNA的提取。具体参考说明书中H的步骤进行操作。提取后的临床样本基因组DNA，采用NanoDrop2000C超微量分光光度计测定念珠菌基因组DNA浓度及纯度，并于-20℃冰箱保存备用。

2、LNA-LAMP对临床样本的检测鉴定

LNA-LAMP反应体系的配制与扩增条件：按照实施例1中的体系配制浓度，配制检测女性生殖道分泌物中念珠菌的反应体系，并按照实施例1中的反应条件对临床样本进行进行多重扩增检测，检测结果见表4。

3、对照方法1-表型生化方法对临床样本的检测鉴定

菌株分离培养：将标本接种于真菌平板及血平板中,于培养箱(28℃-35℃)中培养24-48h,挑取可疑菌落涂片,革兰染色后镜下观察,疑为酵母样真菌者,用血平板或真菌平板进行分离纯化。

念珠菌鉴定：分离出单个念珠菌菌落后，采用根据酶底物法的科玛嘉念珠菌显色培养基(海博生物，中国)，25-28℃培养48小时后，通过显色来区别不同念珠菌，如：白色念球菌显蓝绿色，热带念珠菌显蓝灰色或铁蓝色，光滑念珠菌显紫色，克柔念珠菌显粉色，其它念珠菌显白色，而细菌被抑制。

检测结果见表4。

4、对照方法2-基于ITS序列测定分析的临床样本检测鉴定

采用天根公司的磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP705)进行临床样本基因组DNA的提取。随后使用ITS通用型PCR扩增引物对临床样本进行扩增，并由上海生工生物工程技术服务有限公司完成PCR扩增产物的序列测定，测序结果通过NCBI网站的BLAST工具完成对序列结果的分析。检测结果见表4。

其中，ITS通用型LAMP扩增引物序列为：

正向PCR扩增引物：ITS3(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3')

反向PCR扩增引物：ITS4(5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3')

5、对照方法3-基于LNA-Taqman-多重荧光PCR技术

采用天根公司的磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP705)进行临床样本基因组DNA的提取。随后使用专利CN202110076817.7“一种LNA-Taqman-多重荧光PCR技术及其在念珠菌快速检测中的应用”中的方法，通过使用荧光定量PCR仪完成对上述临床样本的检测,检测结果见表4。

表4. 4种检测方法鉴定结果比较

5、临床样本检测结果的统计分析

基于统计分析软件“SPSS 22.0”的卡方检验统计，对上述临床样本检测结果进行统计分析，以P<0.005为差异有统计学意义。

500例妊娠满16周女性生殖道的分泌物样本经金标准的ITS序列测定法、LNA-TaqMan多重荧光PCR法、LNA-LAMP法和传统的表型生化方法分析后发现，288例临床样本中有念珠菌定殖，具体情况如下(见表5)：1)白色念珠菌168例、光滑念珠菌59例、热带念珠菌12例、近平滑念珠菌9例、克柔念珠菌3例；2)复合感染：白色念珠菌+光滑念珠菌26例、白色念珠菌+热带念珠菌7例、白色念珠菌+光滑+热带念珠菌4例。

以ITS序列测定结果为金标准，统计分析其它3种方法鉴定500例临床样本的准确性:

LNA-TaqMan多重荧光PCR法为98.4％，LNA-LAMP法为99.2％，表型生化方法为76.4；

3种方法对168例白色念珠菌定殖样本的鉴定准确性：LNA-TaqMan多重荧光PCR法为97.6％，LNA-LAMP法为99.4％，表型生化方法为80.95％；

对白色念珠菌以外的多种念珠菌的鉴定准确性：LNA-TaqMan多重荧光LAMP法为96.66％，LNA-LAMP法为97.5％，表型生化方法为25.0％。

表5. 4种检测方法的正确率比较

由此可以看出，本发明中提供的LNA-LAMP法的准确性高，与金标准法相比较，本发明的方法更加简易、快捷、并且具备实时多重特异性判定的能力。而表型生化方法虽然在临床中作为一种常见的检测手段，但由于表型的判定对于操作人员有较高的要求，导致其鉴定结果的主观性过强，在真实的结果判定时，容易出现错判或误判，且表型方法的检测时间过于漫长，并且灵敏度不高，这都限制了其在临川中对于病人病症的准确性判读，最终耽误病人的治疗。

以上对本申请具体实施方式的描述并不限制本申请，本领域技术人员可以根据本申请作出各种改变或变形，只要不脱离本申请的精神，均应属于本申请所附权利要求的范围。

序列表

<110> 中迅优检生物科技(江苏)有限公司

<120> 一种基于LNA修饰的环介导等温扩增LAMP技术及其在念珠菌快速检测中的应用

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA