突变牛痘病毒及其用途

相关申请的交叉引用

本专利合作条约申请要求于2018年10月22日提交的美国临时专利申请号62/749,102和与2019年10月8日提交的美国临时专利申请号62/912,344的优先权的权益。参见发明内容中的进一步描述。

背景技术

溶瘤病毒特异性感染、复制和杀伤肿瘤细胞，而使正常细胞未受损。这种对转化细胞的偏好使溶瘤病毒成为开发新的癌症疗法的理想候选者。各种溶瘤病毒已通过直接(例如由于病毒复制和免疫介导的细胞毒性的细胞溶解)和间接机制(例如刺激旁观者细胞杀伤、诱导细胞毒性等)来利用他们的肿瘤特异性杀伤活性。溶瘤牛痘病毒(VV)是当前治疗选择的吸引人的补充，在动物模型和早期临床研究中证明了效力和安全性。除了直接感染和杀伤肿瘤细胞外，VV还可以诱导针对肿瘤抗原的T细胞应答，增加杀伤的效率。而在一些病毒中，这种对癌细胞的特异性是天然存在的(例如水泡性口炎病毒、呼肠孤病毒、腮腺炎病毒)，其他病毒可以经基因修饰以改善其肿瘤特异性以及降低其诱导抗病毒免疫应答的能力(例如腺病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎和牛痘病毒)。另外，这些病毒可以被工程化以表达通过募集天然杀伤细胞(NK)细胞和T细胞来增强抗肿瘤免疫力的基因。

然而，溶瘤病毒的效力由病毒诱导的强免疫应答阻碍。比如抗体的免疫因子通过直接结合病毒和防止细胞成功感染或者通过标记病毒由补体或其他免疫细胞破坏而中和病毒。随着病毒的每次后续施用，免疫应答变得更快和更强，这显著限制了病毒持续足以达到肿瘤长时间的能力。将病毒直接注射入肿瘤中克服了该限制，并且将所有病毒颗粒直接递送至癌细胞。然而，这种方法可不适用于一些肿瘤，并且没有考虑到肿瘤可能已经转移到其他位置的情况。病毒的更期望的全身施用使它暴露于能够识别和消除潜在病原体的宿主免疫系统。比如中和抗体(NAb)的免疫因子以高亲和力识别并结合病毒糖蛋白，并且防止病毒与宿主细胞受体相互作用，从而导致病毒中和。几种溶瘤病毒，比如腺病毒、单纯性疱疹病毒和水疱性口炎病毒，已经遗传减毒，以安抚它们诱导抗病毒防御和改善肿瘤特异性的能力。

溶瘤痘苗病毒(VV)是痘病毒科(poxviridae)中研究最多的成员，是大型的、包膜的dsDNA病毒。已经报道了对肿瘤细胞高度特异性的菌株。VV的快速复制能力导致感染细胞的有效溶解，以及在连续几轮复制后扩散到其他肿瘤细胞，从而导致肿瘤的深度局部破坏。VV基因组编码～250个基因，并且可接受多达20kb的外源DNA，使其理想的作为基因递送媒介物。正在开发的重组VV载体，以将真核基因，比如肿瘤相关抗原，递送至肿瘤，因此促进对涉及杀伤癌细胞的宿主免疫系统的诱导。然而，将VV用作癌症治疗递送载体的限制因素是由VV注射血流诱导的强烈的Nab应答，这限制了病毒的持久和传播能力，并且防止了载体的重新给药。NAb识别且结合嵌入VV包膜的病毒糖蛋白，因此防止病毒与宿主细胞受体的相互作用。已经鉴定出许多参与宿主细胞受体识别的VV糖蛋白。其中，蛋白H3L、L1R、A27L、D8L、A33R和B5R已经显示被NAb靶向，其中A27L、H3L、D8L和L1R是成熟病毒颗粒表面上存在的主要NAb抗原。A27L、H3L和D8L是结合至宿主糖胺聚糖(GAG)硫酸乙酰肝素(HS)(A27L和H3L)和硫酸软骨素(CS)(D8L)并且介导病毒内吞入宿主细胞的粘附分子。L1R蛋白与病毒成熟有关。

牛痘病毒是痘病毒科家族中正痘病毒属(orthopoxvirus)的原型病毒，其在细胞的细胞质中复制并且在190-kb的双链DNA基因组中编码大于200个开放阅读框(ORF)。牛痘病毒感染产生多种形式的感染颗粒，即细胞内成熟的病毒粒子(IMV)、细胞内包膜的病毒粒子(IEV)、细胞相关包膜的病毒粒子(CEV)和细胞外包膜的病毒粒子(EEV)。IMV是最丰富的病毒粒子，在细胞中具有单层膜。IMV仅在细胞溶解期间释放。一旦释放，IMV经细胞受体与嵌入IMV膜的病毒糖蛋白之间的相互作用有效感染邻近细胞。IMV的一部分随后被两层高尔基体膜包裹以形成IEV，其通过微管运输至细胞周围，并且在病毒粒子逸出期间失去一层膜以变成CEV。一小部分(～5％)的IMV向细胞的外围移动，其中其经与细胞质膜融合获得外包膜，随后作为EEV释放入细胞外空间。因此，EEV由病毒DNA核、中间IMV和最外层膜构成。该外膜脆弱并且容易丢失，因此EEV容易转化为暴露IMV包埋抗原的IMV。IMV强壮，并且已知对环境和物理变化有抗性，而CEV和EEV非常脆弱，在纯化期间会破坏其外膜的完整性。

已经测序了许多痘病毒基因组，包括牛痘病毒的不同菌株的那些。牛痘病毒Western Reserve(WR)菌株的基因组含有218个潜在ORF。IMV中的蛋白质的分析显示，其含有81种病毒蛋白，包括结构蛋白、酶、转录因子等。IMV中的81种病毒蛋白是A2.5L、A3L、A4L、A5R、A6L、A7L、A9L、A10L、A12L、A13L、A14L、A14.5L、A15L、A16L、A17L、A18R、A21L、A22R、A24R、A25L、A26L、A27L、A28L、A29L、A30L、A31R、A32L、A42R、A45R、A46R、B1R、C6L、D1R、D2R、D6R、D7R、D8L、D11L、D12L、D13L、E1L、E4L、E6R、E8R、E10R、E11L、F8L、F9L、F10L、F17R、G1L、G3L、G4L、G5R、G5.5R、G7L、G9R、H1L、H2R、H3L、H4L、H5R、H6R、I1L、I2L、I3L、I5L、I6L、I7L、I8R、J1R、J3R、J4R、K4L、L1R、L3L、L4R、L5R、O2L。在这些蛋白质之中，A27L、H3L、L1R和D8L已被鉴定为主要免疫原性蛋白。IMV蛋白A27L、H3L和D8L是结合至宿主糖胺聚糖(GAGs)硫酸乙酰肝素(HS)和硫酸软骨素(CS)(D8L)并且介导病毒内吞入宿主细胞的粘附分子。IMV L1R蛋白参与病毒成熟。这些蛋白质是IMV上的主要免疫优势抗原。

VV H3L是经C-末端的其疏水区翻译后束缚至成熟的病毒颗粒膜的膜蛋白。它在感染期间后期表达，并且与A27L一起识别HS细胞表面受体，并且在VV粘附至细胞中起主要作用。H3L是抗VV Ab应答中的免疫优势抗原和天花疫苗免疫的人中NAb的直接靶标。在小鼠和兔子中也显示出对H3L的强免疫应答。迄今为止，尚未阐明NAb识别的H3L的精确表位。

D8L是在感染早期表达的VV包膜蛋白，并且参与病毒粘附至宿主细胞。当A27L和H3L与HS宿主细胞受体相互作用时，D8L经其N-末端结构域(在残基1–234之间)结合至CS受体。作为主要病毒抗原之一，D8L引发强烈的NAb应答，其中NAb靶向D8L上的CS-结合区并且阻断病毒粘附至细胞。已经描述了靶向D8L蛋白的几种Ab。这些Ab之一在补体存在的情况下中和VV并且靶向D8上的构象表位(在残基41至220之间)。与D8L上CS结合位点相邻的区域的，残基R44、K48、K98、K108和R220对于Ab结合也很重要。另外，N9、E30、T34、T35、N46、F47、K48、G49、G50、Y51、N59、E60、L63、S64、D75、Y76、H95、W96、N97、K99、Y101、S102、S103、Y104、E105、E106、K108、H110、D112、Q122、L124、D126、K163、T187、P188和N190已被鉴定为D8抗体结合位点。还不知道这些残基的突变是否会赋予从中和抗体的足够逃逸。此外，由于D8L在细胞进入中的作用，这些残基的突变是否将损害病毒包装和细胞进入尚待确定。

L1R是在成熟VV颗粒的表面上发现的跨膜蛋白。其跨膜结构域位于残基186和204之间的蛋白质的C-末端区域。L1R是由L1R ORF编码的，是高度保守的，并且在病毒进入和成熟中起至关重要的作用。作为抗VV NAb的主要靶标之一，L1R被包括作为痘病毒蛋白亚基和DNA疫苗的组分。已经表征了L1R蛋白上的NAb结合表位。较早的研究鉴定了识别跨残基118-128的线性表位和与线性肽局部重叠的构象表位的有效NAb，尤其是残基K125和K127。更多最近的研究鉴定了一组3种抗L1R单克隆Ab，其以同种型和补体非依赖性方式有效地中和VV。这些NAb识别具有D35作为关键残基的构象表位。在残基D35处含有单个氨基酸突变的病毒克隆(D35N或D35Y置换)完全对通过所有Ab的中和有抗性，表明D35对于NAb识别L1R和结合至关重要。然而，尚不清楚D35N是否将诱导针对35N的新的中和抗体应答。除D35外，已鉴定了残基E25、N27、Q31、T32、K33、S58、D60和D62直接参与与Ab的结合。由于L1R在细胞进入中的作用，不知道这些残基的突变是否足以逃逸中和抗体并损害病毒包装和细胞进入。

A27L是细胞内成熟的病毒(IMV)的包膜中的14-kDa蛋白，其在病毒宿主细胞识别和进入中起作用。它经其N-末端结构域(残基21至30)结合至宿主细胞表面的HS受体，并且通过其C-末端结构域与包膜蛋白A17相互作用而附接至VV包膜。最近的研究已经鉴定了被抗A27L Ab所识别的A27L上的几个线性表位。Ab被分为四个不同的组，其中I组中的Ab结合至邻近HS结合位点的肽(残基31至40)，并且在补体存在的情况下显示出有效的病毒中和。与这些Ab复合的全长A27L的晶体结构鉴定出残基E33、I35、V36、K37和D39对于结合至关重要。这些残基的丙氨酸置换导致Ab结合肽的能力降低。结构的进一步分析显示，残基K27、A30、R32、A34、E40、R107、P108和Y109虽然不是很关键，但也有助于A27L-Ab的结合。

鉴于上述情况，需要具有降低的诱导抗病毒防御能力且具有增强的抗肿瘤活性的改进的或遗传减毒的牛痘病毒。例如，减少抗病毒防御的诱导且增强抗肿瘤活性的方法包括抵抗中和抗体，克服补体介导的病毒中和，用双特异性多肽武装牛痘病毒以加强病毒疗法和/或并入免疫检查点分子并入的策略。

发明内容

在一个实施方式中，本发明提供突了用作病毒载体和疫苗的变体牛痘病毒。

本文公开了包括变体H3L、D8L、A27L和/或L1R病毒蛋白的重组牛痘病毒，其包括SEQ ID NO:170和172的那些。进一步本文公开了包括编码以下多肽之一的异源核酸的重组牛痘病毒：CD55蛋白的结构域、结合CD3e和FAP的双特异性多肽(成纤维细胞激活蛋白)、结合CD3e和BCMA的双特异性多肽(B-细胞成熟抗原)和包括人PD-1细胞外结构域的融合多肽。

在一个实施方式中，本发明提供了突变牛痘病毒及其用途。在一个实施方式中，提供了在与结合中和抗体或T细胞有关的编码蛋白的基因中具有一个或多个突变的突变牛痘病毒。与野生型病毒相比，这些突变导致突变牛痘病毒具有逃逸牛痘病毒特异性中和抗体或T细胞的能力。

在一个实施方式中，本发明提供了分离的感染性重组牛痘病毒(VV)病毒粒子，重组VV病毒粒子包括异源核酸和以下的一种或多种：

(a)包括与SEQ ID NO:1具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体牛痘病毒(VV)H3L蛋白；

(b)包括与SEQ ID NO:2具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体牛痘病毒(VV)D8L蛋白；

(c)包括与SEQ ID NO:3具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体牛痘病毒(VV)A27L蛋白；

(d)包括与SEQ ID NO:4具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体牛痘病毒(VV)L1R蛋白；

(e)与SEQ ID NO:5具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体牛痘病毒(VV)H3L蛋白；

(f)包括与SEQ ID NO:174具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体牛痘病毒(VV)D8L蛋白；

(g)包括与SEQ ID NO:170具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体牛痘病毒(VV)H3L蛋白；和

(h)包括与SEQ ID NO:172具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体牛痘病毒(VV)D8L蛋白。

在一个实施方式中，本发明提供了包括编码补体激活调节剂比如CD55、CD59、CD46、CD35、因子H和C4-结合蛋白等的部分或全部的核酸的重组牛痘病毒(VV)病毒粒子及其用途。补体激活调节剂的表达导致重组牛痘病毒当与野生型病毒相比时具有调节补体激活和减少补体-介导病毒中和的能力。在一个实施方式中，CD55蛋白包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

在一个实施方式中，本发明提供了包括双特异性FAP-CD3 scFv的重组牛痘病毒(VV)病毒粒子，所述双特异性FAP-CD3 scFv包含具有SEQ ID NO:8的序列的氨基酸序列。

在一个实施方式中，本发明提供了包括双特异性BCMA-CD3 scFv的重组牛痘病毒(VV)病毒粒子，所述双特异性BCMA-CD3 scFv包含具有SEQ ID NO:9的序列的氨基酸序列。

在一个实施方式中，本发明提供了包括PD-1-ED-hIgG1-Fc融合肽的重组牛痘病毒(VV)病毒粒子，所述PD-1-ED-hIgG1-Fc融合肽包含具有SEQ ID NO:10的序列的氨基酸序列。

在另一实施方式中，本发明提供了将基因产物递送至需要其的个体的方法，方法包括向个体施用有效量的本文公开的感染性重组牛痘病毒(VV)病毒粒子，其中基因产物由重组VV病毒粒子携带的异源核酸编码。

在一个实施方式中，提供了包括本文公开的重组牛痘病毒(VV)病毒粒子药物组合物，和使用这种组合物以治疗癌症的方法。

在一个实施方式中，提供了包括一种或多种变体牛痘病毒(VV)病毒粒子的文库，每个所述变体VV病毒粒子包括一种或多种变体VV蛋白，变体VV蛋白包括具有相对于相应野生型VV蛋白的氨基酸序列至少一个氨基酸置换的氨基酸序列。

在另一实施方式中，本发明提供了将基因产物递送至需要其的个体的方法，方法包括向个体施用有效量的源自以上文库的感染变体牛痘病毒(VV)病毒粒子，其中基因产物由这种变体VV病毒粒子携带的核酸编码。

在另一实施方式中，提供了包括源自以上文库的变体牛痘病毒(VV)病毒粒子的药物组合物，和使用这种组合物以治疗癌症的方法。

在一个实施方式中，提供了与SEQ ID NO:1、5或170之一具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的重组牛痘病毒H3L蛋白。在另一实施方式中，提供了与EQ ID NO:6、172或174之一具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的重组牛痘病毒D8L蛋白。

附图说明

图1A-C显示了H3L–肽阵列序列分析的中和抗体(Nab)表位测定。抗体35219用于结合至H3L序列的肽阵列(Ab35219是对于VV的兔子多克隆；免疫原：天然病毒，Lister菌株)。

图1A显示了SPOT合成肽阵列的图。图1B显示了由ab35219探测的H3L肽阵列的放射自显影图。肽阵列由H3L序列中12个残基肽的点组成，从N末端(点1)开始，并且以C末端肽(点69)结束，每个点的肽的N-末端残基沿H3L序列从前一个点移位了4个残基。图1C是显示每个点(黑条)(x轴)的信号强度(y轴)的图。

图2A-B显示了通过线性肽ELISA对H3L的NAb表位作图。图2A显示了H3L肽1-4的ELISA结果。图2B显示了H3L肽5-9的ELISA结果。箭头表示对抗体(Ab)的结合有影响的丙氨酸取代的残基的一些示例。丙氨酸扫描鉴定出对Ab结合为阳性的总共29个残基：I14A、D15A、R16A、K33A、F34A、D35A、K38A、N40A、E45A、V52A、E131A、T134A、F135A、L136A、R137A、R154A、E155A、I156A、K161A、L166A、V167A、M168A、I198A、R227A、E250A、K253A、P254A、N255A和F256A。较低的光密度(OD)指示与Ab预孵育的丙氨酸取代的肽结合足够以防止Ab结合至板结合的天然肽。较高的OD(箭头)指示突变肽与Ab相互作用的能力降低，这表明突变的残基对于H3L结合至Ab的很重要。

图3A-D显示了修饰的H3L、D8L、L1R和A27L质粒的构建。

图3A显示含有H3L启动子、H3L ORF(具有突变的核苷酸)和含有H4L(左侧翼)和H2R(右侧翼)的约～250-bp侧翼区的构建体。ORF序列通过GENEWIZ合成并且克隆至pUC57-Amp质粒中。

图3B显示了含有D8L启动子、D8L ORF(具有突变的核苷酸)和含有D9R(左侧翼)和D7R(右侧翼)的约～250-bp侧翼区的构建体。ORF序列通过GENEWIZ合成并且克隆至pUC57-Amp质粒中。

图3C显示了含有L1R启动子、L1R ORF(具有突变的核苷酸)和含有G9R(左侧翼)和L2R(右侧翼)的约～250-bp侧翼区的构建体。ORF序列通过GENEWIZ合成并且克隆至pUC57-Amp质粒中。

图3D显示了含有A27L启动子、A27L ORF(具有突变的核苷酸)和含有A28-A29L(左侧翼)和A26L(右侧翼)的约～250-bp侧翼区的构建体。ORF序列通过GENEWIZ合成并且克隆至pUC57-Amp质粒中。对于所有四个构建体，在VV p7.5启动子控制下且在LoxP位点侧翼的绿色荧光蛋白(GFP)表达盒被插入右侧翼序列之前的终止密码子紧邻下游。

图4显示了正确的H3L、D8L、L1R和A27L重组克隆的鉴定。纯化单个噬菌斑并通过PCR确认正确的基因插入。

图5显示了使用多克隆抗VV Ab的噬菌斑减少中和测试(PRNT)。一组由ab35219(Abcam)–对于VV的兔子多克隆(免疫原：天然病毒，Lister菌株)、ab21039(Abcam)–对于VV的兔子多克隆(免疫原：Lister菌株(病毒粒子和感染的细胞多肽的混合物))、ab26853(Abcam)–对于VV的兔子多克隆(免疫原：含有在VV中A27L的预测N末端处的氨基酸的合成的肽)、9503-2057(Bio-Rad)–针对VV Ab的兔子多克隆(免疫原：牛痘病毒，New York CityBoard of Health(NYCBOH)菌株)和PA1-7258(Invitrogen)–针对VV的兔子多克隆(免疫原：NYCBOH菌株和Lister菌株)组成的五种抗VV多克隆抗体用于测试体外中和逃逸。兔子多克隆IgG ab37415用作对照。在无菌小兔补体存在的情况下，将Ab与逃逸变体或wt VV病毒(对照)预孵育。然后将混合物添加至CV-1细胞中，并且在48小时后对细胞染色且计数噬菌斑。整个小组中和了83.3–95.5％的对照VV病毒，而逃逸变体(FAP-VVNEV)显示通过Ab的中和显著更低(7.88–66.1％)。误差线基于每个样品的两个或三个数据点。

图6显示了用抗VV多克隆Ab的VV

图7显示了重组病毒复制测定的结果。在24孔板中，用以MOI＝0.05的VV对照和VV

图8显示了重组病毒的抗肿瘤效率。重组病毒和对照VV与Ab 9503-2057(参见以上)预孵育，并用于以MOI＝1感染转化的细胞。将细胞孵育48小时，并且通过MTS测定(细胞代谢活性的比色评估)测量细胞活力。简言之，将在48小时收集的细胞用PBST洗涤一次，并且以1×105个细胞/mL再悬浮于完全DMEM中。将100μL的每种细胞悬浮液添加至96孔(一式三份)。将20μl的CellTiter

图9显示了具有抗VV多克隆Ab的重组VV

图10显示了重组病毒复制测定的结果。在24孔板中，用以MOI＝0.05的VV对照的复制品和3个VV

图11显示了含有A27启动子、CD55-ED、A27、loxP-侧翼的标签和含有A27L(左侧翼)和A27R(右侧翼)的侧翼区的CD55-A27-VV构建体。ORF序列通过GENEWIZ合成并且克隆至pUC57-Amp质粒中。

图12显示了CD55-NEV在体外有效逃逸补体-介导的中和。

图13显示了CD55-NEV在体外有效逃逸中和抗体和补体-介导的中和。

图14显示了含有F17R启动子、FAP-CD3 scFv、loxP-侧翼的标签含有TKL(左侧翼)和TKR(右侧翼)的侧翼区的FAP-TEA-NEV构建体。ORF序列通过GENEWIZ合成并且克隆至pUC57-Amp质粒中。

图15显示了FAP-TEA-NEV在体外增强肿瘤溶解和人T细胞增殖(参见圆圈，显微镜观察)。

图16显示了FAP-TEA-NEV有效诱导肿瘤细胞凋亡(流式细胞术分析)。

图17显示了门控U87肿瘤细胞的凋亡标志物PI染色的MFI。

图18显示了通过FAP-TEA-NEV在体外增强旁观者肿瘤溶解表达的双特异性FAP-CD3 scFv(参见圆圈，显微镜观察)。

图19显示了含有F17启动子、BCMA-CD3 scFv、loxP-侧翼的GFP-标签和含有TKL(左侧翼)和TKR(右侧翼)的侧翼区的BCMA-TEA-NEV构建体。ORF序列通过GENEWIZ合成，并且克隆至pUC57-Amp质粒中。

图20A-B显示显示了BCMA-阳性RMPI-8226MM和Jurkat T细胞共培养的流式细胞术分析。

图21A-B显示了在与BCMA-阳性RMPI-8226MM共培养24小时后，Jurkat T细胞对IFNγ和IL2表达的ELISA测量。

图22显示了含有pE/L启动子、PD-1-ED-hIgG1-Fc、loxP-侧翼的GFP-标签和含有TKL(左侧翼)和TKR(右侧翼)的侧翼区的PD-1-ED-hIgG1-Fc-VV构建体。还显示了含有pE/L启动子、PD-1-ED-hIgG1-Fc、F17R启动子、FAP-CD3 scFv、loxP-侧翼的GFP-标签和含有TKL(左侧翼)和TKR(右侧翼)的侧翼区的PD-1-ED-hIgG1-Fc-FAP-TEA-NEV构建体。ORF序列通过GENEWIZ合成并且克隆至pUC57-Amp质粒中。

图23A-B显示了PD-L1-阳性Raji细胞和CD16-阳性Jurkat T细胞共培养的流式细胞术分析。

图24A-B显示了在与PD-L1-阳性Raji细胞共培养24小时后，CD1-6阳性Jurkat T细胞对IFNγ和IL2表达的ELISA测量。

图25显示了在与PD-L1-阳性Raji细胞共培养24小时后，CD16-阳性Jurkat T细胞的荧光素酶活性测量。

具体实施方式

本发明公开了具有降低的诱导抗病毒防御能力并且具有增强的抗肿瘤活性的变体牛痘病毒(VV)病毒粒子的制备和用途。

在一个实施方式中，本发明的变体牛痘病毒(VV)病毒粒子具有增加的对抗VV中和抗体的抗性。例如，本发明的变体牛痘病毒病毒粒子包括一种或多种在一个或多个中和抗体表位具有突变的变体VV蛋白(比如H3L蛋白、D8L蛋白、A27L蛋白和L1R蛋白)，从而赋予病毒从中和抗体逃逸。

本说明书公开了研究变体VV蛋白H3L的实验。相同实验设置可用于研究其他牛痘病毒病毒蛋白比如D8L蛋白、A27L蛋白、L1R蛋白等。为了鉴定病毒蛋白上与中和抗体相互作用的可能区域，合成了拥有全长病毒蛋白的肽阵列，并且筛选结合抗VV中和抗体的肽。进一步检查由此鉴定的肽以阐明中和抗体表位。在一个实施方式中，用丙氨酸置换合成由肽阵列鉴定的肽的变体，并且使用一系列ELISA结合测定对中和抗体表位作图。一旦鉴定出中和抗体表位，可通过基因工程将破坏这些表位的突变引入VV基因组中。

本发明公开了牛痘病毒H3L蛋白、D8L蛋白、A27L蛋白和L1R蛋白的每一个上的许多中和抗体表位。在这些中和抗体表位处突变或置换氨基酸将赋予从中和抗体的病毒逃逸。类似地，还预期在这些中和抗体表位处缺失氨基酸以赋予从中和抗体的病毒逃逸。因此，预期在H3L、D28L、A27L、L1R病毒蛋白内的一个或多个氨基酸的缺失或者整个H3L、D28L、A27L或L1R病毒蛋白的缺失也可赋予从中和抗体结合的逃脱。已经报道了H3L缺失突变变体，指示生成一个或多个氨基酸缺失或者全蛋白缺失病毒突变体的可行性，即使H3L缺失损害了病毒突变体的感染性和复制能力。

在一个实施方式中，本发明提供了分离的感染性重组牛痘病毒(VV)病毒粒子，其包括异源核酸和以下的一种或多种：

(a)包括与SEQ ID NO:1具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体牛痘病毒(VV)H3L蛋白；

(b)包括与SEQ ID NO:2具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体牛痘病毒(VV)D8L蛋白；

(c)包括与SEQ ID NO:3具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体牛痘病毒(VV)A27L蛋白；

(d)包括与SEQ ID NO:4具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体牛痘病毒(VV)L1R蛋白；

(e)包括与SEQ ID NO:5具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体牛痘病毒(VV)H3L蛋白；

(f)包括与SEQ ID NO:174具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体牛痘病毒(VV)D8L蛋白；

(g)包括与SEQ ID NO:170具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体牛痘病毒(VV)H3L蛋白；和

(h)包括与SEQ ID NO:172具有至少约60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体牛痘病毒(VV)D8L蛋白。

在一个实施方式中，以上变体VV H3L蛋白包括在以下氨基酸残基的一个或多个处的氨基酸置换或缺失：SEQ ID NO:1的14、15、16、33、34、35、38、40、44、45、52、131、134、135、136、137、154、155、156、161、166、167、168、198、227、250、253、254、255和256。任何合适的氨基酸可用于置换。例如，变体肽可合成为具有置换。

在一个实施方式中，以上变体VV D8L蛋白包括在以下氨基酸残基的一个或多个处的氨基酸置换或缺失：SEQ ID NO:2的44、48、98、108、117和220。任何合适的氨基酸可用于置换。例如，变体肽可合成为具有置换。

在一个实施方式中，以上变体VV A27L蛋白包括在以下氨基酸残基的一个或多个处的氨基酸置换或缺失：SEQ ID NO:3的27、30、32、33、34、35、36、37、39、40、107、108和109。任何合适的氨基酸可用于置换。例如，变体肽可合成为具有置换。

在一个实施方式中，以上变体VV L1R蛋白包括在以下氨基酸残基的一个或多个处的氨基酸置换或缺失：SEQ ID NO:4的25、27、31、32、33、35、58、60、62、125和127。任何合适的氨基酸可用于置换。例如，变体肽可合成为具有置换。

在一个实施方式中，以上变体VV H3L蛋白包括在以下氨基酸残基的一个或多个处的氨基酸置换或缺失：SEQ ID NO:170的14、15、16、33、34、35、38、40、44、45、52、131、132、134、135、136、137、154、155、156、161、166、167、168、195、198、199、227、250、251、252、253、254、255、256、258、262、264、266、268、272、273、275和277。任何合适的氨基酸可用于置换。

在一个实施方式中，以上变体VV D8L蛋白包括在以下氨基酸残基的一个或多个处的氨基酸置换或缺失：SEQ ID NO:172的43、44、48、53、54、55、98、108、109、144、168、177、196、199、203、207、212、218、220、222、和227。任何合适的氨基酸可用于置换。

补体是先天免疫系统的关键成分，其靶向病毒以中和并从循环系统清除。补体可增强中和抗体的中和效力，在没有补体的情况下，天花接种疫苗诱导的抗体-介导的保护免疫力在体外被很大程度上降低，这表明补体在牛痘病毒的中和中的关键作用。补体激活导致C3的裂解和激活和调理素C3片段在表面上的沉积。C5的后续裂解导致膜攻击复合物的组装(C5b、6、7、8、9)，这会破坏脂质双层。

补体激活可通过几种补体激活的膜调节剂(RCA)而得到负调节。RCA在不同步骤调补体激活。第一，CD35(补体受体1)和CD55(衰变加速因子)抑制C3转化酶(C3-激活酶)的形成并加速其衰变。第二，CD35和CD46(膜辅因子蛋白)分解代谢C4b和C3b，抑制C3转化酶C4b2a和C3bBb的形成。第三，CD59防止膜攻击复合物的形成。研究已经显示，细胞外包膜的牛痘病毒(EEV)对补体有抗性，因为宿主RCA并入其包膜内。但是，尚未知道CD55和/或其他RCA是否可以不影响病毒包装和复制的情况下，在具有克服补体-介导的中和的能力的VV的IMV表面上成功地表达。

在一个实施方式中，本发明提供了重组牛痘病毒(VV)病毒粒子，其包括编码补体激活调节剂比如CD55、CD59、CD46、CD35、因子H、C4-结合蛋白或其他鉴定的补体激活调节剂的异源核酸，及其用途。表达补体激活调节剂导致重组痘苗病毒与野生型病毒相比具有调节补体激活且减少补体-介导的病毒中和的能力。在一个实施方式中，以上重组痘苗病毒(VV)病毒粒子携带的异源核酸编码人CD55、CD59、CD46、CD35、因子H、C4-结合蛋白或其他鉴定的补体激活调节剂的结构域。在另一实施方式中，异源核酸编码包括具有SEQ ID NO:7的序列的氨基酸序列的CD55蛋白。鉴于本文提出的本公开内容，本领域普通技术人员将容易地在本文提出的重组牛痘病毒中采用其他补体激活调节剂(例如CD59、CD46、CD35、因子H、C4-结合蛋白等)。

可装备溶瘤病毒以表达结合至免疫细胞上的第一抗原和肿瘤细胞上的第二抗原的双特异性抗体。免疫细胞上的第一抗原的示例包括但不限于CD3、CD4、CD5、CD8、CD16、CD28、CD40、CD64、CD89、CD134、CD137、NKp46和NKG2D等。肿瘤细胞上的第二抗原的示例包括但不限于EphA2、HER2、GD2、磷脂酰肌醇聚糖-3、5T4、8H9、avb6整联蛋白、B7-H3、B7-H6、BCMA、CADC、CA9、CD19、CD20、CD22、κ轻链、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFRv111、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、fetal AchR、叶酸受体a、GD2、GD3、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2、IL11Ra、IL13Ra2、KDR、λ、路易斯-Y、MCSP、间皮蛋白、Mucl、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSCl、PSMA、RORI、SURVIVIN、TAG72、TEMl、TEM8、VEGRR2、胚胎抗原、HMW-MAA、VEGF受体、和肿瘤的细胞外基质内存在的其他示例性抗原比如纤连蛋白、腱生蛋白或肿瘤的坏死区域的癌胚变体。

多发性骨髓瘤(MM)是源自B-淋巴细胞系的克隆浆细胞的恶性肿瘤，其是一系列从意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)到浆细胞白血病的疾病谱的部分。其是美国第二大最常见的血液学癌症，2019年估计有32,110例新诊断病例和12,960例死亡。MM当前占血液系统恶性肿瘤的10％并且占所有癌症相关死亡的2.1％。当前有几种治疗可用于MM，但是没有可治愈的疗法得到确定，无论治疗方案或对治疗的最初应答，大多数患者最终将以3-5年的中位生存期复发。因此，迫切需要具有新作用机制的疗法来治疗抗药性MM。

溶瘤牛痘病毒(VV)作为具有治疗MM的巨大潜力的有希望的新型试剂出现。WHO已对2亿多人施用了活VV以根除天花，使VV在人中有卓越的安全历史。尽管野生型VV不具有肿瘤选择性，但对于正常细胞中病毒复制必不可少的病毒基因，比如胸苷激酶(TK)和牛痘生长因子(VGF)的双重缺失赋予了严格的VV肿瘤特异性。VV针对实体瘤的最近临床试验报告了有希望的结果。利用对TK和VGF双重缺失的菌株进行的体外研究显示，MM细胞系易受VV杀伤。在那些研究中，在原代MM细胞中观察到病毒复制，但在正常外周血液单核细胞(PBMC)中未观察到。在MM的小鼠异种移植模型中，双重缺失的菌株还减少了肿瘤体积且增加了存活率。另外，最近当与用单独的亲本病毒、VV-miR-34a或VV-Smac治疗相比时，在过表达两种抗肿瘤因子miR-34a和Smac(经常在MM中失调)的TK-缺失的VV菌株中显示出体外和体内都针对MM的效力的增加。但是，当前临床研究中VV疗法的效力没有优化，指示需要进一步改进VV疗法。

VV可以表达靶向或共靶向MM抗原，比如BCMA、CD19、CD26、CD38、CD44v6、CD56、CD138、CS1、EGFR、整联蛋白β7、KIR、LIGHT/TNFSF14、NKG2D、PD-1/PD-L1、SLAMF7、TACI、和TGIT的T-细胞衔接子。B-细胞成熟抗原(BCMA)，肿瘤坏死因子受体超家族17(TNFRSF17)中的跨膜糖蛋白，是MM疗法的有希望的靶标，因为其在所有患者MM细胞中均以较高的水平表达，但在正常组织中却不这样，除了浆细胞(PC)。在最近临床研究中，BCMA-靶向嵌合抗原受体(CAR)T-细胞在患有复发性和难治性多发性骨髓瘤(RRMM)的患者中显示了出显著的临床活性，这些患者已经历至少三种先前的治疗，包括蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂。抗BCMAAb–药物缀合物(ADC)在对至少三种以前的治疗路线中均无效的患者中也取得了显著的临床应答。FDA于2017年11月将靶向BCMA的CAR-T和ADC认定为对于RRMM患者具有突破性地位。与这两种疗法一样有希望的是，靶向BCMA的因素有几个复杂因素。第一，抗BCMA治疗将潜在地减少长寿PC的数量，由于长寿PC在维持体液免疫中起着关键作用，因此需要仔细和连续评估抗BCMA疗法对免疫功能的影响。第二，在MM患者中，尤其是在进行性疾病的情况下，已经检测到高血清水平的sBCMA，其通过γ-分泌酶从BCMA中裂解。因此，必须开发治疗策略以将靶向BCMA的治疗直接传递至BCMA+MM细胞。

如本文描述的，本发明提供重组牛痘病毒(VV)，BCMA-TEA-NEV，其克服了以上讨论的限制，因为BCMA-CD3 BiTE表达将被限制在MM周围区域内，同时逃逸了BCMA+PC和sBCMA。TEA-NEV编码双特异性scFv，其指导T细胞识别且杀伤未被VV感染的肿瘤细胞(旁观者杀伤)，导致增强的肿瘤溶解。另外，CD3-scFv促进T-细胞向肿瘤的浸润和其激活，并且它们在激活后释放的细胞因子创建了抑制肿瘤生长的促炎性微环境。另外，TEA-NEV诱导T-细胞衔接子的局部产生，从而允许在靶位点的T细胞浓度更高，同时减少了全身性副作用。因此，用双特异性scFv装备溶瘤VV对于使T细胞参与癌症疗法且通过诱导旁观者杀伤产生当前VV的抗肿瘤活性所需的增加是重要的。

在一个实施方式中，以上重组牛痘病毒(VV)病毒粒子携带的异源核酸编码结合至免疫细胞上的第一抗原和多发性骨髓瘤(MM)上的第二抗原(B-细胞成熟抗原(BCMA))的双特异性多肽。例如，双特异性多肽是双特异性scFv，第一抗原是人CD3e，第二抗原是人BCMA(B-细胞成熟抗原)，和双特异性scFv包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在另一实施方式中，VV可表达靶向或共靶向其他MM抗原，比如CD19、CD38、SLAMF7、CD26、LIGHT/TNFSF14、整联蛋白β7、CD138、KIR、EGFR、PD-1/PD-L1、TGIT、CD56、CS1、NKG2D、TACI和CD44v6的T-细胞衔接子。

另一实施方式中，双特异性多肽是双特异性scFv，第一抗原是人CD3e和第二抗原是在大多数上皮癌中过表达的人FAP(成纤维细胞激活蛋白)。在一个实施方式中，双特异性FAP-CD3 scFv包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

越来越多的证据显示T-细胞免疫疗法具有控制癌症患者的肿瘤生长和延长生存期的能力。然而，可能由于肿瘤细胞的各种免疫逃逸机制的局限性，难以实现和维持肿瘤特异性T-细胞应答。免疫检查点分子是在某些免疫细胞上表达的蛋白质，需要激活或抑制这些蛋白质以启动免疫应答，例如，攻击体内的异常细胞比如肿瘤细胞。“免疫逃逸”可包括肿瘤细胞的几种活性，比如共刺激分子表达的下调，比如刺激性免疫检查点分子，和抑制分子表达的上调，比如抑制性免疫检查点分子。在癌症治疗的临床前和临床试验中，这些抑制性免疫检查点分子的阻断已显示出非常有希望的结果。然而，在一些情况下会有一些不良的副作用。例如，阻断这些抑制性免疫检查点分子(受体或配体)可导致免疫稳态和自我耐受性受到破坏，从而导致自身免疫/自身炎症性副作用。

免疫检查点分子是本领域众所周知的。例如，PD-1(程序性细胞死亡-1)受体在激活的T细胞表面上表达。其配体PD-L1和PD-L2通常在树突状细胞或肿瘤细胞表面上表达。PD-1和PD-L1/PD-L2属于抑制性免疫检查点蛋白家族，可以阻止或限制T细胞应答的发展。在肿瘤细胞上表达的PD-L1可结合激活的T细胞上的PD-1受体，从而导致对细胞毒性T细胞的抑制。因此，抗肿瘤免疫应答将通过阻断PD-1和其配体之间的相互作用得到增强。

在一个实施方式中，本发明提供了将阻断抑制PD-1途径的重组牛痘病毒(VV)病毒粒子。在一个实施方式中，本发明提供了包括编码融合至免疫球蛋白-G1(IgG1)的恒定(Fc)结构域的PD-1的细胞外结构域的异源核酸的重组牛痘病毒(VV)病毒粒子。在一个实施方式中，PD-1融合蛋白(PD-1-ED-hIgG1-Fc)包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列。鉴于本文提出的本公开内容，其他免疫检查点分子可以容易地并入本文提出的重组牛痘病毒中。本文公开的重组牛痘病毒可包括免疫检查点分子，其包括但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、CD47、CXCR4、CSF1R、LAG-3、TIM-3、HHLA2、BTLA、CTLA-4、TIGIT、VISTA、B7-H4、CD160、2B4和CD73。

在一个实施方式中，本发明提供了分离的感染性重组牛痘病毒(VV)病毒粒子，病毒粒子其包括异源核酸和以下的一种或多种：

a)与SEQ ID NO:1具有至少约60％氨基酸序列同一性的变体牛痘病毒(VV)H3L蛋白；

b)与SEQ ID NO:2具有至少约60％氨基酸序列同一性的变体牛痘病毒(VV)D8L蛋白；

c)与SEQ ID NO:3具有至少约60％氨基酸序列同一性的变体牛痘病毒(VV)A27L蛋白；

d)与SEQ ID NO:4具有至少约60％氨基酸序列同一性的变体牛痘病毒(VV)L1R蛋白；

e)与SEQ ID NO:5具有至少约60％氨基酸序列同一性的变体牛痘病毒(VV)H3L蛋白；

f)与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:174具有至少约60％氨基酸序列同一性的变体牛痘病毒(VV)D8L蛋白；

g)与SEQ ID NO:170具有至少约60％氨基酸序列同一性的变体牛痘病毒(VV)H3L蛋白；和

h)与SEQ ID NO:172具有至少约60％氨基酸序列同一性的变体牛痘病毒(VV)D8L蛋白。

在一个实施方式中，变体VV H3L蛋白包括在以下氨基酸残基的一个或多个处的氨基酸置换或缺失：SEQ ID NO:1的14、15、16、33、34、35、38、40、44、45、52、131、134、135、136、137、154、155、156、161、166、167、168、198、227、250、253、254、255和256。

在一个实施方式中，变体VV D8L蛋白包括在以下氨基酸残基的一个或多个处的氨基酸置换或缺失：SEQ ID NO:2的44、48、98、108、117、和220。

在一个实施方式中，变体VV A27L蛋白包括在以下氨基酸残基的一个或多个处的氨基酸置换或缺失：SEQ ID NO:3的27、30、32、33、34、35、36、37、39、40、107、108、和109。

在一个实施方式中，变体VV L1R蛋白包括在以下氨基酸残基的一个或多个处的氨基酸置换或缺失：SEQ ID NO:4的25、27、31、32、33、35、58、60、62、125、和127。

在一个实施方式中，变体VV H3L蛋白包括在以下氨基酸残基的一个或多个处的氨基酸置换或缺失：SEQ ID NO:170的14、15、16、33、34、35、38、40、44、45、52、131、132、134、135、136、137、154、155、156、161、166、167、168、195、198、199、227、250、251、252、253、254、255、256、258、262、264、266、268、272、273、275、和277。

在一个实施方式中，变体VV D8L蛋白包括在以下氨基酸残基的一个或多个处的氨基酸置换或缺失：SEQ ID NO:172的43、44、48、53、54、55、98、108、109、144、168、177、196、199、203、207、212、218、220、222、和227。

在一个实施方式中，重组VV携带的异源核酸编码补体激活的调节剂的结构域。补体激活的调节剂的示例包括但不限于CD55、CD59、CD46、CD35、因子H和C4-结合蛋白。在一个实施方式中，编码CD55多肽的异源核酸包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

在另一实施方式中，重组VV携带的异源核酸编码结合至免疫细胞上的第一抗原和肿瘤细胞上的第二抗原的双特异性多肽。在一个实施方式中，免疫细胞上的第一抗原可以是CD3、CD4、CD5、CD8、CD16、CD28、CD40、CD64、CD89、CD134、CD137、NKp46或NKG2D。在一个实施方式中，肿瘤细胞上的第二抗原可以是成纤维细胞活化蛋白(FAP)，或多发性骨髓瘤上的肿瘤抗原。

在一个实施方式中，双特异性多肽是双特异性scFv，第一抗原是人CD3e和第二抗原是人FAP。例如，该双特异性多肽具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

在另一实施方式中，双特异性多肽可靶向多发性骨髓瘤上的肿瘤抗原，例如B-细胞成熟抗原(BCMA)、CD19、CD38、SLAMF7、CD26、LIGHT/TNFSF14、整联蛋白β7、CD138、KIR、EGFR、PD-1/PD-L1、TGIT、CD56、CS1、NKG2D、TACI或CD44v6。在一个实施方式中，双特异性多肽是双特异性scFv，第一抗原是人CD3e和第二抗原是人BCMA。例如，该双特异性多肽具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在另一实施方式中，重组VV携带的异源核酸编码包括免疫检查点分子的融合多肽。免疫检查点分子的示例包括但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、CD47、CXCR4、CSF1R、LAG-3、TIM-3、HHLA2、BTLA、CTLA-4、TIGIT、VISTA、B7-H4、CD160、2B4和CD73。在一个实施方式中，重组VV携带的异源核酸编码包括人PD-1细胞外结构域和人IgG1 Fc结构域的融合多肽，例如，该融合多肽具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

在一个实施方式中，与野生型VV展示出的抗性相比，本文公开的重组牛痘病毒(VV)病毒粒子展现出对中和抗体的抗性。在另一实施方式中，与野生型VV对哺乳动物细胞的转导相比，在抗VV中和抗体存在的情况下，本文公开的重组牛痘病毒(VV)病毒粒子展示出对哺乳动物细胞的转导的增加。

在另一实施方式中，提供了将基因产物递送至需要其的受试者(人或动物)的方法。方法包括向受试者施用有效量的本文公开的重组牛痘病毒(VV)病毒粒子，其中基因产物由重组VV病毒粒子携带的异源核酸编码。

在另一实施方式中，提供了包括本文公开的重组牛痘病毒(VV)病毒粒子和药学上可接受的载体的药物组合物。在另一实施方式中，提供了使用这种药物组合物治疗受试者的癌症的方法。在一个实施方式中，药物组合物可静脉内地或者通过注射、吸入、输注、植入、肠胃外施用或肠内施用(例如通过胃肠道)或本领域通常已知的其他全身施用方法向受试者施用。在一个实施方式中，受试者是人。可替选地，本发明也可用于施用至动物受试者和治疗动物受试者。

在另一实施方式中提供了包括一种或多种变体牛痘病毒(VV)病毒粒子的文库，每个变体VV病毒粒子包括一种或多种变体VV蛋白。变体VV蛋白包括相对于相应的野生型VV蛋白的氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换或缺失的氨基酸序列。在一个实施方式中，变体VV蛋白可以是变体H3L蛋白、变体D8L蛋白、变体L1R蛋白和/或变体A27L蛋白。在另一实施方式中，变体VV蛋白包括相对于SEQ ID NO:5、6或174之一所示的氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换或缺失的氨基酸序列。

在另一实施方式中，提供了源自以上文库的变体牛痘病毒(VV)病毒粒子，病毒粒子包括异源核酸和一种或多种变体VV蛋白，其中变体VV蛋白的至少一种包括相对于相应野生型VV蛋白的氨基酸序列具有至少一个氨基酸置换或缺失的氨基酸序列。在一个实施方式中，这种变体VV病毒粒子携带的异源核酸编码补体激活的调节剂比如CD55、CD59、CD46、CD35、因子H或C4-结合蛋白的结构域。例如，异源核酸编码包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CD55蛋白。在另一实施方式中，异源核酸编码结合至免疫细胞上的第一抗原和肿瘤细胞上的第二抗原的双特异性多肽。这种第一抗原和第二抗原的示例以上已经讨论。在一个实施方式中，双特异性多肽是双特异性scFv，第一抗原是人CD3e和第二抗原是人FAP，例如该双特异性scFv包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在另一实施方式中，双特异性多肽是双特异性scFv，第一抗原是人CD3e和第二抗原是人BCMA，例如该双特异性scFv包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在还另一实施方式中，异源核酸编码包括以上所讨论的免疫检查点分子的融合多肽。在一个实施方式中，融合多肽包括人PD-1细胞外结构域和人IgG1 Fc结构域，融合多肽具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

在一个实施方式中，与野生型VV展示出的抗性相比，源自以上文库的变体VV病毒粒子展示对中和抗体的抗性。在另一实施方式中，与野生型VV对哺乳动物细胞的转导相比，在抗VV中和抗体存在的情况下，这些变体VV病毒粒子展示出对哺乳动物细胞的转导的增加。

在另一实施方式中，提供了使用有效量的源自以上文库的重组牛痘病毒(VV)病毒粒子以将基因产物递送至需要其的受试者(人或动物)的方法，其中基因这些产物由那些变体VV病毒粒子携带的核酸编码。

在另一实施方式中，提供了包括源自以上文库的变体牛痘病毒(VV)病毒粒子和药学上可接受的载体的药物组合物。在另一实施方式中，提供了使用这种药物组合物以治疗受试者的癌症的方法。在一个实施方式中，药物组合物可静脉内地或者通过注射、吸入、输注、植入、肠胃外施用或肠内施用(例如通过胃肠道)或本领域通常已知的其他全身施用方法向受试者施用。在一个实施方式中，受试者是人，但是技术也可用于施用至动物受试者和治疗动物受试者。

在另一实施方式中，提供了与SEQ ID NO:1、5或170之一具有至少约60％氨基酸序列同一性的重组牛痘病毒(VV)H3L蛋白。在另一实施方式中，提供了与SEQ ID NO:2、6、172或174之一具有至少约60％氨基酸序列同一性的重组牛痘病毒D8L蛋白。这些重组体H3L或D8L蛋白可赋予对抗VV中和抗体的病毒抗性。

通过参考以下实施例将更容易地理解一般描述的本发明，所述实施例仅出于说明本发明的某些方面和实施方式的目的，而无意于限制本发明。

实施例1

pUC57-Amp A27L，pUC57-Amp L1R，pUC57-Amp D8L，pUC57-Amp H3L，(GENEWIZ)。CV-1细胞(ATCC，cat.#CCL-70)。vSC20牛痘病毒库。GeneJuice Transfection Reagent(Millipore，cat.#2703870)。DMEM培养基(GE Helathcare，cat.#SH30081.01)，FBS(GEHealthcare,cat.#SH30070.03)，DPBS(Sigma，cat.#8537)。干冰/乙醇浴，6-孔组织培养板，12×75–mm聚苯乙烯管，1ml注射器的一次性刮刀或柱塞，无菌2-ml无菌微量离心管。

将CV-1细胞(2×10

对于待转染的每个孔，将100μl无血清培养基添加至无菌管中。然后将3μlGeneJuice直接逐滴滴加至无血清培养基中，并且通过涡旋充分混合，并且在室温孵育5min。将1μg的DNA添加至每个管中，并且通过轻轻抽吸(不要涡旋)混合，然后在室温孵育5-15分钟。然后从单层细胞中去除病毒接种物，并且用PBS洗涤两次。然后将0.5mL新鲜的完全DMEM培养基添加至细胞中。然后将完整体积的GeneJuice/DNA混合物逐滴添加至完全DMEM培养基的细胞中。轻轻摇动盘子以确保均匀分布。孵育4–8小时后，去除转染混合物，并且用完全DMEM培养基代替，然后在37℃(5％CO2)孵育24–72小时。在24-72小时后，将细胞从孔中移出，并且转移至2-ml无菌微量离心管中。然后通过进行三个冻融循环来裂解细胞悬液，每次通过在干冰/乙醇浴中冷冻，在37℃水浴中融化并且涡旋。将细胞裂解物储存在-80℃直至需要。

将CV1细胞(5×10

在完全DMEM培养基(2mL/孔)中，将5×10

接种约3-4百万个CV-1细胞，并且使其在24孔板中生长至100％融合度。将浓缩的病毒原液用DMEM感染培养基稀释成10倍系列稀释液，并且添加至每个孔中。孵育36-72小时后，标记含有单个噬菌斑的孔，并且将其保存在培养箱中，直到整个孔被感染，这在初始感染后需要近似4-5天。收获感染的细胞，并且通过PCR测定确认重组。以下列出了每个反应的PCR条件。

表1

表2

实施例2

为了鉴定参与NAb相互作用的H3L上的可能区域，合成了涵盖全长H3L的肽阵列，并且筛选了结合抗VV NAb的肽。阵列开始于H3L的N末端，并且跨越了蛋白质序列的整个长度，每个连续的斑点含有12个氨基酸，沿着序列向C末端偏移了4个氨基酸，即阵列中的每个斑点具有8个-残基与先前的斑点重叠。然后，筛选含有合成的H3L肽阵列的纤维素膜，以鉴定结合至抗VV多克隆Nab(Abcam，ab35219)的肽。简言之，将膜在Millipore H

表3

PVIDRLP(aa 11-18)(SEQ ID NO:89)，NDQKFDDVKDN(aa 30-40)(SEQ ID NO:90)，PERKNVVVV(aa 44-52)(SEQ ID NO:91)，NVIEDITFLR(aa 128-137)(SEQ ID NO:92)，QMREI(aa 152-156)(SEQ ID NO:93)，KVKTELVM(aa 161-168)(SEQ ID NO:94)，NIVDEIIK(aa197-204)(SEQ ID NO:95)，KINRQI(aa 224-229)(SEQ ID NO:96)，FENMKPNF(aa 249-265)(SEQ ID NO:97)。

Ab-结合位点位于H3L的N-末端结构域(aa 11至52)、中央(aa 128至168)和C-末端部分(aa 198至256)。有趣地，蛋白质的最C-末端结构域(aa 260至324)未显示结合至Ab。H3L的这个疏水区在翻译后插入VV膜，并且在成熟病毒颗粒的情况下不可用于Ab结合。N-末端结构域最有可能参与H3L与细胞表面的结合，因此Ab与该区域的结合将干扰病毒感染细胞的能力，从而支持了我们关于该区域参与Ab结合的阵列结果。另外，较早的研究表明H3L是糖基转移酶。一些病毒编码自己的糖基转移酶，以帮助宿主免疫应答逃逸。H3L在其中央结构域中经D/ExD基序结合至UDP-Glc，并且使该基序突变(特别地，aa 125和127)抑制结合。肽阵列显示出在D/xD基序附近的可能的Ab结合位点(肽NVIEDITFLR，aa 128-137(SEQID NO:92))。Ab在该区域的结合会干扰H3L的糖基转移酶活性，这是Ab中和病毒的另一种可能机制。

实施例3

为了进一步定位NAb表位并且阐明通过我们的肽阵列研究鉴定的H3L肽上的关键残基，用9种鉴定的肽及其丙氨酸置换的变体进行了一系列ELISA(图2)。通过丙氨酸置换合成了通过肽阵列鉴定的9种肽的变体(GenScript USA Inc.NJ，USA)。

表4

天然肽(未突变的，如以上粗体显示，SEQ ID NO:89-97)加生物素标签(N-末端)。将96孔PierceTMNeutrAvidin涂覆的板(Thermo Fisher，15507)用PBST冲洗，并且在4℃的MPBS中(封闭缓冲液，100μL/孔)孵育过夜。丢弃封闭缓冲液，并且将100μL的生物素化的肽以200ng/mL添加至板中，并且在4℃孵育90min。同时，将抗VV兔子多克隆NAb(Abcam，ab35219)与变体肽孵育。我们以800ng/mL使用30μL/孔的Ab，并且在4℃将其与30μL/孔的100μg/mL的丙氨酸修饰肽孵育90min。用PBST洗涤板后，将50μL Ab/丙氨酸肽混合物添加至板结合的肽中(一式两份孔)，并且在4℃孵育60min。将板用PBST洗涤六次，并且添加100μL/孔的抗兔子辣根过氧化物酶(HRP)缀合的次级Ab(Abcam，ab6721)以MPBS稀释1:1000。然后将板在4℃孵育90min，用PBST洗涤四次，并且使用3,3’,5,5’,-四甲基联苯胺(TMB)(Sigma，T0440-100ML)显影。在Perkin Elmer多模式读板器(Corning)上读取650nm处的OD。使用Kaleido

在一个实施方式中，突变体H3L蛋白包括以下突变：I14A、D15A、R16A、K33A、F34A、D35A、K38A、N40A、E45A、V52A、E131A、T134A、F135A、L136A、R137A、R154A、E155A、I156A、K161A、L166A、V167A、M168A、I198A、R227A、E250A、K253A、P254A、N255A和F256A。SEQ ID NO:1中显示了突变体H3L氨基酸序列的示例。

实施例4

对于每个修饰的蛋白质，将含有蛋白质天然启动子，ORF(具有在位置上的突变)和近似～250bp的侧翼区用于同源重组为VV基因组中的合适的基因的DNA片段通过GENEWIZ合成并且克隆至pUC57-Amp质粒中。对于所有四个构建体，在VV p7.5启动子控制下并且在LoxP位点侧翼的绿色荧光蛋白(GFP)表达盒被插入到右侧翼序列之前的终止密码子下游临近(图3)。从GFP盒表达的荧光标记用于筛选经历同源重组的克隆，并且使用LoxP位点去除GFP。将pUC57-Amp质粒转染入CV-1细胞中，并且允许与VV基因组重组。从GFP盒表达的荧光标记用于筛选经历同源重组(HR)的克隆，并且使用LoxP位点去除GFP。通过PCR验证正确的基因插入VV基因组中。从L1R质粒开始，其次是A27L、D8L和最后是H3L，一次将质粒转染为用VV感染的CV-1细胞中。添加每种质粒后，进行几轮筛选和纯化，然后进行PCR和测序，以确保存在正确的突变。在与下一个质粒重组之前，先去除GFP。最终的变体含有所有四种蛋白质中的修饰。

合成的H3L构建体中的核苷酸置换产生以下氨基酸突变：I14A、D15A、R16A、K38A、P44A、E45A、V52A、E131A、T134A、L136A、R137A、R154A、E155A、I156A、M168A、I198A、E250A、K253A、P254A、N255A和F256A。在SEQ ID NO:11中显示了突变体H3L氨基酸序列。在SEQ IDNO:12显示这种突变的H3L基因的核苷酸序列，其含有左翼区域、启动子区域、p7.5启动子、LoxP、GFP、LoxP和右翼区域。

合成的D8L构建体中的核苷酸置换产生以下氨基酸突变：R44A、K48A、K98A、K108A、K117A和R220A。在SEQ ID NO:2中显示了突变体D8L氨基酸序列。在SEQ ID NO:13中显示了这种突变的D8L基因的核苷酸序列，其含有左翼区域、启动子区域、p7.5启动子、LoxP、GFP、LoxP和右翼区域。

合成的A27L构建体中的核苷酸置换产生以下氨基酸突变：K27A、A30D、R32A、E33A、A34D、I35A、V36A、K37A、D39A、E40A、R107A、P108A和Y109A。在SEQ ID NO:3中显示了突变体A27L氨基酸序列。在SEQ ID NO:14中显示了这种突变的A27L基因的核苷酸序列，其含有左翼区域、启动子区域、p7.5启动子、LoxP、GFP、LoxP和右翼区域。

合成的L1R构建体中的核苷酸置换产生以下氨基酸突变：E25A、N27A、Q31A、T32A、K33A、D35A、S58A、D60A、D62A、K125A和K127A。在SEQ ID NO:4中显示了突变体L1R氨基酸序列。在SEQ ID NO:15中显示了这种突变的L1R基因的核苷酸序列，其含有左翼区域、启动子区域、p7.5启动子、LoxP、GFP、LoxP和右翼区域。

实施例5

研究了抗VV多克隆Ab中和逃逸变体的能力。一组由ab35219(Abcam)、ab21039(Abcam)、ab26853(Abcam)、9503-2057(Bio-Rad)和PA1-7258(Invitrogen)组成的抗VV Ab用于测试体外的中和逃逸。兔子多克隆IgG ab37415(Abcam)用作对照。将CV-1细胞接种入12-孔板中，并且在达到融合的2天内使用。在2％的无菌小兔补体存在的情况下，在37℃用逃逸变体或对照VV以1×10

进行了重组病毒复制测定(图7)。在24-孔板中，将CV-1细胞用MOV＝0.05的VV对照、VVNEV和VVEM的复制品感染。感染之前，将病毒与Ab 9503-2057(40μg/mL)在37℃预孵育1小时。在24、48和72小时收集样品，并且在每个时间点确定滴度。与几乎完全灭活的对照Ab相比，重组病毒在Ab存在的情况下明显更有效的复制。

评估了重组病毒的抗肿瘤效率(图8)。重组病毒和对照VV与Ab9503-2057(参见上文)预孵育，并且用于以MOI＝1感染转化的细胞。将细胞孵育48小时，并且通过MTS测定(细胞代谢活性的比色评估)测量细胞活力。简言之，将在48小时收集的细胞用PBST洗涤一次，并且以1×105细胞/mL再悬浮在完全DMEM中。将每种细胞悬液的100μL添加至96-孔(一式三份)。将20μl的

实施例6

为了鉴定任何另外的关键NAb表位残基，选择了抵抗由ab35219和ab21039中和的VV突变体。简言之，在乙基甲磺酸酯(EMS)存在的情况下，从用VV的Western Reserve菌株感染的CV-1细胞制备突变体VV的原液，以诱导病毒DNA中的过渡突变。然后将多克隆抗VVab35219和ab21039用于中和突变的病毒。EMS在培养基中以500μg/mL存在。将突变的病毒原液与两种多克隆Ab各自以50μg/ml的混合物(总浓度10050μg/ml)孵育1小时，并且然后用于感染铺在12-孔板中的CV-1细胞。2小时后，去除接种物，并且将新鲜的完全DMEM添加至细胞中。然后将细胞在37℃，5％CO

实施例7

制备新的重组VV以并入以上鉴定的突变。另外，对蛋白质的结构分析还鉴定了另外的残基，其未被肽阵列或EM测序鉴定，但与已鉴定的残基相邻，并且在Ab相互作用中起作用。那些残基也包括在设计中。对于每个修饰的蛋白质，将含有蛋白质天然启动子、ORF(具有在位置上的突变)和近似～250bp的侧翼区用于同源重组为VV基因组中的合适的基因的DNA片段通过GENEWIZ合成并且克隆至pUC57-Amp质粒中。对于所有四个构建体，在VV p7.5启动子控制下并且在LoxP位点侧翼的绿色荧光蛋白(GFP)表达盒被插入到右侧翼序列之前的终止密码子下游紧邻(图3)。从GFP盒表达的荧光标记用于筛选经历同源重组的克隆，并且使用LoxP位点去除GFP。将pUC57-Amp质粒转染入CV-1细胞中，并且允许与VV基因组重组。从GFP盒表达的荧光标记用于筛选经历同源重组(HR)的克隆，并且使用LoxP位点去除GFP。通过PCR验证正确的基因插入VV基因组中。从L1R质粒开始，其次是A27L、D8L和最后是H3L，一次将质粒转染为用VV感染的CV-1细胞中。添加每种质粒后，进行几轮筛选和纯化，然后进行PCR和测序，以确保存在正确的突变。在与下一个质粒重组之前，先去除GFP。最终的变体含有所有四种蛋白质中的修饰。

合成的H3L构建体中的核苷酸置换产生以下氨基酸突变：I14A、D15A、R16A、K33A、F34A、D35A、K38A、N40A、P44A、E45A、V52A、E131A、D132A、T134A、F135A、L136A、R137A、R154A、E155A、I156A、K161A、L166A、V167A、M168A、E195A、I198A、V199A、R227A、E250A、N251A、M252A、K253A、P254A、N255A、F256A、S258A、T262P、A264T、K266I、Y268C、M272K、Y273N、F275N和T277A。在SEQ ID NO:170中显示了突变体H3L氨基酸序列。在SEQ ID NO:171显示了这种突变的H3L基因的核苷酸序列，其含有左翼区域、启动子区域、p7.5启动子、LoxP、GFP、LoxP和右翼区域。

合成的D8L构建体中的核苷酸置换产生以下氨基酸突变：V43A、R44A、K48A、S53A、G54A、G55A、K98A、K108A、K109A、A144G、T168A、S177A、L196A、F199A、L203A、N207A、P212A、N218A、R220A、P222A和D227A。在SEQ ID NO:172中显示了突变体D8L氨基酸序列。在SEQ IDNO:173中显示了这种突变的D8L基因的核苷酸序列，其含有左翼区域、启动子区域、p7.5启动子、LoxP、GFP、LoxP和右翼区域。

合成的A27L构建体中的核苷酸置换产生以下氨基酸突变：K27A、A30D、R32A、E33A、A34D、I35A、V36A、K37A、D39A、E40A、R107A、P108A和Y109A。在SEQ ID NO:3中显示了突变体A27L氨基酸序列。在SEQ ID NO:14中显示了这种突变的A27L基因的核苷酸序列，其含有左翼区域、启动子区域、p7.5启动子、LoxP、GFP、LoxP和右翼区域。

合成的L1R构建体中的核苷酸置换产生以下氨基酸突变：E25A、N27A、Q31A、T32A、K33A、D35A、S58A、D60A、D62A、K125A和K127A。在SEQ ID NO:4中显示了突变体L1R氨基酸序列。在SEQ ID NO:15中显示了这种突变的L1R基因的核苷酸序列，其含有左翼区域、启动子区域、p7.5启动子、LoxP、GFP、LoxP和右翼区域。

实施例8

研究了抗VV多克隆Ab中和逃逸变体的能力。抗VV Ab 9503-2057(Bio-Rad)和PA1-7258(Invitrogen)用于测试体外中和逃逸。兔子多克隆IgG ab37415(Abcam)用作对照。将CV-1细胞接种入12-孔板中，并且在达到融合的2天内使用。在2％的无菌小兔补体存在的情况下，在37℃将逃逸变体或对照VV以1×10

实施例9

产生溶瘤牛痘病毒(VV)构建体CD55-NEV至人CD55细胞外结构域。优化且合成了融合至VV A27的人CD55细胞外结构域，并且将其克隆至pMS穿梭质粒中(图11)。通过将一个版本的pMS穿梭质粒重组至WR牛痘病毒(WR VV)或NEV的TK基因中，产生了表达CD55-A27的牛痘病毒(Western Reserve菌株)。插入的CD55和A27在原始A27启动子的转录控制下表达。为了构建重组病毒CD55-NEV，将穿梭载体pMS转染至CV-1或293细胞中。然后用WR VV或NEV以0.1的感染复数(MOI)感染细胞。在三轮噬菌斑选择和扩增以确认CD55的表达后，选择相应的克隆之一用于扩增和纯化。

在一个实施方式中，在SEQ ID NO:7中显示了包括CD55-A27融合体的氨基酸序列。在SEQ ID NO:16中显示了含有信号肽、CD55、A27和接头序列的CD55-A27的优化核苷酸序列的示例。

实施例10

首先研究了CD55-VV逃逸补体-介导的中和的能力。为此，将CV-1细胞接种入12-孔板中，并且在达到融合的2天内使用。在1:10人补体存在的情况下，在300μL培养基中在37℃/5％CO

进一步研究了CD55-NEV逃逸抗VV多克隆Ab的补体中和的能力。两种抗VV Ab，9503-2057(Bio-Rad)和PA1-7258(Invitrogen)用于测试体外中和逃逸。将CV-1细胞接种入12-孔板中，并且在达到融合的2天内使用。在1:10人补体存在的情况下，将40μg/mL的Ab与CD55-NEV或对照VV以1×10

实施例11

产生溶瘤牛痘病毒(VV)构建体FAP-TEA-NEV以表达靶向癌症相关成纤维细胞(CAF)上的FAP和T细胞上CD3的双特异性FAP-CD3 scFv。优化且合成了双特异性FAP-CD3scFv，并且将其克隆至pMS穿梭质粒中(图14)。先前通过从免疫FAP/敲除小鼠的噬菌体展示产生了mhFAP-交叉反应性单链可变片段(scFv MO36)。人CD3 scFv衍生自OKT3克隆。通过将一个版本的pMS穿梭质粒重组至WR VV或NEV的TK基因中，产生了表达分泌性双特异性FAP-CD3 scFv(FAP-TEA-NEV)的牛痘病毒(Western Reserve菌株)。插入的双特异性FAP-CD3scFv在F17R晚期启动子的转录控制下表达，以允许在T-细胞激活之前足够的病毒复制。为了构建重组病毒BCMA-TEA-NEV，将穿梭载体pMS转染至CV-1或293细胞中。然后用WR VV或NEV以0.1的感染复数(MOI)感染细胞。在三轮噬菌斑选择和扩增以确认FAP-CD3的表达后，选择相应的克隆之一用于扩增和纯化。

在一个实施方式中，在SEQ ID NO:8中显示了包括FAP-CD3多肽的氨基酸序列。在SEQ ID NO:17中显示了含有信号肽、FAP scFv、CD3scFv和接头序列的FAP-CD3多肽的优化核苷酸序列的示例。

实施例12

研究了FAP-TEA-NEV的肿瘤溶解能力。将FAP阳性U87肿瘤细胞以每孔5x10e4的细胞数量接种至96孔板中。然后用FAP-TEA-NEV或NEV以MOI 1感染U87肿瘤细胞，并且与人T细胞以U87:T＝1:5的比例共培养。48小时后，在显微镜下观察细胞。显微镜照片显示，与NEV相比，FAP-TEA-VV有效诱导U87肿瘤细胞溶解和人T细胞增殖(图15)。细胞用凋亡标记物PI染色，并且流动分析结果显示，FAP-TEA-VV比NEV更有效地诱导U87肿瘤细胞凋亡(图16)。图17显示了门控U87肿瘤细胞的PI染色的MFI。

还研究了FAP-TEA-NEV诱导旁观者肿瘤溶解的能力。用FAP-TEA-VV以MOI 1感染CV-1细胞，并且在24小时收集细胞培养基，并且以U87:T＝1:5的比例添加至FAP阳性U87肿瘤细胞和人T细胞的共培养物中。将U87肿瘤细胞以每孔5x10e4的细胞数量接种至96孔板中。48小时后，在显微镜下观察细胞。显微镜照片显示，与NEV相比，FAP-TEA-VV有效诱导U87肿瘤细胞裂解和人T细胞增殖(图18)。

实施例13

产生溶瘤牛痘病毒(VV)构建体BCMA-TEA-NEV以表达靶向多发性骨髓瘤上的BCMA和T细胞上的CD3的双特异性BCMA-CD3 scFv。优化且合成了双特异性BCMA-CD3 scFv，并且将其克隆至pMS穿梭质粒中(图19)。BCMA scFV衍生自C11D5.3克隆(US9034324B2)。人CD3scFv衍生自OKT3克隆。通过将一个版本的pMS穿梭质粒重组至WR牛痘病毒(WR VV)或NEV的TK基因中，产生了表达分泌双特异性BCMA-CD3scFv(BCMA-TEA-NEV)的牛痘病毒(WesternReserve菌株)。插入的双特异性BCMA-CD3 scFv在F17R晚期启动子的转录控制下表达，以允许在T-细胞激活之前足够的病毒复制。为了构建重组病毒BCMA-TEA-NEV，将穿梭载体pMS转染至CV-1或293细胞中。然后用WR VV或NEV以0.1的感染复数(MOI)感染细胞。在三轮噬菌斑选择和扩增以确认BCMA-CD3的表达后，选择相应的克隆之一用于扩增和纯化。

在一个实施方式中，在SEQ ID NO:9中显示了包括BCMA-CD3scFv的氨基酸序列。在SEQ ID NO:18中显示了含有信号肽、BCMA scFv、CD3 scFv和接头序列的BCMA-CD3 scFv的显示优化核苷酸序列的示例。

实施例14

用BCMA-TEA-NEV或对照NEV以MOI 2感染BCMA阳性RPMI-8226MM细胞系。24小时后，将病毒感染的RPMI-8226细胞与Jurkat T细胞(Invivogen)以Jurkat T:RPMI-8226＝2:1的比例共培养。孵育24小时后，收集细胞用于计数细胞数量和细胞群的流动分析。细胞群的流动分析表明Jurkat T细胞被BCMA-CD3显著激活(图20A)。图20B显示了RPMI-8266MM细胞和激活的Jurkat T细胞的细胞数量。结果表明，与NEV对照相比，BCMA-TEA-NEV显著诱导Jurkat T细胞激活和RPMI-8266MM细胞溶解。

在以上实验中，孵育24小时后，收集细胞以通过ELISA测量细胞因子IFNγ(图21A)和IL2(图21B)分泌。结果表明，与NEV对照相比，BCMA-TEA-NEV显著诱导Jurkat T细胞表达IFNγ和IL2。

实施例15

产生溶瘤牛痘病毒(VV)构建体PD-1-ED-hIgG1-Fc-NEV以表达具有融合至免疫球蛋白-G1的恒定(Fc)结构域(IgG1)的PD-1的细胞外结构域的重组蛋白质。FAP-CD3是靶向癌症相关成纤维细胞上的成纤维细胞激活蛋白和T细胞上的CD3的双特异性分子。优化且合成了PD-1-ED-hIgG1-Fc，并且将其克隆到pMS穿梭质粒中(图22)。通过将一个版本的pMS穿梭质粒重组至WR牛痘病毒(WR VV)或NEV的TK基因中产生了表达分泌性PD-1-ED-hIgG1-Fc(PD-1-ED-hIgG1-Fc-NEV)或共同表达分泌性PD-1-ED-hIgG1-Fc和FAP-CD3(PD-1-ED-hIgG1-Fc-FAP-TEA-NEV)的牛痘病毒(Western Reserve菌株)。插入的PD-1-ED-hIgG1-Fc在pSE/L启动子的转录控制下表达。插入的FAP-CD3在F17R晚期启动子的转录控制下表达，以允许在T-细胞激活之前足够的病毒复制。为了构建重组病毒PD-1-ED-hIgG1-Fc-NEV或PD-1-ED-hIgG1-Fc-FAP-TEA-NEV，将穿梭载体pMS转染至CV-1或293细胞中。然后用WR VV或NEV以0.1的感染复数(MOI)感染细胞。在三轮噬菌斑选择和扩增以确认PD-1-ED-hIgG1-Fc或FAP-CD3的表达后，选择相应的克隆之一用于扩增和纯化。

在一个实施方式中，在SEQ ID NO:10中显示了包括PD-1-ED-hIgG1-Fc的氨基酸序列。在SEQ ID NO:19中显示了含有信号肽、PD-1细胞外结构域、人IgG1铰接和Fc结构域的PD-1-ED-hIgG1-Fc的优化核苷酸序列的示例。

实施例16

用PD1ED-NEV或对照NEV以MOI 2感染稳定的PD-L1-Raji(Invivogen)细胞系。24小时后，将病毒感染PD-L1-Raji细胞与NFAT-CD16-Luc报告Jurkat T细胞(Invivogen)以Jurkat T:PD-L1-Raji＝2:1的比例共培养。为了研究分泌的PD-1-ED-Fc的作用，用以MOI2的BCMA-TEA-NEV感染CV-1细胞，并且在24小时后收集细胞培养基并且将其添加至Raji和Jurkat T细胞的共培养物中。孵育24小时后，收集细胞用于流动分析(图23A)并且计数(图23B)。结果表明，与对照组相比，分泌的PD-1-ED-Fc有效地诱导Raji细胞溶解。PD-1-ED-Fc还诱导显著的Jurkat T细胞耗竭(图19B)。Raji的NEV感染可能没有影响，因为Raji对VV感染不敏感。在以上实验中，孵育24小时后，收集细胞用于通过ELISA测量细胞因子IFNγ(图24A)和IL2(图24B)的分泌。结果表明，与NEV对照相比，分泌的PD1ED显著诱导Jurkat T细胞的IFNγ和IL2表达。

在另一实验中，用PD1ED-NEV或对照NEV以MOI 2感染稳定的PD-L1-Raji(Invivogen)细胞系。24小时后，病毒感染的PD-L1-Raji细胞与NFAT-CD16-Luc报告JurkatT细胞(Invivogen)以Jurkat T:PD-L1-Raji＝2:1的比例共培养。为了研究分泌的PD-1-ED-Fc的作用，用以MOI 2的BCMA-TEA-NEV感染CV-1细胞，并且在24小时后收集细胞培养基并且将其添加至Raji和Jurkat T细胞的共培养物。孵育6小时后，收集上清液用于荧光素酶测量(图25)。结果表明，与对照NEV或培养基相比，分泌的PD-1-ED-Fc有效激活Jurkat T细胞。

序列表

<110> 艾赛澳克莱克斯疗法有限责任公司

<120> 突变体牛痘疫苗及其用途

<130> 190011001PCT

<160> 174

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:1, 突变体H3L氨基酸序列

<400> 1

Met Ala Ala Ala Lys Thr Pro Val Ile Val Val Pro Val Ala Ala Ala

1 5 10 15

Leu Pro Ser Glu Thr Phe Pro Asn Val His Glu His Ile Asn Asp Gln

20 25 30

Ala Ala Ala Asp Val Ala Asp Ala Glu Val Met Ala Ala Lys Arg Asn

35 40 45

Val Val Val Ala Lys Asp Asp Pro Asp His Tyr Lys Asp Tyr Ala Phe

50 55 60

Ile Gln Trp Thr Gly Gly Asn Ile Arg Asn Asp Asp Lys Tyr Thr His

65 70 75 80

Phe Phe Ser Gly Phe Cys Asn Thr Met Cys Thr Glu Glu Thr Lys Arg

85 90 95

Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Leu Trp Asp Ser Asn Phe Phe Thr Glu

100 105 110

Leu Glu Asn Lys Lys Val Glu Tyr Val Val Ile Val Glu Asn Asp Asn

115 120 125

Val Ile Ala Ala Ile Ala Phe Leu Ala Pro Val Leu Lys Ala Met His

130 135 140

Asp Lys Lys Ile Asp Ile Leu Gln Met Ala Glu Ala Ile Thr Gly Asn

145 150 155 160

Ala Val Lys Thr Glu Ala Ala Ala Asp Lys Asn His Ala Ile Phe Thr

165 170 175

Tyr Thr Gly Gly Tyr Asp Val Ser Leu Ser Ala Tyr Ile Ile Arg Val

180 185 190

Thr Thr Ala Leu Asn Ile Ala Asp Glu Ile Ile Lys Ser Gly Gly Leu

195 200 205

Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Glu Ile Ala Arg Ile Glu Asn Glu Met Lys

210 215 220

Ile Asn Ala Gln Ile Leu Asp Asn Ala Ala Lys Tyr Val Glu His Asp

225 230 235 240

Pro Arg Leu Val Ala Glu His Arg Phe Ala Asn Met Ala Ala Ala Ala

245 250 255

Trp Ser Arg Ile Gly Thr Ala Ala Thr Lys Arg Tyr Pro Gly Val Met

260 265 270

Tyr Ala Phe Thr Thr Pro Leu Ile Ser Phe Phe Gly Leu Phe Asp Ile

275 280 285

Asn Val Ile Gly Leu Ile Val Ile Leu Phe Ile Met Phe Met Leu Ile

290 295 300

Phe Asn Val Lys Ser Lys Leu Leu Trp Phe Leu Thr Gly Thr Phe Val

305 310 315 320

Thr Ala Phe Ile

<210> 2

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:2, 突变体D8L氨基酸序列

<400> 2

Met Pro Gln Gln Leu Ser Pro Ile Asn Ile Glu Thr Lys Lys Ala Ile

1 5 10 15

Ser Asn Ala Arg Leu Lys Pro Leu Asp Ile His Tyr Asn Glu Ser Lys

20 25 30

Pro Thr Thr Ile Gln Asn Thr Gly Ala Leu Val Ala Ile Asn Phe Ala

35 40 45

Gly Gly Tyr Ile Ser Gly Gly Phe Leu Pro Asn Glu Tyr Val Leu Ser

50 55 60

Ser Leu His Ile Tyr Trp Gly Lys Glu Asp Asp Tyr Gly Ser Asn His

65 70 75 80

Leu Ile Asp Val Tyr Lys Tyr Ser Gly Glu Ile Asn Leu Val His Trp

85 90 95

Asn Ala Lys Lys Tyr Ser Ser Tyr Glu Glu Ala Ala Lys His Asp Asp

100 105 110

Gly Leu Ile Ile Ile Ser Ile Phe Leu Gln Val Leu Asp His Lys Asn

115 120 125

Val Tyr Phe Gln Lys Ile Val Asn Gln Leu Asp Ser Ile Arg Ser Ala

130 135 140

Asn Thr Ser Ala Pro Phe Asp Ser Val Phe Tyr Leu Asp Asn Leu Leu

145 150 155 160

Pro Ser Lys Leu Asp Tyr Phe Thr Tyr Leu Gly Thr Thr Ile Asn His

165 170 175

Ser Ala Asp Ala Val Trp Ile Ile Phe Pro Thr Pro Ile Asn Ile His

180 185 190

Ser Asp Gln Leu Ser Lys Phe Arg Thr Leu Leu Ser Ser Ser Asn His

195 200 205

Asp Gly Lys Pro His Tyr Ile Thr Glu Asn Tyr Ala Asn Pro Tyr Lys

210 215 220

Leu Asn Asp Asp Thr Gln Val Tyr Tyr Ser Gly Glu Ile Ile Arg Ala

225 230 235 240

Ala Thr Thr Ser Pro Ala Arg Glu Asn Tyr Phe Met Arg Trp Leu Ser

245 250 255

Asp Leu Arg Glu Thr Cys Phe Ser Tyr Tyr Gln Lys Tyr Ile Glu Glu

260 265 270

Asn Lys Thr Phe Ala Ile Ile Ala Ile Val Phe Val Phe Ile Leu Thr

275 280 285

Ala Ile Leu Phe Phe Met Ser Arg Arg Tyr Ser Arg Glu Lys Gln Asn

290 295 300

<210> 3

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:3, 突变体A27L氨基酸序列

<400> 3

Met Asp Gly Thr Leu Phe Pro Gly Asp Asp Asp Leu Ala Ile Pro Ala

1 5 10 15

Thr Glu Phe Phe Ser Thr Lys Ala Ala Lys Ala Pro Glu Asp Lys Ala

20 25 30

Ala Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Asp Asn Glu Glu Thr Leu Lys

35 40 45

Gln Arg Leu Thr Asn Leu Glu Lys Lys Ile Thr Asn Val Thr Thr Lys

50 55 60

Phe Glu Gln Ile Glu Lys Cys Cys Lys Arg Asn Asp Glu Val Leu Phe

65 70 75 80

Arg Leu Glu Asn His Ala Glu Thr Leu Arg Ala Ala Met Ile Ser Leu

85 90 95

Ala Lys Lys Ile Asp Val Gln Thr Gly Arg Ala Ala Ala Glu

100 105 110

<210> 4

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:4, 突变体L1R氨基酸序列

<400> 4

Met Gly Ala Ala Ala Ser Ile Gln Thr Thr Val Asn Thr Leu Ser Glu

1 5 10 15

Arg Ile Ser Ser Lys Leu Glu Gln Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala

20 25 30

Ala Cys Ala Ile Glu Ile Gly Asn Phe Tyr Ile Arg Gln Asn His Gly

35 40 45

Cys Asn Leu Thr Val Lys Asn Met Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln

50 55 60

Leu Asp Ala Val Leu Ser Ala Ala Thr Glu Thr Tyr Ser Gly Leu Thr

65 70 75 80

Pro Glu Gln Lys Ala Tyr Val Pro Ala Met Phe Thr Ala Ala Leu Asn

85 90 95

Ile Gln Thr Ser Val Asn Thr Val Val Arg Asp Phe Glu Asn Tyr Val

100 105 110

Lys Gln Thr Cys Asn Ser Ser Ala Val Val Asp Asn Ala Leu Ala Ile

115 120 125

Gln Asn Val Ile Ile Asp Glu Cys Tyr Gly Ala Pro Gly Ser Pro Thr

130 135 140

Asn Leu Glu Phe Ile Asn Thr Gly Ser Ser Lys Gly Asn Cys Ala Ile

145 150 155 160

Lys Ala Leu Met Gln Leu Thr Thr Lys Ala Thr Thr Gln Ile Ala Pro

165 170 175

Lys Gln Val Ala Gly Thr Gly Val Gln Phe Tyr Met Ile Val Ile Gly

180 185 190

Val Ile Ile Leu Ala Ala Leu Phe Met Tyr Tyr Ala Lys Arg Met Leu

195 200 205

Phe Thr Ser Thr Asn Asp Lys Ile Lys Leu Ile Leu Ala Asn Lys Glu

210 215 220

Asn Val His Trp Thr Thr Tyr Met Asp Thr Phe Phe Arg Thr Ser Pro

225 230 235 240

Met Val Ile Ala Thr Thr Asp Met Gln Asn

245 250

<210> 5

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:5, 突变体H3L氨基酸序列

<400> 5

Met Ala Ala Ala Lys Thr Pro Val Ile Val Val Pro Val Ile Asp Arg

1 5 10 15

Leu Pro Ser Glu Thr Phe Pro Asn Val His Glu His Ile Asn Asp Gln

20 25 30

Lys Phe Asp Asp Val Lys Asp Asn Glu Val Met Ala Glu Lys Arg Asn

35 40 45

Val Val Val Val Lys Asp Asp Pro Asp His Tyr Lys Asp Tyr Ala Phe

50 55 60

Ile Gln Trp Thr Gly Gly Asn Ile Arg Asn Asp Asp Lys Tyr Thr His

65 70 75 80

Phe Phe Ser Gly Phe Cys Asn Thr Met Cys Thr Glu Glu Thr Lys Arg

85 90 95

Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Leu Trp Asp Ser Asn Phe Phe Thr Glu

100 105 110

Leu Glu Asn Lys Lys Val Glu Tyr Val Val Ile Val Glu Asn Asp Asn

115 120 125

Val Ile Glu Asp Ile Thr Phe Leu Arg Pro Val Leu Lys Ala Met His

130 135 140

Asp Lys Lys Ile Asp Ile Leu Gln Met Arg Glu Ile Ile Thr Gly Asn

145 150 155 160

Lys Val Lys Thr Glu Leu Val Met Asp Lys Asn His Ala Ile Phe Thr

165 170 175

Tyr Thr Gly Gly Tyr Asp Val Ser Leu Ser Ala Tyr Ile Ile Arg Val

180 185 190

Thr Thr Ala Leu Asn Ile Val Asp Glu Ile Ile Lys Ser Gly Gly Leu

195 200 205

Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Glu Ile Ala Arg Ile Glu Asn Glu Met Lys

210 215 220

Ile Asn Arg Gln Ile Leu Asp Asn Ala Ala Lys Tyr Val Glu His Asp

225 230 235 240

Pro Arg Leu Val Ala Glu His Arg Phe Gly Trp Met Lys Pro Asn Phe

245 250 255

Trp Phe Arg Ile Gly Pro Ala Thr Val Ile Arg Cys Pro Gly Val Lys

260 265 270

Asn Ala Asn Thr Ala Pro Leu Ile Ser Phe Phe Gly Leu Phe Asp Ile

275 280 285

Asn Val Ile Gly Leu Ile Val Ile Leu Phe Ile Met Phe Met Leu Ile

290 295 300

Phe Asn Val Lys Ser Lys Leu Leu Trp Phe Leu Thr Gly Thr Phe Val

305 310 315 320

Thr Ala Phe Ile

<210> 6

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变体D8L氨基酸序列 (该序列的取代:序列号174 –仅位置43处不同)

<400> 6

Met Pro Gln Gln Leu Ser Pro Ile Asn Ile Glu Thr Lys Lys Ala Ile

1 5 10 15

Ser Asn Ala Arg Leu Lys Pro Leu Asp Ile His Tyr Asn Glu Ser Lys

20 25 30

Pro Thr Thr Ile Gln Asn Thr Gly Lys Leu Phe Trp Ile Asn Phe Lys

35 40 45

Gly Gly Tyr Ile Ser Gly Trp Phe Leu Pro Asn Glu Tyr Val Leu Ser

50 55 60

Ser Leu His Ile Tyr Trp Gly Lys Glu Asp Asp Tyr Gly Ser Asn His

65 70 75 80

Leu Ile Asp Val Tyr Lys Tyr Ser Gly Glu Ile Asn Leu Val His Trp

85 90 95

Asn Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Tyr Glu Glu Ala Lys Lys His Asp Asp

100 105 110

Gly Leu Ile Ile Ile Ser Ile Phe Leu Gln Val Leu Asp His Lys Asn

115 120 125

Val Tyr Phe Gln Lys Ile Val Asn Gln Leu Asp Ser Ile Arg Ser Thr

130 135 140

Asn Thr Ser Ala Pro Phe Asp Ser Val Phe Tyr Leu Asp Asn Leu Leu

145 150 155 160

Pro Ser Lys Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr Leu Gly Thr Thr Ile Asn His

165 170 175

Tyr Ala Asp Ala Val Trp Ile Ile Phe Pro Thr Pro Ile Asn Ile His

180 185 190

Ser Asp Gln Leu Ser Lys Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Ser Ser Asn His

195 200 205

Asp Gly Lys Thr His Tyr Ile Thr Glu Cys Tyr Arg Asn Leu Tyr Lys

210 215 220

Leu Asn Gly Asp Thr Gln Val Tyr Tyr Ser Gly Glu Ile Ile Arg Ala

225 230 235 240

Ala Thr Thr Ser Pro Ala Arg Glu Asn Tyr Phe Met Arg Trp Leu Ser

245 250 255

Asp Leu Arg Glu Thr Cys Phe Ser Tyr Tyr Gln Lys Tyr Ile Glu Glu

260 265 270

Asn Lys Thr Phe Ala Ile Ile Ala Ile Val Phe Val Phe Ile Leu Thr

275 280 285

Ala Ile Leu Phe Phe Met Ser Arg Arg Tyr Ser Arg Glu Lys Gln Asn

290 295 300

<210> 7

<211> 375

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:7, CD55-A27氨基酸序列

<400> 7

Met Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala Leu

1 5 10 15

Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys Cys

20 25 30

Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile Cys

35 40 45

Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg Ser

50 55 60

Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro Tyr

65 70 75 80

Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu Cys

85 90 95

Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr Cys

100 105 110

Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys Lys

115 120 125

Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val Pro

130 135 140

Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly

145 150 155 160

Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly Ser

165 170 175

Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr Cys

180 185 190

Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg Asp

195 200 205

His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly Phe

210 215 220

Thr Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp Glu

225 230 235 240

Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu Cys Arg Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Gly Thr Leu Phe Pro

260 265 270

Gly Asp Asp Asp Leu Ala Ile Pro Ala Thr Glu Phe Phe Ser Thr Lys

275 280 285

Ala Ala Lys Ala Pro Glu Asp Lys Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ala Ala

290 295 300

Ala Asp Asp Asn Glu Glu Thr Leu Lys Gln Arg Leu Thr Asn Leu Glu

305 310 315 320

Lys Lys Ile Thr Asn Val Thr Thr Lys Phe Glu Gln Ile Glu Lys Cys

325 330 335

Cys Lys Arg Asn Asp Glu Val Leu Phe Arg Leu Glu Asn His Ala Glu

340 345 350

Thr Leu Arg Ala Ala Met Ile Ser Leu Ala Lys Lys Ile Asp Val Gln

355 360 365

Thr Gly Arg Ala Ala Ala Glu

370 375

<210> 8

<211> 526

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:8, FAP-CD3氨基酸序列

<400> 8

Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Glu Asn Ile Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Trp Phe His Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg His Gly Gly Thr Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gln Ile Leu Met Thr Gln Ser

145 150 155 160

Pro Ala Ser Ser Val Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys

165 170 175

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ala Tyr Ser Tyr Met His Trp

180 185 190

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala

195 200 205

Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala

225 230 235 240

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly

245 250 255

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp Asp Ile Lys

275 280 285

Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys

290 295 300

Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His

305 310 315 320

Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile

325 330 335

Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys

340 345 350

Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu

355 360 365

Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr

370 375 380

Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

385 390 395 400

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

405 410 415

Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala

420 425 430

Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val

435 440 445

Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg

450 455 460

Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe

465 470 475 480

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met

485 490 495

Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn

500 505 510

Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ser

515 520 525

<210> 9

<211> 515

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:9, BCMA-CD3 scFv氨基酸序列

<400> 9

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu

20 25 30

Ala Met Ser Leu Gly Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu

35 40 45

Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys

50 55 60

Pro Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln

65 70 75 80

Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly

130 135 140

Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu

145 150 155 160

Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly

165 170 175

Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly

180 185 190

Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro

195 200 205

Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr

210 215 220

Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp

225 230 235 240

Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

260 265 270

Val Asp Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro

275 280 285

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

290 295 300

Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu

305 310 315 320

Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln

325 330 335

Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr

340 345 350

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

355 360 365

Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly

370 375 380

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

385 390 395 400

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro

405 410 415

Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg

420 425 430

Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly

435 440 445

Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly

450 455 460

Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

465 470 475 480

Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

485 490 495

Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

500 505 510

Leu Lys Ser

515

<210> 10

<211> 402

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:10, PD-1-ED-hIgG1-Fc氨基酸序列

<400> 10

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Phe Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

165 170 175

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

180 185 190

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

195 200 205

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

210 215 220

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

225 230 235 240

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

245 250 255

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

260 265 270

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

275 280 285

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

290 295 300

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

305 310 315 320

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

325 330 335

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

340 345 350

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

355 360 365

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

370 375 380

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

385 390 395 400

Gly Lys

<210> 11

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:11, 突变体H3L氨基酸序列

<400> 11

Met Ala Ala Ala Lys Thr Pro Val Ile Val Val Pro Val Ala Ala Ala

1 5 10 15

Leu Pro Ser Glu Thr Phe Pro Asn Val His Glu His Ile Asn Asp Gln

20 25 30

Lys Phe Asp Asp Val Ala Asp Asn Glu Val Met Ala Ala Lys Arg Asn

35 40 45

Val Val Val Ala Lys Asp Asp Pro Asp His Tyr Lys Asp Tyr Ala Phe

50 55 60

Ile Gln Trp Thr Gly Gly Asn Ile Arg Asn Asp Asp Lys Tyr Thr His

65 70 75 80

Phe Phe Ser Gly Phe Cys Asn Thr Met Cys Thr Glu Glu Thr Lys Arg

85 90 95

Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Leu Trp Asp Ser Asn Phe Phe Thr Glu

100 105 110

Leu Glu Asn Lys Lys Val Glu Tyr Val Val Ile Val Glu Asn Asp Asn

115 120 125

Val Ile Ala Ala Ile Ala Phe Leu Ala Pro Val Leu Lys Ala Met His

130 135 140

Asp Lys Lys Ile Asp Ile Leu Gln Met Ala Glu Ala Ile Thr Gly Asn

145 150 155 160

Lys Val Lys Thr Glu Leu Val Ala Asp Lys Asn His Ala Ile Phe Thr

165 170 175

Tyr Thr Gly Gly Tyr Asp Val Ser Leu Ser Ala Tyr Ile Ile Arg Val

180 185 190

Thr Thr Ala Leu Asn Ile Ala Asp Glu Ile Ile Lys Ser Gly Gly Leu

195 200 205

Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Glu Ile Ala Arg Ile Glu Asn Glu Met Lys

210 215 220

Ile Asn Arg Gln Ile Leu Asp Asn Ala Ala Lys Tyr Val Glu His Asp

225 230 235 240

Pro Arg Leu Val Ala Glu His Arg Phe Ala Asn Met Ala Ala Ala Ala

245 250 255

Trp Ser Arg Ile Gly Thr Ala Ala Thr Lys Arg Tyr Pro Gly Val Met

260 265 270

Tyr Ala Phe Thr Thr Pro Leu Ile Ser Phe Phe Gly Leu Phe Asp Ile

275 280 285

Asn Val Ile Gly Leu Ile Val Ile Leu Phe Ile Met Phe Met Leu Ile

290 295 300

Phe Asn Val Lys Ser Lys Leu Leu Trp Phe Leu Thr Gly Thr Phe Val

305 310 315 320

Thr Ala Phe Ile

<210> 12

<211> 2548

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:12, 突变的H3L基因的核苷酸序列

<400> 12

gaagaactca tagatcacga acatgtgcaa tacaaaataa attgttacaa tattctaaga 60

tatcatttat tgccagacag tgacgtgttt gtatatttta gtaattcatt aaacagagaa 120

gcattggaat acgcatttta tatctttttg tcgaaatatg taaatgtgaa acaatggata 180

gacgaaaata taactcgtat taaagagttg tatatgatta atttcaataa ctaaatggcg 240

gcggcgaaaa ctcctgttat tttaatttat tatgatattt aaatatcgcc taatatggcg 300

gcggcgaaaa ctcctgttat tgttgtgcca gttgctgctg cacttccatc agaaacattt 360

cctaatgttc atgagcatat taatgatcag aagttcgatg atgtagcgga caacgaagtt 420

atggcagcaa aaagaaatgt tgtggtagcc aaggatgatc cagatcatta caaggattat 480

gcgtttatac agtggactgg aggaaacatt agaaatgatg acaagtatac tcacttcttt 540

tcagggtttt gtaacactat gtgtacagag gaaacgaaaa gaaatatcgc tagacattta 600

gccctatggg attctaattt ttttaccgag ttagaaaata aaaaggtaga atatgtagtt 660

attgtagaaa acgataacgt tattgcggct attgcgtttc ttgctcccgt cttgaaggca 720

atgcatgaca aaaaaataga tatcctacag atggcagaag ctattacagg caataaagtt 780

aaaaccgagc ttgtagcgga caaaaatcat gccatattca catatacagg agggtatgat 840

gttagcttat cagcctatat tattagagtt actacggcgc tgaacatcgc agatgaaatt 900

ataaagtctg gaggtctatc atcgggattt tattttgaaa tagccagaat tgaaaacgaa 960

atgaagatca ataggcagat actggataat gccgccaaat atgtagaaca cgatccccga 1020

cttgttgcag aacaccgttt cgcaaacatg gcagcggctg cttggtctag aataggaacg 1080

gcagctacta aacgttatcc aggagttatg tacgcgttta ctactccact gatttcattt 1140

tttggattgt ttgatattaa tgttataggt ttgattgtaa ttttgtttat tatgtttatg 1200

ctcatcttta acgttaaatc taaactgtta tggttcctta caggaacatt cgttaccgca 1260

tttatctaat aatccaaacc cacccgcttt ttatagtaag tttttcaccc ataaataata 1320

aatacaataa ttaatttctc gtaaaagtag aaaatatatt ctaatttatt gcacggtaag 1380

gaagtagatc ataactcgag ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttattactag 1440

cgctaccggt cgccaatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 1500

ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 1560

ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 1620

gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 1680

cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 1740

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 1800

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 1860

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 1920

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 1980

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 2040

ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 2100

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 2160

gagctgtaca agtaacttac tagcgctcaa taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt 2220

tattaataca ggaacattcg ttaccgcatt tatctaacac tattccatat tactaaaatc 2280

ggaacaccaa tgcggtgaca taaaataacc gctataacct aattcattta acatctcatt 2340

accacaagta ataacattat tagacttgtg ttttatcaaa tactgacaaa attgttgagc 2400

agatggatcg acctttgccg cctttttaac catccacgcg tctccagtac ctcgcctaat 2460

agcttgcggc agatatgttt tcttatccaa tcgcatagct ataaaatagg cgccgaaatc 2520

cacacatttg aattcgaata tatcatcc 2548

<210> 13

<211> 2467

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:13, 突变的D8L基因的核苷酸序列

<400> 13

agaatctgaa ttttgttgag ataatatcgc ctggaacgcg aatgaagttc ttctagctcc 60

tattaacgga tatccgtcac ttgttataca cgcagcaaac acgtgcgtgt cttttgatct 120

tggaatatct tttattcgtt taatagatat taattctcta ggagtttcaa atatcacttc 180

ctcatccatt gtaattccca tactaagagc tatttttaaa cagttatcat ttcattttta 240

ctatgccgca acaactatct cctattaaat agaaactatt aatttattat gatatttaaa 300

tatcgcctaa tatgccgcaa caactatctc ctattaatat agaaactaaa aaagcaattt 360

ctaacgcgcg attgaagccg ttagacatac attataatga gtcgaaacca accactatcc 420

agaacactgg agcactagta gcgattaatt ttgcaggagg atatataagt ggagggtttc 480

tccccaatga atatgtgtta tcatcactac atatatattg gggaaaggaa gacgattatg 540

gatccaatca cttgatagat gtgtacaaat actctggaga gattaatctt gttcattgga 600

atgcgaaaaa atatagttct tatgaagagg cagcaaaaca cgatgatgga cttatcatta 660

tttctatatt cttacaagta ttggatcata aaaatgtata ttttcaaaag atagttaatc 720

aattggattc cattagatcc gccaatacgt ctgcaccgtt tgattcagta ttttatctag 780

acaatttgct gcctagtaag ttggattatt ttacatatct aggaacaact atcaaccact 840

ctgcagacgc tgtatggata atttttccaa cgccaataaa cattcattct gatcaactat 900

ctaaattcag aacactattg tcgtcgtcta atcatgatgg aaaaccgcat tatataacag 960

agaactatgc aaatccgtat aaattgaacg acgacacgca agtatattat tctggggaga 1020

ttatacgagc agcaactacc tctccagcgc gcgagaacta ttttatgaga tggttgtccg 1080

atttgagaga gacatgtttt tcatattatc aaaaatatat cgaagagaat aaaacattcg 1140

caattattgc catagtattc gtgtttatac ttaccgctat tctctttttt atgagtcgac 1200

gatattcgcg agaaaaacaa aactagtaat ccaaacccac ccgcttttta tagtaagttt 1260

ttcacccata aataataaat acaataatta atttctcgta aaagtagaaa atatattcta 1320

atttattgca cggtaaggaa gtagatcata actcgagata acttcgtata atgtatgcta 1380

tacgaagtta ttactagcgc taccggtcgc caatggtgag caagggcgag gagctgttca 1440

ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg 1500

tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca 1560

ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc 1620

agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc 1680

ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc 1740

gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg 1800

acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca 1860

acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc 1920

acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg 1980

gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca 2040

aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga 2100

tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aacttactag cgctcaataa cttcgtataa 2160

tgtatgctat acgaagttat taaatagtat tcgtgtttat acttaccgct attctctttt 2220

ttatgagtcg acgatattcg cgagaaaaac aaaactagat tcgatacctt gttgagcctc 2280

cattagaacg gcagtgactt cgctgccatt gtcatacgca ttaccatttc gaaaaaagca 2340

gtactttgaa tcgctaaatg atacagtacc cgaatctcta cttagtttac agattaaatc 2400

tccacattga atagttacat ttgattcatc ttcgatgttt aatgttcctc tgactatatc 2460

cccaacg 2467

<210> 14

<211> 1897

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:14, 突变的A27L基因的核苷酸序列

<400> 14

aaaagtggag atgtgtggtt tatccaggaa acggttttgt atccgcttcc atatttggat 60

ttcaggcaga agttggaccc aataatacta gatccattag aaaatttaac acgatgcaac 120

aatgtataga ctttacattt tctgatgtta ttaacatcga tatttataat ccatgtgttg 180

taccaaatat aaataacgca gagtgtcagt ttctaaaatc tgtactttaa atggacggaa 240

ctcttttccc cggagatgac ttaatatttt gttaattaaa attatattta taaaatatta 300

tataataaat ggacggaact cttttccccg gagatgacga tcttgcaatt ccagcaactg 360

aatttttttc tacaaaggct gctaaagcgc cagaggataa agccgcagac gctgctgcag 420

ccgctgcaga cgacaatgag gaaactctca aacaacggct aactaatttg gaaaaaaaga 480

ttactaatgt aacaacaaag tttgaacaaa tagaaaagtg ttgtaaacgc aacgatgaag 540

ttctatttag gttggaaaat cacgctgaaa ctctaagagc ggctatgata tctctggcta 600

aaaagattga tgttcagact ggacgggccg cagctgagta ataatccaaa cccacccgct 660

ttttatagta agtttttcac ccataaataa taaatacaat aattaatttc tcgtaaaagt 720

agaaaatata ttctaattta ttgcacggta aggaagtaga tcataactcg agataacttc 780

gtataatgta tgctatacga agttattact agcgctaccg gtcgccaatg gtgagcaagg 840

gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg 900

gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc 960

tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc 1020

tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct 1080

tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg 1140

gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg 1200

agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca 1260

actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga 1320

acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc 1380

agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc 1440

agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg 1500

tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaatag actagcgctc 1560

aataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatgttca gactggacgg cgcccatatg 1620

agtaataact taactctttt gttaattaaa agtatattca aaaaatgagt tatataaatg 1680

gcgaacatta taaatttatg gaacggaatt gtaccaacgg ttcaagatgt taatgttgcg 1740

agcattactg cgtttaaatc tatgatagat gaaacatggg ataaaaaaat cgaagcaaat 1800

acatgcatca gtagaaaaca tagaaacatt attcacgaag ttattaggga ctttatgaaa 1860

gcctatccta aaatggatga gaataaaaaa tctccat 1897

<210> 15

<211> 2244

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:15, 突变的L1R基因的核苷酸序列

<400> 15

aatattgtac gatgtaatac tagcgtgaac aacttacaga tggataaaac ttcctcatta 60

agattgtcat gtggattaag caatagtgat agattttcta ctgttcccgt caatagagca 120

aaagtagttc aacataatat taaacactcg ttcgacctaa aattgcattt gatcagttta 180

ttatctctct tggtaatatg gatactaatt gtagctattt aaatgggtgc cgcggcaagc 240

ttaatatttt gttaattaaa attatattta taaaatatta tataataaat gggtgccgcg 300

gcaagcatac agacgacggt gaatacactc agcgaacgta tctcgtctaa attagaacaa 360

gcagcggctg ctagtgctgc agcagcatgt gctatagaaa tcggaaattt ttatatccga 420

caaaaccatg gatgtaacct cactgttaaa aatatgtgcg ctgcggccgc ggctgctcag 480

ttggatgctg tgttatcagc cgctacagaa acatatagtg gattaacacc ggaacaaaaa 540

gcatacgtgc cagctatgtt tactgctgcg ttaaacattc agacgagtgt aaacactgtt 600

gttagagatt ttgaaaatta tgtgaaacag acttgtaatt ctagcgcggt cgtcgataac 660

gcattagcga tacaaaacgt aatcatagat gaatgttacg gagccccagg atctccaaca 720

aatttggaat ttattaatac aggatctagc aaaggaaatt gtgccattaa ggcgttgatg 780

caattgacga ctaaggccac tactcaaata gcacctaaac aagttgctgg tacaggagtt 840

cagttttata tgattgttat cggtgttata atattggcag cgttgtttat gtactatgcc 900

aagcgtatgt tgttcacatc caccaatgat aaaatcaaac ttattttagc caataaggaa 960

aacgtccatt ggactactta catggacaca ttctttagaa cttctccgat ggttattgct 1020

accacggata tgcaaaactg ataatccaaa cccacccgct ttttatagta agtttttcac 1080

ccataaataa taaatacaat aattaatttc tcgtaaaagt agaaaatata ttctaattta 1140

ttgcacggta aggaagtaga tcataactcg agataacttc gtataatgta tgctatacga 1200

agttattagc gctaccggtc gccaatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 1260

gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 1320

gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 1380

aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 1440

agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 1500

tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 1560

gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 1620

gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 1680

atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 1740

gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 1800

cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 1860

aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 1920

ggcatggacg agctgtacaa gtaattgact agcgctcaat aacttcgtat aatgtatgct 1980

atacgaagtt atattgctac cacggatatg caaaactgaa aatatattga taatatttta 2040

atagattaac atggaagtta tcactgatcg tctagacgat atagtgaaac aaaatatagc 2100

ggatgaaaaa tttgtagatt ttgttataca cggtctagag catcaatgtc ctgctatact 2160

tcgaccatta attaggttgt ttattgatat actattattt gttatagtaa tttatatttt 2220

tacggtacgt ctagtaagta gaaa 2244

<210> 16

<211> 1131

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:16, CD55-A27的核苷酸序列

<400> 16

atggattgtg gactgccccc cgacgtccct aacgctcaac ccgctctgga aggcagaaca 60

tccttccccg aagacaccgt gatcacctac aagtgtgagg agagcttcgt caagatcccc 120

ggcgagaagg atagcgtcat ctgtctgaag ggaagccaat ggtccgacat cgaagagttc 180

tgcaacagaa gctgtgaggt gcctaccaga ctgaacagcg cttctctgaa gcagccttac 240

atcacccaga actacttccc cgtgggcacc gtggtggagt acgagtgcag acccggatac 300

agaagagagc cttctctgag ccccaagctg acatgcctcc agaacctcaa gtggagcacc 360

gctgtggagt tttgcaagaa gaagagctgc cccaatcccg gcgagattag aaacggccag 420

attgacgtgc ccggcggcat tctgtttggc gccaccatca gcttcagctg caacaccggc 480

tacaagctgt ttggaagcac cagctccttc tgtctgatca gcggctccag cgtccagtgg 540

agcgatcctc tgcccgagtg tagggagatc tactgccccg cccctcctca aatcgacaac 600

ggcattatcc aaggcgagag ggatcactac ggctatagac agagcgtcac ctacgcttgc 660

aacaagggat tcaccatgat cggcgagcac tccatctact gcacagtcaa caacgacgag 720

ggagaatgga gcggccctcc tcccgagtgt aggggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 780

agcggcggcg gcggcagcga cggaactctt ttccccggag atgacgatct tgcaattcca 840

gcaactgaat ttttttctac aaaggctgct aaagcgccag aggataaagc cgcagacgct 900

gctgcagccg ctgcagacga caatgaggaa actctcaaac aacggctaac taatttggaa 960

aaaaagatta ctaatgtaac aacaaagttt gaacaaatag aaaagtgttg taaacgcaac 1020

gatgaagttc tatttaggtt ggaaaatcac gctgaaactc taagagcggc tatgatatct 1080

ctggctaaaa agattgatgt tcagactgga cgggccgcag ctgagtaata a 1131

<210> 17

<211> 1581

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:17, FAP-CD3的核苷酸序列

<400> 17

atggactgga tctggcgcat cctcttcctc gtcggcgctg ctaccggcgc tcattctcag 60

gtgcagctga agcagtctgg agctgaactg gtgaaacccg gggcatcagt gaagctgtcc 120

tgcaagactt ctggctacac cttcactgaa aatattatac actgggtaaa gcagaggtct 180

gggcagggtc ttgagtggat tgggtggttt caccctggaa gtggtagtat aaagtacaat 240

gagaaattca aggacaaggc cacattgact gcggacaaat cctccagcac agtctatatg 300

gagcttagta gattgacatc tgaagactct gcggtctatt tctgtgcaag acacggagga 360

actgggcgag gagctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcgagtggt 420

ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc ggtagtgcac aaattctgat gacccagtct 480

cctgcttcct cagttgtatc tctggggcag agggccacca tctcatgcag ggccagcaaa 540

agtgtcagta catctgccta tagttatatg cactggtacc aacagaaacc aggacagcca 600

cccaaactcc tcatctatct tgcatccaac ctagaatctg gggtccctcc caggttcagt 660

ggcagtgggt ctgggacaga cttcaccctc aacatccacc ctgtggagga ggaggatgct 720

gcaacctatt actgtcagca cagtagggag cttccgtaca cgttcggagg ggggaccaag 780

ctggaaataa aacgggcggg atccggagga ggaggatctg gaggaggagg aagtggcggg 840

ggaggctcag tcgacgatat caagctgcag cagtctggag cagagctggc tagaccagga 900

gcatcagtga aaatgagctg taagacctcc ggctatacat tcactcgcta cacaatgcac 960

tgggtgaagc agcgacctgg gcagggactg gaatggatcg ggtacattaa tccaagcagg 1020

ggatacacca actacaacca gaagtttaaa gacaaggcta ctctgactac cgataagtca 1080

agctccaccg catacatgca gctgtctagt ctgacatcag aggacagcgc cgtgtactat 1140

tgcgctcgct actatgacga tcattattgt ctggattatt ggggacaggg gacaactctg 1200

acagtgtcaa gcggaggagg aggaagcgga ggaggcggct ccggcggagg aggctctgac 1260

atccagctga ctcagtctcc cgccattatg tcagcttccc ctggcgaaaa agtgaccatg 1320

acatgccggg cctcctctag tgtcagctat atgaactggt accagcagaa atccgggact 1380

tctccaaagc gatggatcta tgacacctct aaggtggcta gtggagtccc ctaccggttc 1440

tccggatctg gcagtgggac ttcatatagc ctgaccattt caagcatgga ggccgaagat 1500

gctgcaacct actattgtca gcagtggtcc tctaatcccc tgaccttcgg ggctgggact 1560

aaactggaac tgaaatcatg a 1581

<210> 18

<211> 1559

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:18, BCMA-CD3 scFv的核苷酸序列

<400> 18

atgctataaa tggctctgcc cgtgacagct ctgctgctcc ctctggctct gctgctgcat 60

gctgctaggc ccgacatcgt gctgacccag tcccctccta gcctcgccat gtctctggga 120

aagagagcca ccatcagctg tagagcctcc gaaagcgtga ccattctcgg cagccatctg 180

atccactggt atcagcagaa gcccggccaa ccccctacac tgctgatcca gctggccagc 240

aatgtgcaga ccggagtgcc cgctagattt tccggatccg gatccagaac cgactttaca 300

ctgaccatcg accccgtgga agaggacgac gtggccgtgt actactgtct gcagtctaga 360

accatcccca gaacattcgg cggaggcaca aagctggaga tcaagggctc cacaagcggc 420

agcggcaaac ccggcagcgg agagggcagc acaaagggcc aaatccagct ggtgcagagc 480

ggccccgaac tcaagaagcc cggagaaacc gtgaagatca gctgcaaggc ctccggctac 540

acattcaccg attactccat caattgggtc aagagggccc ccggcaaggg actgaagtgg 600

atgggctgga ttaataccga gacaagagag cccgcctacg cttacgactt tagaggaagg 660

ttcgccttca gcctcgagac atccgctagc accgcctatc tgcagatcaa caacctcaat 720

acgaggacac cgccacctat ttctgtgctc tggactactc ctatgccatg gattactggg 780

gacaaggcac aagcgtcaca gtgagctccg gaggaggagg atccgtcgac gacatcaagc 840

tccagcagtc cggcgccgaa ctcgctagac ccggagcttc cgtcaagatg agctgcaaga 900

cctccggata cacattcaca agatacacaa tgcactgggt caaacaaagg cccggccaag 960

gcctcgagtg gattggctac atcaacccct ctagaggata taccaactac aatcagaaat 1020

tcaaggacaa agccaccctc acaaccgaca agagcagcag cacagcctac atgcagctga 1080

gctctctgac atccgaagac agcgccgtgt attactgcgc tagatactat gacgaccact 1140

actgtctgga ctattgggga caaggaacaa cactgacagt cagctccggc ggcggaggat 1200

ccggaggcgg aggaagcggc ggaggaggca gcgacatcca gctgacacag tcccccgcca 1260

ttatgagcgc ctcccccggc gaaaaggtca ccatgacatg cagagcctcc agctccgtca 1320

gctatatgaa ctggtaccag cagaaaagcg gcacaagccc taagaggtgg atctacgaca 1380

cctccaaggt cgcttccgga gtgccctata ggttctccgg aagcggatcc ggaacctcct 1440

actctctgac aatctcctcc atggaagccg aggacgctgc cacctattac tgccagcagt 1500

ggagcagcaa tcctctcacc tttggcgccg gaaccaaact cgagctgaag tcctaatga 1559

<210> 19

<211> 1212

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO:19, PD-1-ED-hIgG1-Fc的核苷酸序列

<400> 19

atgcaaattc cccaagctcc ttggcccgtg gtctgggccg tgctgcagct gggatggaga 60

cccggctggt ttctcgactc ccccgatagg ccttggaacc cccctacctt ttttcccgct 120

ctgctggtgg tgaccgaagg cgacaacgcc accttcacat gcagcttcag caacaccagc 180

gagagcttcg tgctcaactg gtatagaatg tcccctagca accagaccga caagctggcc 240

gccttccccg aggatagatc ccaacccggc caagactgca gattcagagt gacccagctg 300

cccaacggaa gggatttcca catgtccgtg gtcagagcta gaaggaatga cagcggaaca 360

tacctctgcg gcgccatttc tctggcccct aaggctcaga tcaaggagtc tctgagggct 420

gaactgagag tgacagagag aagagccgaa gtgcccacag cccacccttc ccctagccct 480

agacccgctg gccaatttca gacactcgtc gagcccaaga gctgcgataa gacccacaca 540

tgccctcctt gtcccgctcc cgagctgctc ggcggaccct ccgtgtttct gtttcccccc 600

aaacccaagg acaccctcat gatttctaga acacccgagg tgacatgcgt ggtggtggat 660

gtgtcccatg aagaccccga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 720

aacgctaaga ccaagcctag agaggaacag tataacagca cctatagagt cgtgtccgtg 780

ctgacagtgc tgcaccaaga ctggctgaac ggcaaagagt ataaatgcaa ggtcagcaac 840

aaggctctgc ccgcccccat tgagaagacc atcagcaagg ccaagggcca gcctagggaa 900

cctcaagtgt ataccctccc tccctctaga gaggagatga ccaagaatca agtgtccctc 960

acatgcctcg tgaaaggctt ctaccctagc gacatcgccg tcgaatggga aagcaacgga 1020

cagcccgaga acaactacaa gaccacaccc cccgtgctcg attccgacgg cagcttcttt 1080

ctgtactcca agctgaccgt ggataagtct agatggcaac aaggcaatgt gttcagctgc 1140

tccgtcatgc acgaggctct gcacaaccac tacacccaga aatctctgtc tctgagcccc 1200

ggcaaatgat ga 1212

<210> 20

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置1

<400> 20

Met Ala Ala Ala Lys Thr Pro Val Ile Val Val Pro

1 5 10

<210> 21

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置2

<400> 21

Lys Thr Pro Val Ile Val Val Pro Val Ile Asp Arg

1 5 10

<210> 22

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置3

<400> 22

Ile Val Val Pro Val Ile Asp Arg Leu Pro Ser Glu

1 5 10

<210> 23

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置4

<400> 23

Val Ile Asp Arg Leu Pro Ser Glu Thr Phe Pro Asn

1 5 10

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置5

<400> 24

Leu Pro Ser Glu Thr Phe Pro Asn Val His Glu His

1 5 10

<210> 25

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置6

<400> 25

Thr Phe Pro Asn Val His Glu His Ile Asn Asp Gln

1 5 10

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置7

<400> 26

Val His Glu His Ile Asn Asp Gln Lys Phe Asp Asp

1 5 10

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置8

<400> 27

Ile Asn Asp Gln Lys Phe Asp Asp Val Lys Asp Asn

1 5 10

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置9

<400> 28

Lys Phe Asp Asp Val Lys Asp Asn Glu Val Met Pro

1 5 10

<210> 29

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置10

<400> 29

Val Lys Asp Asn Glu Val Met Pro Glu Lys Arg Asn

1 5 10

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置11

<400> 30

Glu Val Met Pro Glu Lys Arg Asn Val Val Val Val

1 5 10

<210> 31

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置12

<400> 31

Glu Lys Arg Asn Val Val Val Val Lys Asp Asp Pro

1 5 10

<210> 32

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置13

<400> 32

Val Val Val Val Lys Asp Asp Pro Asp His Tyr Lys

1 5 10

<210> 33

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置14

<400> 33

Lys Asp Asp Pro Asp His Tyr Lys Asp Tyr Ala Phe

1 5 10

<210> 34

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置15

<400> 34

Asp His Tyr Lys Asp Tyr Ala Phe Ile Gln Trp Thr

1 5 10

<210> 35

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置16

<400> 35

Asp Tyr Ala Phe Ile Gln Trp Thr Gly Gly Asn Ile

1 5 10

<210> 36

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置17

<400> 36

Ile Gln Trp Thr Gly Gly Asn Ile Arg Asn Asp Asp

1 5 10

<210> 37

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置18

<400> 37

Gly Gly Asn Ile Arg Asn Asp Asp Lys Tyr Thr His

1 5 10

<210> 38

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置19

<400> 38

Arg Asn Asp Asp Lys Tyr Thr His Phe Phe Ser Gly

1 5 10

<210> 39

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置20

<400> 39

Lys Tyr Thr His Phe Phe Ser Gly Phe Cys Asn Thr

1 5 10

<210> 40

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置21

<400> 40

Phe Phe Ser Gly Phe Cys Asn Thr Met Cys Thr Glu

1 5 10

<210> 41

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置22

<400> 41

Phe Cys Asn Thr Met Cys Thr Glu Glu Thr Lys Arg

1 5 10

<210> 42

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置23

<400> 42

Met Cys Thr Glu Glu Thr Lys Arg Asn Ile Ala Arg

1 5 10

<210> 43

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置24

<400> 43

Glu Thr Lys Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Leu

1 5 10

<210> 44

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置25

<400> 44

Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Leu Trp Asp Ser Asn

1 5 10

<210> 45

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置26

<400> 45

His Leu Ala Leu Trp Asp Ser Asn Phe Phe Thr Glu

1 5 10

<210> 46

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置27

<400> 46

Trp Asp Ser Asn Phe Phe Thr Glu Leu Glu Asn Lys

1 5 10

<210> 47

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置28

<400> 47

Phe Phe Thr Glu Leu Glu Asn Lys Lys Val Glu Tyr

1 5 10

<210> 48

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置29

<400> 48

Leu Glu Asn Lys Lys Val Glu Tyr Val Val Ile Val

1 5 10

<210> 49

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置30

<400> 49

Lys Val Glu Tyr Val Val Ile Val Glu Asn Asp Asn

1 5 10

<210> 50

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置31

<400> 50

Val Val Ile Val Glu Asn Asp Asn Val Ile Glu Asp

1 5 10

<210> 51

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置32

<400> 51

Glu Asn Asp Asn Val Ile Glu Asp Ile Thr Phe Leu

1 5 10

<210> 52

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置33

<400> 52

Val Ile Glu Asp Ile Thr Phe Leu Arg Pro Val Leu

1 5 10

<210> 53

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置34

<400> 53

Ile Thr Phe Leu Arg Pro Val Leu Lys Ala Met His

1 5 10

<210> 54

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置35

<400> 54

Arg Pro Val Leu Lys Ala Met His Asp Lys Lys Ile

1 5 10

<210> 55

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置36

<400> 55

Lys Ala Met His Asp Lys Lys Ile Asp Ile Leu Gln

1 5 10

<210> 56

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置37

<400> 56

Asp Lys Lys Ile Asp Ile Leu Gln Met Arg Glu Ile

1 5 10

<210> 57

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置38

<400> 57

Asp Ile Leu Gln Met Arg Glu Ile Ile Thr Gly Asn

1 5 10

<210> 58

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置39

<400> 58

Met Arg Glu Ile Ile Thr Gly Asn Lys Val Lys Thr

1 5 10

<210> 59

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置40

<400> 59

Ile Thr Gly Asn Lys Val Lys Thr Glu Leu Val Met

1 5 10

<210> 60

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置41

<400> 60

Lys Val Lys Thr Glu Leu Val Met Asp Lys Asn His

1 5 10

<210> 61

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置42

<400> 61

Glu Leu Val Met Asp Lys Asn His Ala Ile Phe Thr

1 5 10

<210> 62

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置43

<400> 62

Asp Lys Asn His Ala Ile Phe Thr Tyr Thr Gly Gly

1 5 10

<210> 63

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置44

<400> 63

Ala Ile Phe Thr Tyr Thr Gly Gly Tyr Asp Val Ser

1 5 10

<210> 64

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置45

<400> 64

Tyr Thr Gly Gly Tyr Asp Val Ser Leu Ser Ala Tyr

1 5 10

<210> 65

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置46

<400> 65

Tyr Asp Val Ser Leu Ser Ala Tyr Ile Ile Arg Val

1 5 10

<210> 66

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置47

<400> 66

Leu Ser Ala Tyr Ile Ile Arg Val Thr Thr Glu Leu

1 5 10

<210> 67

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置48

<400> 67

Ile Ile Arg Val Thr Thr Glu Leu Asn Ile Val Asp

1 5 10

<210> 68

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置49

<400> 68

Thr Thr Glu Leu Asn Ile Val Asp Glu Ile Ile Lys

1 5 10

<210> 69

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置50

<400> 69

Asn Ile Val Asp Glu Ile Ile Lys Ser Gly Gly Leu

1 5 10

<210> 70

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置51

<400> 70

Glu Ile Ile Lys Ser Gly Gly Leu Ser Ser Gly Phe

1 5 10

<210> 71

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置52

<400> 71

Ser Gly Gly Leu Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Glu Ile

1 5 10

<210> 72

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置53

<400> 72

Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Glu Ile Ala Arg Ile Glu

1 5 10

<210> 73

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置54

<400> 73

Tyr Phe Glu Ile Ala Arg Ile Glu Asn Glu Met Lys

1 5 10

<210> 74

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置55

<400> 74

Ala Arg Ile Glu Asn Glu Met Lys Ile Asn Arg Gln

1 5 10

<210> 75

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置56

<400> 75

Asn Glu Met Lys Ile Asn Arg Gln Ile Leu Asp Asn

1 5 10

<210> 76

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置57

<400> 76

Ile Asn Arg Gln Ile Leu Asp Asn Ala Ala Lys Tyr

1 5 10

<210> 77

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置58

<400> 77

Ile Leu Asp Asn Ala Ala Lys Tyr Val Glu His Asp

1 5 10

<210> 78

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置59

<400> 78

Ala Ala Lys Tyr Val Glu His Asp Pro Arg Leu Val

1 5 10

<210> 79

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置60

<400> 79

Val Glu His Asp Pro Arg Leu Val Ala Glu His Arg

1 5 10

<210> 80

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置61

<400> 80

Pro Arg Leu Val Ala Glu His Arg Phe Glu Asn Met

1 5 10

<210> 81

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置62

<400> 81

Ala Glu His Arg Phe Glu Asn Met Lys Pro Asn Phe

1 5 10

<210> 82

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置63

<400> 82

Phe Glu Asn Met Lys Pro Asn Phe Trp Ser Arg Ile

1 5 10

<210> 83

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置64

<400> 83

Lys Pro Asn Phe Trp Ser Arg Ile Gly Thr Ala Ala

1 5 10

<210> 84

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置65

<400> 84

Trp Ser Arg Ile Gly Thr Ala Ala Thr Lys Arg Tyr

1 5 10

<210> 85

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置66

<400> 85

Gly Thr Ala Ala Thr Lys Arg Tyr Pro Gly Val Met

1 5 10

<210> 86

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置67

<400> 86

Thr Lys Arg Tyr Pro Gly Val Met Tyr Ala Phe Thr

1 5 10

<210> 87

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置68

<400> 87

Pro Gly Val Met Tyr Ala Phe Thr Thr Pro Leu Ile

1 5 10

<210> 88

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽阵列的位置69

<400> 88

Tyr Ala Phe Thr Thr Pro Leu Ile Ser Phe Phe Gly

1 5 10

<210> 89

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H3L肽的aa 11-18

<400> 89

Pro Val Ile Asp Arg Leu Pro

1 5

<210> 90

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H3L肽的aa 30-40

<400> 90

Asn Asp Gln Lys Phe Asp Asp Val Lys Asp Asn

1 5 10

<210> 91

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H3L肽的aa 44-52

<400> 91

Pro Glu Arg Lys Asn Val Val Val Val

1 5

<210> 92

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H3L肽的aa 128-137

<400> 92

Asn Val Ile Glu Asp Ile Thr Phe Leu Arg

1 5 10

<210> 93

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H3L肽的aa 152-156

<400> 93

Gln Met Arg Glu Ile

1 5

<210> 94

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H3L肽的aa 161-168

<400> 94

Lys Val Lys Thr Glu Leu Val Met

1 5

<210> 95

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H3L肽的aa 197-204

<400> 95

Asn Ile Val Asp Glu Ile Ile Lys

1 5

<210> 96

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H3L肽的aa 224-229

<400> 96

Lys Ile Asn Arg Gln Ile

1 5

<210> 97

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H3L肽的aa 249-265

<400> 97

Phe Glu Asn Met Lys Pro Asn Phe

1 5

<210> 98

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽1的变体(序列号89)

<400> 98

Ala Val Ile Asp Arg Leu Pro

1 5

<210> 99

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽1的变体 (序列号89)

<400> 99

Pro Ala Ile Asp Arg Leu Pro

1 5

<210> 100

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽1的变体 (序列号89)

<400> 100

Pro Val Ala Asp Arg Leu Pro

1 5

<210> 101

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽1的变体 (序列号89)

<400> 101

Pro Val Ile Ala Arg Leu Pro

1 5

<210> 102

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽1的变体 (序列号89)

<400> 102

Pro Val Ile Asp Ala Leu Pro

1 5

<210> 103

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽1的变体 (序列号89)

<400> 103

Pro Val Ile Asp Arg Ala Pro

1 5

<210> 104

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽1的变体 (序列号89)

<400> 104

Pro Val Ile Asp Arg Leu Ala

1 5

<210> 105

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽2的变体 (序列号90)

<400> 105

Ala Asp Gln Lys Phe Asp Asp Val Lys Asp Asn

1 5 10

<210> 106

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽2的变体 (序列号90)

<400> 106

Asn Ala Gln Lys Phe Asp Asp Val Lys Asp Asn

1 5 10

<210> 107

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽2的变体 (序列号90)

<400> 107

Asn Asp Ala Lys Phe Asp Asp Val Lys Asp Asn

1 5 10

<210> 108

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽2的变体 (序列号90)

<400> 108

Asn Asp Gln Ala Phe Asp Asp Val Lys Asp Asn

1 5 10

<210> 109

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽2的变体 (序列号90)

<400> 109

Asn Asp Gln Lys Ala Asp Asp Val Lys Asp Asn

1 5 10

<210> 110

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽2的变体 (序列号90)

<400> 110

Asn Asp Gln Lys Phe Ala Asp Val Lys Asp Asn

1 5 10

<210> 111

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽2的变体 (序列号90)

<400> 111

Asn Asp Gln Lys Phe Asp Ala Val Lys Asp Asn

1 5 10

<210> 112

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽2的变体 (序列号90)

<400> 112

Asn Asp Gln Lys Phe Asp Asp Ala Lys Asp Asn

1 5 10

<210> 113

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽2的变体 (序列号90)

<400> 113

Asn Asp Gln Lys Phe Asp Asp Val Ala Asp Asn

1 5 10

<210> 114

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽2的变体 (序列号90)

<400> 114

Asn Asp Gln Lys Phe Asp Asp Val Lys Ala Asn

1 5 10

<210> 115

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽2的变体 (序列号90)

<400> 115

Asn Asp Gln Lys Phe Asp Asp Val Lys Asp Ala

1 5 10

<210> 116

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽3的变体 (序列号91)

<400> 116

Ala Lys Arg Asn Val Val Val Val

1 5

<210> 117

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽3的变体 (序列号91)

<400> 117

Glu Ala Arg Asn Val Val Val Val

1 5

<210> 118

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽3的变体 (序列号91)

<400> 118

Glu Lys Ala Asn Val Val Val Val

1 5

<210> 119

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽3的变体 (序列号91)

<400> 119

Glu Lys Arg Ala Val Val Val Val

1 5

<210> 120

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽3的变体 (序列号91)

<400> 120

Glu Lys Arg Asn Ala Val Val Val

1 5

<210> 121

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽3的变体 (序列号91)

<400> 121

Glu Lys Arg Asn Val Ala Val Val

1 5

<210> 122

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽3的变体 (序列号91)

<400> 122

Glu Lys Arg Asn Val Val Ala Val

1 5

<210> 123

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽3的变体 (序列号91)

<400> 123

Glu Lys Arg Asn Val Val Val Ala

1 5

<210> 124

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽4的变体 (序列号92)

<400> 124

Ala Val Ile Glu Asp Ile Thr Phe Leu Arg

1 5 10

<210> 125

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽4的变体 (序列号92)

<400> 125

Asn Ala Ile Glu Asp Ile Thr Phe Leu Arg

1 5 10

<210> 126

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽4的变体 (序列号92)

<400> 126

Asn Val Ala Glu Asp Ile Thr Phe Leu Arg

1 5 10

<210> 127

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽4的变体 (序列号92)

<400> 127

Asn Val Ile Ala Asp Ile Thr Phe Leu Arg

1 5 10

<210> 128

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽4的变体 (序列号92)

<400> 128

Asn Val Ile Glu Ala Ile Thr Phe Leu Arg

1 5 10

<210> 129

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽4的变体 (序列号92)

<400> 129

Asn Val Ile Glu Asp Ala Thr Phe Leu Arg

1 5 10

<210> 130

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽4的变体 (序列号92)

<400> 130

Asn Val Ile Glu Asp Ile Ala Phe Leu Arg

1 5 10

<210> 131

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽4的变体 (序列号92)

<400> 131

Asn Val Ile Glu Asp Ile Thr Ala Leu Arg

1 5 10

<210> 132

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽4的变体 (序列号92)

<400> 132

Asn Val Ile Glu Asp Ile Thr Phe Ala Arg

1 5 10

<210> 133

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽4的变体 (序列号92)

<400> 133

Asn Val Ile Glu Asp Ile Thr Phe Leu Ala

1 5 10

<210> 134

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽5的变体 (序列号93)

<400> 134

Ala Met Arg Glu Ile

1 5

<210> 135

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽5的变体 (序列号93)

<400> 135

Gln Ala Arg Glu Ile

1 5

<210> 136

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽5的变体 (序列号93)

<400> 136

Gln Met Ala Glu Ile

1 5

<210> 137

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽5的变体 (序列号93)

<400> 137

Gln Met Arg Ala Ile

1 5

<210> 138

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽5的变体 (序列号93)

<400> 138

Gln Met Arg Glu Ala

1 5

<210> 139

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽6的变体 (序列号94)

<400> 139

Ala Val Lys Thr Glu Leu Val Met

1 5

<210> 140

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽6的变体 (序列号94)

<400> 140

Lys Ala Lys Thr Glu Leu Val Met

1 5

<210> 141

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽6的变体 (序列号94)

<400> 141

Lys Val Ala Thr Glu Leu Val Met

1 5

<210> 142

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽6的变体 (序列号94)

<400> 142

Lys Val Lys Ala Glu Leu Val Met

1 5

<210> 143

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽6的变体 (序列号94)

<400> 143

Lys Val Lys Thr Ala Leu Val Met

1 5

<210> 144

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽6的变体 (序列号94)

<400> 144

Lys Val Lys Thr Glu Ala Val Met

1 5

<210> 145

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽6的变体 (序列号94)

<400> 145

Lys Val Lys Thr Glu Leu Ala Met

1 5

<210> 146

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽6的变体 (序列号94)

<400> 146

Lys Val Lys Thr Glu Leu Val Ala

1 5

<210> 147

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽7的变体 (序列号95)

<400> 147

Ala Ile Val Asp Glu Ile Ile Lys

1 5

<210> 148

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽7的变体 (序列号95)

<400> 148

Asn Ala Val Asp Glu Ile Ile Lys

1 5

<210> 149

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽7的变体 (序列号95)

<400> 149

Asn Ile Ala Asp Glu Ile Ile Lys

1 5

<210> 150

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽7的变体 (序列号95)

<400> 150

Asn Ile Val Ala Glu Ile Ile Lys

1 5

<210> 151

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽7的变体 (序列号95)

<400> 151

Asn Ile Val Asp Ala Ile Ile Lys

1 5

<210> 152

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽7的变体 (序列号95)

<400> 152

Asn Ile Val Asp Glu Ala Ile Lys

1 5

<210> 153

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽7的变体 (序列号95)

<400> 153

Asn Ile Val Asp Glu Ile Ala Lys

1 5

<210> 154

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽7的变体 (序列号95)

<400> 154

Asn Ile Val Asp Glu Ile Ile Ala

1 5

<210> 155

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽8的变体 (序列号96)

<400> 155

Ala Ile Asn Arg Gln Ile

1 5

<210> 156

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽8的变体 (序列号96)

<400> 156

Lys Ala Asn Arg Gln Ile

1 5

<210> 157

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽8的变体 (序列号96)

<400> 157

Lys Ile Ala Arg Gln Ile

1 5

<210> 158

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽8的变体 (序列号96)

<400> 158

Lys Ile Asn Ala Gln Ile

1 5

<210> 159

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽8的变体 (序列号96)

<400> 159

Lys Ile Asn Arg Ala Ile

1 5

<210> 160

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽8的变体 (序列号96)

<400> 160

Lys Ile Asn Arg Gln Ala

1 5

<210> 161

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽9的变体 (序列号97)

<400> 161

Ala Glu Asn Met Lys Pro Asn Phe

1 5

<210> 162

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽9的变体 (序列号97)

<400> 162

Phe Ala Asn Met Lys Pro Asn Phe

1 5

<210> 163

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽9的变体 (序列号97)

<400> 163

Phe Glu Ala Met Lys Pro Asn Phe

1 5

<210> 164

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽9的变体 (序列号97)

<400> 164

Phe Glu Asn Ala Lys Pro Asn Phe

1 5

<210> 165

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽9的变体 (序列号97)

<400> 165

Phe Glu Asn Met Ala Pro Asn Phe

1 5

<210> 166

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽9的变体 (序列号97)

<400> 166

Phe Glu Asn Met Lys Ala Asn Phe

1 5

<210> 167

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽9的变体 (序列号97)

<400> 167

Phe Glu Asn Met Lys Pro Ala Phe

1 5

<210> 168

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽9的变体 (序列号97)

<400> 168

Phe Glu Asn Met Lys Pro Asn Ala

1 5

<210> 169

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 组3肽的对照肽

<400> 169

Glu Lys Arg Asn Val Val Val Val

1 5

<210> 170

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变体H3L氨基酸

<400> 170

Met Ala Ala Ala Lys Thr Pro Val Ile Val Val Pro Val Ala Ala Ala

1 5 10 15

Leu Pro Ser Glu Thr Phe Pro Asn Val His Glu His Ile Asn Asp Gln

20 25 30

Ala Ala Ala Asp Val Ala Asp Ala Glu Val Met Ala Ala Lys Arg Asn

35 40 45

Val Val Val Ala Lys Asp Asp Pro Asp His Tyr Lys Asp Tyr Ala Phe

50 55 60

Ile Gln Trp Thr Gly Gly Asn Ile Arg Asn Asp Asp Lys Tyr Thr His

65 70 75 80

Phe Phe Ser Gly Phe Cys Asn Thr Met Cys Thr Glu Glu Thr Lys Arg

85 90 95

Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Leu Trp Asp Ser Asn Phe Phe Thr Glu

100 105 110

Leu Glu Asn Lys Lys Val Glu Tyr Val Val Ile Val Glu Asn Asp Asn

115 120 125

Val Ile Ala Ala Ile Ala Ala Ala Ala Pro Val Leu Lys Ala Met His

130 135 140

Asp Lys Lys Ile Asp Ile Leu Gln Met Ala Ala Ala Ile Thr Gly Asn

145 150 155 160

Ala Val Lys Thr Glu Ala Ala Ala Asp Lys Asn His Ala Ile Phe Thr

165 170 175

Tyr Thr Gly Gly Tyr Asp Val Ser Leu Ser Ala Tyr Ile Ile Arg Val

180 185 190

Thr Thr Ala Leu Asn Ala Ala Asp Glu Ile Ile Lys Ser Gly Gly Leu

195 200 205

Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Glu Ile Ala Arg Ile Glu Asn Glu Met Lys

210 215 220

Ile Asn Ala Gln Ile Leu Asp Asn Ala Ala Lys Tyr Val Glu His Asp

225 230 235 240

Pro Arg Leu Val Ala Glu His Arg Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

245 250 255

Trp Ala Arg Ile Gly Pro Ala Thr Thr Ile Arg Cys Pro Gly Val Lys

260 265 270

Asn Ala Asn Thr Ala Pro Leu Ile Ser Phe Phe Gly Leu Phe Asp Ile

275 280 285

Asn Val Ile Gly Leu Ile Val Ile Leu Phe Ile Met Phe Met Leu Ile

290 295 300

Phe Asn Val Lys Ser Lys Leu Leu Trp Phe Leu Thr Gly Thr Phe Val

305 310 315 320

Thr Ala Phe Ile

<210> 171

<211> 978

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变体H3L的核苷酸序列

<400> 171

atggctgccg ccaaaacccc cgtgattgtg gtccccgtgg ccgctgctct gccttccgag 60

acattcccca acgtgcacga acacatcaat gaccaagctg ccgctgacgt ggccgacgcc 120

gaagtcatgg ccgctaagag aaacgtggtc gtggccaagg atgaccccga ccactacaag 180

gactatgcct tcatccagtg gactggtggc aacatcagaa acgacgacaa gtacacccat 240

ttcttcagcg gcttctgcaa caccatgtgt accgaggaga ccaagaggaa catcgctcgt 300

cacctcgccc tctgggactc caatttcttc accgagctgg agaacaagaa ggtcgagtac 360

gtggtgatcg tggagaacga caacgtgatc gccgctatcg ctgccgccgc tcccgtttta 420

aaagccatgc acgacaagaa gatcgacatt ttacagatgg ccgctgccat caccggaaac 480

gccgtcaaga ccgaggctgc cgccgataag aaccacgcca tcttcaccta caccggcgga 540

tatgacgtga gcctctccgc ttacatcatt agggtgacca ccgctttaaa cgccgccgac 600

gaaatcatca aatccggagg tttaagctcc ggcttctact tcgagatcgc tcgtatcgag 660

aatgaaatga agatcaatgc ccagatttta gataatgccg ccaaatacgt ggaacatgac 720

cctcgtctgg tggctgagca tcgttttgct gctgctgccg ctgctgcttg ggccagaatc 780

ggacccgcca ccaccattag atgccccggt gtgaaaaacg ccaacaccgc ccctttaatt 840

tccttcttcg gtttattcga catcaacgtg atcggcctca tcgtgatttt attcatcatg 900

ttcatgctga tcttcaacgt gaagtccaag ttattatggt ttttaactgg taccttcgtg 960

accgccttca tctgataa 978

<210> 172

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变体D8L氨基酸序列

<400> 172

Met Pro Gln Gln Leu Ser Pro Ile Asn Ile Glu Thr Lys Lys Ala Ile

1 5 10 15

Ser Asn Ala Arg Leu Lys Pro Leu Asp Ile His Tyr Asn Glu Ser Lys

20 25 30

Pro Thr Thr Ile Gln Asn Thr Gly Lys Leu Ala Ala Ile Asn Phe Ala

35 40 45

Gly Gly Tyr Ile Ala Ala Ala Phe Leu Pro Asn Glu Tyr Val Leu Ser

50 55 60

Ser Leu His Ile Tyr Trp Gly Lys Glu Asp Asp Tyr Gly Ser Asn His

65 70 75 80

Leu Ile Asp Val Tyr Lys Tyr Ser Gly Glu Ile Asn Leu Val His Trp

85 90 95

Asn Ala Lys Lys Tyr Ser Ser Tyr Glu Glu Ala Ala Ala His Asp Asp

100 105 110

Gly Leu Ile Ile Ile Ser Ile Phe Leu Gln Val Leu Asp His Lys Asn

115 120 125

Val Tyr Phe Gln Lys Ile Val Asn Gln Leu Asp Ser Ile Arg Ser Gly

130 135 140

Asn Thr Ser Ala Pro Phe Asp Ser Val Phe Tyr Leu Asp Asn Leu Leu

145 150 155 160

Pro Ser Lys Leu Asp Tyr Phe Ala Tyr Leu Gly Thr Thr Ile Asn His

165 170 175

Ala Ala Asp Ala Val Trp Ile Ile Phe Pro Thr Pro Ile Asn Ile His

180 185 190

Ser Asp Gln Ala Ser Lys Ala Arg Thr Leu Ala Ser Ser Ser Ala His

195 200 205

Asp Gly Lys Ala His Tyr Ile Thr Glu Ala Tyr Ala Asn Ala Tyr Lys

210 215 220

Leu Asn Ala Asp Thr Gln Val Tyr Tyr Ser Gly Glu Ile Ile Arg Ala

225 230 235 240

Ala Thr Thr Ser Pro Ala Arg Glu Asn Tyr Phe Met Arg Trp Leu Ser

245 250 255

Asp Leu Arg Glu Thr Cys Phe Ser Tyr Tyr Gln Lys Tyr Ile Glu Glu

260 265 270

Asn Lys Thr Phe Ala Ile Ile Ala Ile Val Phe Val Phe Ile Leu Thr

275 280 285

Ala Ile Leu Phe Phe Met Ser Arg Arg Tyr Ser Arg Glu Lys Gln Asn

290 295 300

<210> 173

<211> 918

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变体D8L的核苷酸序列

<400> 173

atgccccagc aactgtctcc catcaacatc gagaccaaga aggccatttc caacgctcgt 60

ctgaagcctt tagacatcca ctacaatgag agcaagccca ccaccatcca gaacactggt 120

aagctggccg ccatcaactt tgccggcggc tacatcgccg ccgcctttct gcccaacgag 180

tacgtgctca gctctttaca catctattgg ggcaaagagg acgactacgg ctccaaccat 240

ttaatcgacg tctacaagta ttccggcgag atcaatttag tgcactggaa cgccaagaag 300

tactccagct acgaagaagc cgctgcccac gacgacggac tgatcatcat cagcatcttt 360

ctccaagttc tggaccacaa gaacgtgtac ttccagaaga tcgtcaacca gctcgacagc 420

attcgttccg gcaatacatc cgcccccttt gattccgtgt tctatttaga caatttactg 480

ccctccaagc tggactactt cgcctattta ggcaccacca tcaatcacgc cgccgatgct 540

gtgtggatca tcttccccac ccccattaac attcacagcg atcaagctag caaggccaga 600

actttagcct ccagcagcgc tcacgacggc aaggctcact acatcaccga ggcctatgcc 660

aacgcctaca agctcaacgc cgacacccaa gtttactact ccggtgagat cattagagct 720

gccacaacct cccccgctcg tgagaactac ttcatgaggt ggctgtccga tttaagagag 780

acttgtttct cctactatca gaaatacatc gaggagaaca agaccttcgc catcatcgcc 840

atcgtgttcg tgttcatttt aaccgccatt ttattcttca tgtctcgtag gtactctcgt 900

gagaagcaga attgataa 918

<210> 174

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变体D8L氨基酸序列 (序列号6的取代-仅位置43处的不同)

<400> 174

Met Pro Gln Gln Leu Ser Pro Ile Asn Ile Glu Thr Lys Lys Ala Ile

1 5 10 15

Ser Asn Ala Arg Leu Lys Pro Leu Asp Ile His Tyr Asn Glu Ser Lys

20 25 30

Pro Thr Thr Ile Gln Asn Thr Gly Lys Leu Leu Trp Ile Asn Phe Lys

35 40 45

Gly Gly Tyr Ile Ser Gly Trp Phe Leu Pro Asn Glu Tyr Val Leu Ser

50 55 60

Ser Leu His Ile Tyr Trp Gly Lys Glu Asp Asp Tyr Gly Ser Asn His

65 70 75 80

Leu Ile Asp Val Tyr Lys Tyr Ser Gly Glu Ile Asn Leu Val His Trp

85 90 95

Asn Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Tyr Glu Glu Ala Lys Lys His Asp Asp

100 105 110

Gly Leu Ile Ile Ile Ser Ile Phe Leu Gln Val Leu Asp His Lys Asn

115 120 125

Val Tyr Phe Gln Lys Ile Val Asn Gln Leu Asp Ser Ile Arg Ser Thr

130 135 140

Asn Thr Ser Ala Pro Phe Asp Ser Val Phe Tyr Leu Asp Asn Leu Leu

145 150 155 160

Pro Ser Lys Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr Leu Gly Thr Thr Ile Asn His

165 170 175

Tyr Ala Asp Ala Val Trp Ile Ile Phe Pro Thr Pro Ile Asn Ile His

180 185 190

Ser Asp Gln Leu Ser Lys Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Ser Ser Asn His

195 200 205

Asp Gly Lys Thr His Tyr Ile Thr Glu Cys Tyr Arg Asn Leu Tyr Lys

210 215 220

Leu Asn Gly Asp Thr Gln Val Tyr Tyr Ser Gly Glu Ile Ile Arg Ala

225 230 235 240

Ala Thr Thr Ser Pro Ala Arg Glu Asn Tyr Phe Met Arg Trp Leu Ser

245 250 255

Asp Leu Arg Glu Thr Cys Phe Ser Tyr Tyr Gln Lys Tyr Ile Glu Glu

260 265 270

Asn Lys Thr Phe Ala Ile Ile Ala Ile Val Phe Val Phe Ile Leu Thr

275 280 285

Ala Ile Leu Phe Phe Met Ser Arg Arg Tyr Ser Arg Glu Lys Gln Asn

290 295 300