一种一步法构建DNA纳米球的试剂盒和方法

技术领域

本发明属于高通量测序技术领域，具体涉及一种一步法构建DNA纳米球的试剂盒和方法。

背景技术

近年来快速发展的NGS技术因其不依赖于已知核酸序列，无需特殊探针设计，可直接对未知病原微生物进行检测，打破了传统微生物检验的局限性，在临床微生物领域展现了广阔的前景。

目前，全球感染性疾病的发病率有所上升，病原微生物呈现多样化和复杂化的发展趋势。重症急性呼吸综合征(SARS)、新型冠状病毒肺炎(NCP)、新变异型克雅病、H7N9禽流感等新发感染性疾病不断出现。而HIV、多重或广谱耐药的结核分枝杆菌、沙眼支原体等经典感染性疾病病原微生物又死灰复燃或出现新的致病特征。各种新发和再发的感染性疾病、不易发现的多重感染以及不明病因的发热等，都给人类健康带来了巨大的威胁，因此，临床上对感染性疾病诊断的准确性和时效性提出了更高的要求。

随着高通量测序在临床应用的辅助诊断重要性的提升，如何降低测序成本是一个很关键的问题。华大智造(MGI)不断推出更高测序通量的测序仪，测序成本不断降低，相继推出MGI-200、MGI-2000和T7测序仪，其中T7测序仪是目前市场上测序通量最高和测序成本最低的测序仪，使得华大智造的测序仪在市场上的应用越来越多。

MGI平台在上机测序之前需要进行DNA纳米球（DNANanoball，DNB）的制备。目前，制备DNA纳米球的流程（如图1）是先把dsDNA文库进行单链环化、酶切消化、磁珠纯化、变性退火、滚环扩增等过程，整个操作需要2小时以上，整个操作流程多、时间长。

鉴于临床上对时效性的迫切需求，因此，仍需要对现有技术进行改进，以改善现有流程多、时间长的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一步法构建DNA纳米球的试剂盒和方法，使得整个DNB制备的过程从2小时降低到0.5小时，大大地缩短了上机前的操作时间。

为实现上述目的，本发明的一个方面是提供一种一步法构建DNA纳米球的试剂盒，包括试剂R1、R2和R3，

所述R1包括DNB制备缓冲液；

所述R2包括DNB聚合酶缓冲液、DNB聚合酶混合液；

所述R3包括DNB终止缓冲液。

本发明的DNB制备缓冲液包括50-80mM乙酸钾、10-20mM乙酸镁、20-50mMTris-乙酸、0.1-0.3mg/mlBSA、1-10mMDTT、1-5μM寡聚核苷酸1、1-5μM寡聚核苷酸2、0.01-1μM寡聚核苷酸3、1-5μM寡聚核苷酸4。

优选的是，所述寡聚核苷酸1其序列如SEQIDNO.1所示：5´-GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG-3´；所述寡聚核苷酸2其序列如SEQIDNO.2所示：5´-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3´；所述寡聚核苷酸3其序列如SEQIDNO.3所示：5´-AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA-3´；所述寡聚核苷酸4其序列如SEQIDNO.4所示：5´-CAACTCCTTGGCTCACA-3´。

更优选的是，所述四个寡聚核苷酸的3´端最后两个核苷酸之间的连接键进行硫代磷酸化修饰。

本发明的DNB聚合酶缓冲液包括1-10mM乙酸钾、5-20mM乙酸镁、10-40mMTris-乙酸、0.1-0.3mg/mlBSA、1-5mMDTT、1-5mMATP和1-5mMdNTP。

本发明的DNB聚合酶混合液包括Phi29DNAPolymerase、T4DNALigase、焦磷酸酶和单链结合蛋白；

优选的是，所述单链结合蛋白可以是T4Gene32Protein、E.coliSSB其中的一种或者两种的组合。

本发明的一个实施例中，Phi29DNAPolymerase其工作浓度为0.1-1U/μl，T4DNALigase工作浓度为0.1-0.5U/μl，焦磷酸酶工作浓度为5-50ng/μl，T4Gene32Protein工作浓度为0.1-0.5U/ml，E.coliSSB工作浓度为0.1-0.5U/ml。

本发明所述DNB终止缓冲液包括EDTA，其浓度为100mM-500mM。

本发明的另一个方面是提供一种一步法构建DNA纳米球的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将构建好的dsDNA文库与所述DNB制备缓冲液充分混匀；

（2）经过高温变性及低温退火后，寡聚核苷酸结合在ssDNA文库上；

（3）退火产物与所述DNB聚合酶缓冲液、DNB聚合酶混合液轻轻吹打混匀；在低温下，ssDNA同时发生环化和滚环扩增；

（4）滚环扩增产物用DNB终止缓冲液终止，即得到测序用DNA纳米球。

本发明步骤（1）中所述DNB制备缓冲液，可以添加辅助蛋白，有利于增加DNB的产量。

本发明步骤（2）中的高温可以是95℃-99℃，例如可以是95℃、96℃、97℃、98℃、99℃。

本发明的一个实施例中，高温是95℃，作用时间是3min。

本发明步骤（2）中的低温可以是20℃-40℃，例如可以是20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。

本发明的一个实施例中，低温是40℃，作用时间是3min。

本发明步骤（2）中的寡聚核苷酸1其序列如前所述，其两端各12mer可以和ssDNA文库接头的两端互补配对，可以辅助单链DNA形成有缺口的双链结构，而这种结构更容易在连接酶的作用下连接成环。

寡聚核苷酸2、3、4其序列如前所述，这三个寡聚核苷酸其作用都是为了封闭成环单链的互补链，使成环单链更好的成环，环化率更高。

本发明步骤（3）中的DNB聚合酶混合液的几种蛋白质都可以在低温下同时发生作用而不互相干扰。

优选的是，本发明步骤（3）中反应的低温是30℃，作用时间25min。

本发明创造性地将T4DNALigase和Phi29DNAPolymerase放在一个反应中，使得单链环化和滚环扩增过程可以在同一个步骤中进行反应，且中间不用酶切消化和纯化，大大节省了操作步骤。另外，在体系中，还添加了三种寡聚核苷酸来封闭成环链的互补链，大大地提高了环化效率。添加的单链结合蛋白，有利于稳定滚环扩增出的单链结构。添加的焦磷酸酶会降解体系中生成的焦磷酸，有利于扩增反应的不断进行，从而增加了DNB产量。这样，就可以用少量滚环扩增酶而实现较好的效果。

本发明步骤（4）中使用DNB终止缓冲液来终止反应，而不用高温终止法，又可以在这一步上省去了一部分高温失活的时间。

本发明的技术效果和优点：

1、通过优化反应酶和反应体系，将单链环化和滚环扩增过程放在同一个步骤中进行，大大地节省了操作步骤；

2、通过优化反应体系，使ssDNA文库在进行环化后不用酶切消化和磁珠纯化，就可以同时进行滚环扩增，节省了1.5小时的操作时间；

3、利用寡聚核苷酸彻底封闭成环链的互补链，大大地提高了环化效率；

4、使用单链结合蛋白和焦磷酸酶，提高DNB产量的同时稳定了DNB结构。

附图说明

图1为本发明中的常规DNB制备的原理示意图；

图2为利用本发明的一步法制备DNB的原理示意图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的用法，下面将展示三个具体的实施例，从而将技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明中的部分定义：

高通量测序技术：又称为第二代测序技术、下一代测序技术，可简写为NGS。是指一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的技术。

DNA纳米球：是华大智造平台上，上机前把文库分子进行滚环扩增放大后形成的DNA团，简写成DNB。

单链环化：是指ssDNA分子在连接酶的作用下，前后两端连接成环的一种技术。

酶切消化：指的是在核酸内切酶和/或者核酸外切酶的作用下，dsDNA和/或者ssDNA分子被降解的过程。

磁珠纯化：指的是利用表面经过特殊修饰的生物磁珠来分离、纯化核酸的过程。

实施例一：

以一批临床送检宏基因组测序（mNGS）的实际样本为实验材料，先提取样本的核酸（DNA和/或RNA），再进行建库，最后构建可用于MGI平台上机测序的DNB。

具体实验步骤如下：

1. 样本核酸提取：本实施例中使用的DNA提取试剂盒为南京实践医学检验有限公司的体液样本微生物基因组DNA提取试剂盒（货号PMD101）、痰液/鼻腔分泌物样本微生物基因组DNA提取试剂盒（货号PMD102）和鼻咽拭子/肛拭子样本微生物基因组DNA提取试剂盒（货号PMD103）；RNA提取试剂盒为南京实践医学检验有限公司的体液样本微生物RNA提取试剂盒（货号PMD201）和鼻咽拭子/肛拭子样本微生物RNA提取试剂盒（货号PMD203）。

1.1DNA提取的具体的实验流程如下：

（1）样本处理：

A.血液：2100rpm离心5min，取600µl上清血浆到2.0ml的离心管内，标记离心管；

B.血浆、血清、脑脊液、肺泡灌洗液、胸水、腹水、眼房水、淋巴液等，取600µl样本到2.0ml的离心管内，标记离心管；

C.取300µl的痰液样本至干净的2.0ml的离心管中，加入等体积的缓冲液SD，涡旋混匀，瞬时离心后室温下静置20min；静置期间，将离心管涡旋混匀、离心三次；

D.干拭子：将拭子剪碎置于干净的2.0ml的离心管中，加入600µl的缓冲液SP，室温下静置20min；静置期间，将离心管涡旋混匀、离心三次；

E.湿拭子：拭子保存在液体中；若液体体积大于600µl，取出600µl液体置于新的2.0ml的离心管中，接着进行下一步；若液体体积小于600µl，用缓冲液SP补足到600µl后，直接进行下一步；

（2）不足600µl的样本加缓冲液ACL补足到到600µl；

（3）称取约0.2g玻璃珠于上述样本管中，最大转速混匀15min；12000rpm离心1min后，将全部上清转移至干净的2.0ml的离心管中，接着进行下一步；

（4）加入60µl裂解酶I和5µl裂解酶II，涡旋混匀，瞬时离心后37℃下孵育30min，孵育期间取出离心管涡旋混匀、离心三次；

（5）孵育完成后，加入40µl蛋白酶K和600µl缓冲液BCL，涡旋混匀，瞬时离心，56℃下孵育10min，孵育期间取出离心管涡旋混匀、离心一次；

（6）结束后，加入600µl无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀数次，室温下静置5min；简短离心以去除管盖内壁的液滴；

（7）将上一步所得溶液加到一个吸附柱CR2中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中；（吸附柱最大承载量700µl，分多次加载过滤）；

（8）全部过滤完后，向吸附柱CR2中加入500µl缓冲液WS1（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中；

（9）向吸附柱CR2中加入600µl漂洗液WS2（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中；

（10）再向吸附柱CR2中加入500µl漂洗液WS2（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中；

（11）12000rpm离心2min，倒掉废液；将吸附柱CR2开盖置于室温放置2-5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

（12）将吸附柱CR2转入一个干净的1.5ml离心管中，做好标记，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50µl洗脱缓冲液EB，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

1.2RNA提取的具体的实验流程如下：

（1）吸取560µl的裂解液RCL于1.5ml的离心管中，标记离心管，再加入5.6µl的CarrierRNA储存液；

（2）样本处理：

A.血液：2100rpm离心5min，取300µl上清血浆至上述的1.5ml的离心管内；

B.血浆、血清、脑脊液、肺泡灌洗液、胸水、腹水、眼房水、淋巴液等体液，直接取300µl样本至上述的1.5ml的离心管内；

C.干拭子：将拭子剪碎置于干净的1.5ml的离心管中，加入350µl的缓冲液SP，室温下静置20min。静置期间，将离心管涡旋混匀、离心三次；转移300µl上清与一新的1.5ml的离心管中并标记好；

D.湿拭子：若液体体积大于300µl，取出300µl液体置于新的1.5ml的离心管中，标记离心管后接着进行下一步；若液体体积小于300µl，用缓冲液SP补足到300µl后转移到新的1.5ml的离心管中，标记离心管后进行下一步；

（3）充分涡旋振荡混匀15sec，室温（15-25℃)下孵育10min；

（4）简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；

（5）加入560μl无水乙醇，盖上管盖并涡旋振荡15sec；

（6）简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；

（7）仔细将离心管中的630μl液体转移至RNase-Free吸附柱CR2（吸附柱放在收集管中），盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

（8）将剩余离心管中液体按步骤7再次过柱；

（9）小心打开吸附柱盖子，加入500μl缓冲液WS1（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管；

（10）小心打开吸附柱盖子，加入500μl漂洗液WSR（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管；

（11）小心打开吸附柱盖子，加入500μl漂洗液WSR（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），盖上管盖，12000rpm离心3min，弃废液，将吸附柱放回收集管；

（12）将吸附柱CR2转入一个干净的RNase-Free的1.5ml离心管中，打开离心柱的管盖，室温晾干1min；向吸附膜中间位置悬空滴加30µlRNase-FreeddH

（13）8000rpm离心1min，将RNA溶液收集到离心管中。

1.3各个样本信息及核酸浓度

2. 核酸样本建库：本实施例中使用的DNA建库试剂盒为南京实践医学检验有限公司的OneShotMaxDNALibPrepKitforMGI（货号PDM601）；rRNA去除用的是南京实践医学检验有限公司的rRNAdepletionkit（货号PR301）；RNA建库用的是南京实践医学检验有限公司的TotalRNA-seqLibraryPrepKitforMGI（货号PDR803）。

2.1DNA建库的具体流程如下：

（1）将FragEnzymeMix、ERAEnzymeMix取出，解冻并手指轻弹混匀，不可涡旋，FEAReactionBuffer解冻并混匀；所有试剂短暂离心收集至管底，置于冰上备用；

（2）按照下表设置PCR仪，热盖温度设置为80度；开始程序，等温度达到4度后按暂停；

（3）将放置在冰上包含样本DNA的离心管中按照下表所示配置反应体系：

（4）使用移液器轻柔吹打混匀10-15次，注意冰上操作，不要旋涡震荡；

（5）短暂离心至管底后马上转移到已经预冷的PCR仪中，点击Resume重新运行程序；

（6）程序运行至最后4°CHold步骤时，从PCR仪上取下管子。取出LigationBuffer、DNAAdapterX和DNALigase，按照下表所示，配置接头连接的反应体系：

使用移液器轻柔吹打混匀10-15次，并短暂离心收集至管底；

注：接头使用量请参照下表

（7）放置于PCR仪上执行以下程序：

（8）结束后加入64μl的磁珠（确保在室温平衡30min以上）混合均匀；

（9）室温放置5min，注意此时不要放在磁力架上；

（10）放置于磁力架上静置澄清后弃上清液；

（11）加入200μl的80%乙醇，静置30sec后弃上清；

（12）加入200μl的80%乙醇，静置30sec后弃上清；

（13）快速离心后用10μl的移液器弃去残余乙醇，室温放置，晾干；

（14）从磁力架上取下管子，加入21.5μl的无核酸酶水重悬磁珠，充分混合均匀，室温放置2min，快速离心5sec放置于磁力架上2min，取20μl上清转移至新的PCR管中，切勿触碰磁珠；

（15）将PCRPrimerMixforMGI、HiFiAmplificationMix解冻后颠倒混匀，短暂离心收集至管底，于干净的PCR管中配制如下反应：

（16）使用移液器轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，并短暂离心将反应液收集至管底；

（17）执行如下PCR反应：

如上表；

（18）结束后加入32.5μl的磁珠至上述的50μlPCR产物中，混合均匀；

（19）室温放置5min，注意此时不要放在磁力架上；

（20）放置于磁力架上静置澄清后，把上清液转移到干净的PCR管中，丢弃磁珠；

（21）加入25μl的磁珠至上述的上清中，混合均匀；

（22）室温放置5min，注意此时不要放在磁力架上；

（23）放置于磁力架上静置澄清后弃上清液；

（24）加入200μl的80%乙醇，静置30sec后弃上清；

（25）加入200μl的80%乙醇，静置30sec后弃上清；

（26）快速离心后用10μl的移液器弃去残余乙醇，室温放置，晾干；

（27）从磁力架上取下管子，加入20μl的无核酸酶水重悬磁珠，充分混合均匀，室温静置2min，快速离心5sec放置于磁力架上2min，取上清转移至新的PCR管中，切勿触碰磁珠。

2.2rRNA去除的具体流程如下：

（1）RNA样品与探针杂交：

a.在一个无核酸酶的PCR管中配制如下反应体系：

用移液器轻轻吹打混匀；

b.瞬时离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中，按以下程序操作：

c.瞬时离心将样品收集至管底，并置于冰上，立即进入下步操作；

（2）RNaseH消化：

a.在冰上制备如下反应液：

用移液器轻轻吹打混匀；

b.瞬时离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中，37℃反应30min；

c.瞬时离心将样品收集至管底，并置于冰上，立即进入下步操作；

（3）DNaseI消化:

a.在冰上制备如下反应液：

用移液器轻轻吹打混匀；

b.瞬时离心将样品收集至管底，将样品置于PCR仪中，37°C反应30min；

c.瞬时离心将样品收集至管底，并置于冰上，立即进入下步操作；

（4）使用RNACleanBeads纯化Ribosomal-depletedRNA

a.涡旋振荡混匀RNACleanBeads（确保在室温平衡30分钟以上），吸取66μl(2.2×)至上步RNA样品中，使用移液器吹打10次以彻底混匀；

b.冰上静置15min，使RNA结合到磁珠上；

c.将样品置于磁力架5min，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；

d.保持样品始终处于磁力架中，加入200μl无核酸酶水新鲜配置的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec后，小心移除上清；

e.重复步骤d一次；

f.保持样品始终处于磁力架中，在室温下开盖干燥磁珠；

g.将样品从磁力架上取出，加入9μl无核酸酶水，用移液器吹打6次以充分混匀，室温静置2min，在磁力架上静置5min，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取8.5μl上清至一个新的无核酸酶离心管中。 2.3RNA建库的具体流程如下：

（1）将2xFragbuffer、1stbuffer从冰箱中拿出冰上解冻，上下颠倒混匀，短暂离心收集于管底，并放置在冰上备用；预热PCR仪温度于94℃并保持；

（2）往RNA管中加入2xFragbuffer8.5μl，充分吸打混匀，注意冰上操作，混匀后转移至PCR仪中，执行如下程序：

（3）结束后立即置于冰上，RNA在该体系中不稳定，立即进行下一步操作；

（4）冰上配置一链cDNA合成反应体系：

使用移液器轻轻吸打10次充分混匀；

（5）在PCR仪中运行如下程序，进行第一链cDNA合成：

结束后立刻进行第二链cDNA合成反应；

（6）将2ndbuffer从-20℃取出，解冻后颠倒混匀，配制二链cDNA合成反应体系：

使用移液器轻轻吸打10次充分混匀；

（7）在PCR仪中运行如下程序，进行二链cDNA合成反应：

（8）反应结束后，取出LigationBuffer、RNAAdapterX和DNALigase，按照下表所示，配置接头连接的反应体系：

注：接头使用量请参照下表

（9）充分吸打混匀，放置于PCR仪上执行以下程序：

（10）结束后加入64μl的AMPure磁珠（确保在室温平衡30分钟以上）混合均匀；

（11）室温放置10min，注意此时不要放在磁力架上；

（12）放置于磁力架上静置澄清后弃上清液；

（13）加入200μl的80%乙醇，静置30秒后弃上清；

（14）加入200μl的80%乙醇，静置30秒后弃上清；

（15）快速离心后用移液器弃去残余乙醇，室温放置2分钟晾干；

（16）从磁力架上取下管子，加入21μl的无核酸酶水重悬磁珠，Vortex混合均匀，室温放置2分钟，快速离心5秒放置于磁力架上2分钟，取20μl上清转移至新的PCR管中，切勿触碰磁珠；

（17）将PCRPrimerMix2forMGI、HiFiAmplificationMix解冻后颠倒混匀，短暂离心收集至管底，于干净的PCR管中配制如下反应：

（18）使用移液器轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，并短暂离心将反应液收集至管底；执行如下PCR反应：

如上表；

（19）结束后加入32.5μl的磁珠至上述的PCR产物中，混合均匀；

（20）室温放置5min，注意此时不要放在磁力架上；

（21）放置于磁力架上静置澄清后，把上清液转移到干净的PCR管中，丢弃磁珠；

（22）加入25μl的磁珠至上述的上清中，混合均匀；

（23）室温放置5min，注意此时不要放在磁力架上；

（24）放置于磁力架上静置澄清后弃上清液；

（25）加入200μl的80%乙醇，静置30sec后弃上清；

（26）加入200μl的80%乙醇，静置30sec后弃上清；

（27）快速离心后用10μl的移液器弃去残余乙醇，室温放置，晾干；

（28）从磁力架上取下管子，加入20μl的无核酸酶水重悬磁珠，充分混合均匀，室温静置2min，快速离心5sec放置于磁力架上2min，取上清转移至新的PCR管中，切勿触碰磁珠。

2.4各样本的文库浓度及总量

如上表。

3.DNB制备

3.1文库要求

初始文库dsDNA总量要求为120fmol，不同的文库可以混合制备DNB，总文库进入量满足要求即可。

3.2试剂准备

取出文库、TE缓冲液、DNB制备缓冲液、DNB聚合酶缓冲液和DNB终止缓冲液，置于冰盒上约0.5h，待融化后，使用漩涡振荡器震荡混匀5s后，短暂离心置于冰盒上备用。

3.3制备过程

（1）pool样：取用0.2mL八连管或PCR管，在冰上配制；每个文库进入量为12fmol，10个文库混合在一起，体积为3μl；体系按如下配制：

其中，DNB制备缓冲液组分为50mM乙酸钾、10mM乙酸镁、20mMTris-乙酸、0.1mg/mlBSA、1mMDTT、1μM寡聚核苷酸1、1μM寡聚核苷酸2、0.01μM寡聚核苷酸3、1μM寡聚核苷酸4；

（2）将反应Mix用漩涡振荡器震荡混匀，迷你离心机离心5s，置于PCR仪中反应，反应条件见下表：

（3）取出DNB聚合酶混合液置于冰盒上，短暂离心5s，置于冰盒上备用；

（4）当PCR仪达到4℃后取出PCR管，迷你离心机离心5s后，在冰上加入如下组份：

其中，DNB聚合酶缓冲液组分为1mM乙酸钾、5mM乙酸镁、10mMTris-乙酸、0.1mg/mlBSA、1mMDTT、1mMATP和1mMdNTP；

DNB聚合酶混合液各组分的工作浓度为0.1U/μlPhi29DNAPolymerase，0.1U/μlT4DNALigase，5ng/μl焦磷酸酶，0.1U/mlT4Gene32Protein；

（5）反应Mix用移液器轻轻吹打混匀，迷你离心机离心5s，即刻置于PCR仪中，反应条件如下：

（6）当PCR仪温度达到4℃后立即加入20µLDNB终止缓冲液，用阔口吸头缓慢地吹打混匀5-8次，切勿震荡及剧烈吹打；

其中，DNB终止缓冲液中EDTA浓度为100mM。

4.DNB浓度测定

DNB制备完成后，用Qubit®ssDNAAssayKit仪器进行浓度检测。浓度8ng/μL以上为合格，浓度不合格的需重新制备。经测得，DNB浓度为17.6ng/μl。

5. 上机测序

利用华大智造的MGISEQ-200RS高通量测序试剂套装（FCLSE50）和MGISEQ-200RS测序载片（FCL）对制备好的文库进行测序；测序结果如下：

从这个结果可以看出，用本发明构建的DNB，上机后数据产出很好，500M的芯片产出了593.8M，芯片的利用率达到71.6%，而且拆分率94.2%。具体到每个样本，其数据信息如下：

从每个样本的数据信息可看出，每个样本数据产出都很好，Q30都在87%以上。说明，本发明所述的一步法构建的DNB完全可以替代常规的环化再制备DNB的操作。

实施例二：

样本：另外一批临床送检宏基因组测序（mNGS）的实际样本。

与实施例一不同的是，DNB制备过程中的DNB制备缓冲液组分为80mM乙酸钾、20mM乙酸镁、50mMTris-乙酸、0.3mg/mlBSA、10mMDTT、5μM寡聚核苷酸1、5μM寡聚核苷酸2、1μM寡聚核苷酸3、5μM寡聚核苷酸4；

DNB聚合酶缓冲液组分为10mM乙酸钾、20mM乙酸镁、40mMTris-乙酸、0.3mg/mlBSA、5mMDTT、5mMATP和5mMdNTP；

DNB聚合酶混合液各组分的工作浓度为1U/μlPhi29DNAPolymerase，0.5U/μlT4DNALigase，50ng/μl焦磷酸酶，0.5U/mlT4Gene32Protein；

DNB终止缓冲液中EDTA浓度为500mM；

其余均与实施例一相同，各个样本信息如下：

利用本发明的方法构建DNB，其浓度为15.6ng/μl。

同样，利用华大智造的MGISEQ-200RS高通量测序试剂套装（FCLSE50）和MGISEQ-200RS测序载片（FCL）对文库进行测序。测序结果如下：

从这个结果可以看出，用本发明构建的DNB，上机后数据产出也很好，500M的芯片产出了615.4M，芯片的利用率达到69.7%，拆分率95.1%。具体到每个样本，其数据信息如下：

从每个样本的数据信息可看出，每个样本数据产出都很好，Q30都在87%以上。进一步说明，本发明所述的一步法构建的DNB进行后续的测序完全没有问题。

实施例三：

样本：另外一批临床送检宏基因组测序（mNGS）的实际样本。

与实施例一和例二不同的是，DNB制备过程中的DNB制备缓冲液组分为60mM乙酸钾、15mM乙酸镁、30mMTris-乙酸、0.2mg/mlBSA、4mMDTT、2.5μM寡聚核苷酸1、2μM寡聚核苷酸2、0.03μM寡聚核苷酸3、2μM寡聚核苷酸4；

DNB聚合酶缓冲液组分为5mM乙酸钾、10mM乙酸镁、20mMTris-乙酸、0.2mg/mlBSA、4mMDTT、2mMATP和2mMdNTP；

DNB聚合酶混合液各组分的工作浓度为0.2U/μlPhi29DNAPolymerase，0.3U/μlT4DNALigase，10ng/μl焦磷酸酶，0.2U/mlT4Gene32Protein和0.2U/mlE.coliSSB。

DNB终止缓冲液中EDTA浓度为250mM；

其余均与实施例一、二相同，各个样本信息如下：

利用本发明的方法构建DNB，其浓度为24.6ng/μl。

同样，利用华大智造的MGISEQ-200RS高通量测序试剂套装（FCLSE50）和MGISEQ-200RS测序载片（FCL）对文库进行测序。测序结果如下：

从这个结果可以看出，用本发明构建的DNB，上机后数据产出也很好，500M的芯片产出了569.9M，芯片的利用率达到69.1%，拆分率95.4%。具体到每个样本，其数据信息如下：

从每个样本的数据信息可看出，每个样本数据产出都很好，Q30也都在87%以上。进一步说明，本发明所述的一步法构建的DNB质量很好，完全可以替代常规的环化再制备DNB的操作。

可见，本发明通过改进缓冲液体系和酶体系，创造性地将单链环化和滚环扩增过程放在一个步骤进行，且中间不用酶切消化和纯化，使得整个DNB制备的过程从2小时降低到0.5小时，大大地节省了操作步骤和时间，为临床医生和患者争取到了很宝贵的时间。可知，本发明是对现有技术的极大改进。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。