参与硝酸根转运的蛋白、其编码基因和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种参与硝酸根转运(包括长途转运)的蛋白，其编码基因和用途。

背景技术

植物生长需要多种多样的营养元素，目前已被公认的植物必需的营养元素多达十几种，本领域人员将这些元素分为大量元素、中量元素和微量元素。大量元素中的碳(C)、氢(H)、氧(O)可以从大气和水中得到，一般情况下不需要人为补充，氮(N)、磷(P)、钾(K)由于作物需要量很大，而一般土壤中能够供应的数量却较少，在较多的情况下需要通过施肥补充以促进作物的正常生长发育。

植物所需的大量元素中，氮素是植物体内蛋白质、核酸、叶绿素以及其他一些关键因子的重要组成元素，其主要以硝酸盐以及铵盐的形式存在于自然界中并被植物吸收利用。随着人口的不断增加，粮食的需求量也越来越大，目前农业生产上通常通过大量施用氮肥来增加作物的产量，但是较低的利用效率导致过量氮肥流失，从而造成了严重的环境污染及资源浪费。

为了减少不必要的资源浪费以及环境污染问题，培育氮高效品种，提高氮肥利用效率成为了解决这一问题的关键有效方式。但是目前对氮素在植物体内的作用机制还知之甚少，尤其是氮素在植物体内的长途转运机制。

因此，还需要对本领域进行深入的研究，以开发出培育氮高效品种的方法和产品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种参与硝酸根吸收和转运(包括长途转运)的蛋白，其编码基因和用途。

在本发明的第一方面，提供一种OsNPF7.9或其上调分子的用途，用于：(a)吸收或转运硝酸根，或促进硝酸根的吸收或转运；(b)调控植物的氮素利用效率；(c)调控植物的生物量；或(d)调控植物的产量；其中，所述的OsNPF7.9包括其同源物。较佳地，所述的上调分子为对OsNPF7.9第433位进行定点突变的试剂，较佳地其将第433位突变为Arg。

在一个优选例中，所述的转运硝酸根为：将硝酸根由植物的地下部(根)向地上部转运；较佳地，所述的转运为长途转运；所述调控植物的氮素利用效率为提高植物的氮素利用效率；所述调控植物的生物量为提高植物的生物量；所述调控植物的产量为提高植物的产量。

在另一优选例中，所述的上调分子包括：与OsNPF7.9相互作用、从而提高其表达或活性的上调分子；或过表达OsNPF7.9的表达盒或表达构建物(如表达载体)。

在本发明的另一方面，提供一种调控植物硝酸根吸收或转运、氮素利用效率、生物量或产量的方法，包括：在植物中调控OsNPF7.9的表达或活性；其中，所述的OsNPF7.9包括其同源物。

在一个优选例中，所述的硝酸根转运为：将硝酸根由植物的地下部(根)向地上部转运；较佳地，所述的转运为长途转运；或

在另一优选例中，所述调控植物的氮素利用效率为提高植物的氮素利用效率；所述调控植物的生物量为提高植物的生物量；所述调控植物的产量为提高植物的产量。

在另一优选例中，所述的提高OsNPF7.9的表达或活性包括：以与OsNPF7.9相互作用的上调分子进行调控，从而提高OsNPF7.9的表达或活性；或，在植物中过表达OsNPF7.9。

在另一优选例中，所述的调控为在高氮条件下的调控；较佳地，所述的高氮条件为200～500为kg/ha：更佳地，所述的高氮条件为大于200kg/ha、大于250kg/ha或大于300kg/ha。

在另一优选例中，所述氮素包括：来自硝态氮的氮素，来自铵态氮的氮素(包括由铵态氮经由硝化作用转化为硝态氮的氮素)或来自酰胺态氮(包括由酰胺态氮经由硝化作用转化为硝态氮的氮素)；较佳地所述的氮素包括：硝酸根或能够形成硝酸根的物质(如硝酸钠、硝酸钙、硝酸钾、硝酸铵等)，尿素；较佳地，所述物质包括无机物或有机物。

在另一优选例中，所述植物为吸收利用氮素的植物。

在另一优选例中，所述植物包括禾本科(Gramineae)植物，或所述OsNPF7.9或其同源物来自于禾本科(Gramineae)植物；较佳地，所述的禾本科植物包括下组植物或所述OsNPF7.9或其同源物来自于包括下组植物：水稻、玉米、高粱、小米、黍、小麦、大麦、燕麦、黑麦、brachypodium stacei、短柄草；较佳地，所述的水稻选自下组：籼稻、粳稻。

在另一优选例中，所述的提高生物量包括：提高植物地上部的株高，增加单株生物量，增加地上部的重量，增加地下部的重量。

在另一优选例中，所述的提高产量包括：增加分蘖数、增加籽粒重量、增加结实率、增加枝梗数、增加总粒数或增加千粒重。

在另一优选例中，OsNPF7.9多肽的氨基酸序列选自下组：(i)具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-50个，1-30个，1-20个，1-10个，1-5个，1-3个或1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控农艺性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥85％，≥90％，≥95％，≥98％或≥99％)，具有所述调控农艺性状功能的多肽；(iv)SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或(v)在SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；其中，所述的氨基酸序列在相应于SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的第430位和第434位上的氨基酸是保守的。

在另一优选例中，所述的OsNPF7.9多肽包括多肽变体，相应于SEQ ID NO:3所示氨基酸序列，其中第433位发生了突变；较佳地突变为Arg。

在另一优选例中，OsNPF7.9基因的核苷酸序列选自下组：(a)编码如SEQ ID NO:3所示多肽的多核苷酸；(b)序列如SEQ ID NO:1或2所示的多核苷酸；(c)核苷酸序列与SEQID NO:1或2所示序列的同源性≥80％(较佳地≥85％，≥90％，≥95％，≥98％或≥99％)的多核苷酸；(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸；其中，所述的核苷酸序列在相应于SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的第1289位和第1301位上的碱基是保守的。

在本发明的另一方面，提供一种OsNPF7.9或其同源物的用途，用作鉴定植物的农艺性状的分子标记物；所述农艺性状包括：(i)硝酸根吸收或转运能力，(ii)氮素利用效率，(iii)生物量，或(iv)产量。

在本发明的另一方面，提供一种定向选择农艺性状改良的植物的方法，所述农艺性状改良包括：硝酸根吸收或转运能力提高、氮素利用效率提高、生物量提高、产量提高；所述方法包括：鉴定测试植物体内OsNPF7.9的表达或活性，若该测试植物中OsNPF7.9的表达或活性高于(显著高于，如高5％以上、10％以上、20％以上、40％以上、60％以上、100％以上或更高)该类植物(对照植物)中OsNPF7.9的表达或活性的平均值，则其为农艺性状改良的植物；其中，所述的OsNPF7.9包括其同源物。

在本发明的另一方面，提供一种鉴定植物农艺性状的方法，所述农艺性状包括：(i)硝酸根吸收或转运能力，(ii)氮素利用效率；所述方法包括：硝酸根吸收或转运能力提高、氮素利用效率提高、生物量提高、产量提高；所述方法包括：鉴定测试植物体内OsNPF7.9的表达或活性，若该测试植物中OsNPF7.9的表达或活性高于(显著高于，如高5％以上、10％以上、20％以上、40％以上、60％以上、100％以上或更高)该类植物(对照植物)中OsNPF7.9的表达或活性的平均值，则其为硝酸根吸收或转运能力提高、氮素利用效率提高、生物量提高、产量提高的植物；其中，所述的OsNPF7.9包括其同源物。

在本发明的另一方面，提供一种鉴定植物农艺性状的方法，所述农艺性状包括：(i)硝酸根吸收或转运能力，(ii)氮素利用效率；所述方法包括：鉴定测试植物基因组中OsNPF7.9或其同源物中相应于OsNPF7.9 CDS序列中第1298位碱基，或其氨基酸序列中第433位，若碱基为G或氨基酸为Arg，则该植物硝酸根吸收或转运能力高、氮素利用效率高；若碱基为A或氨基酸为His，则该植物的硝酸根吸收或转运能力、氮素利用效率低于第1298位碱基为G的植物。

在本发明的另一方面，提供一种鉴定禾本科植物水稻的籼稻或粳稻品种的方法，所述方法包括：鉴定测试植物基因组中相应于OsNPF7.9 CDS序列中第1298位的碱基，或其氨基酸序列中第433位，若碱基为G或氨基酸为Arg，则该植物为籼稻的概率高(如概率高于90％或95％)；若碱基为A或氨基酸为His，则该植物为粳稻的概率高(如概率高于85％或90％)。

在本发明的另一方面，提供一种分离的OsNPF7.9多肽变体，其氨基酸序列选自下组：(i)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-50个，1-30个，1-20个，1-10个，1-5个，1-3个或1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(i)多肽功能的由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQID NO:4所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥85％，≥90％，≥95％，≥98％或≥99％)，具有(i)多肽功能的由(i)衍生的多肽；(iv)SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或(v)在SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；其中，所述的氨基酸序列在相应于SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的第430位和第434位上的氨基酸是保守的。

在一个优选例中，所述的氨基酸序列在相应于SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的第430位和第434位上的氨基酸是保守的。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，其编码所述分离的OsNPF7.9多肽变体。

在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于制备农艺性状改良的植物，所述农艺性状改良包括：硝酸根吸收或转运能力提高、氮素利用效率提高、生物量提高、产量提高；或，用于作为鉴定植物农艺性状的分子标记，其中所述农艺性状包括：(i)硝酸根吸收或转运能力，(ii)氮素利用效率，(iii)生物量，或(iv)产量。

在本发明的另一方面，提供一种改良植物农艺性状的方法，包括：对植物的OsNPF7.9多肽氨基酸序列的第433位进行突变，较佳地突变为Arg；较佳地所述的功能包括：(i)硝酸根吸收或转运能力，(ii)氮素利用效率，(iii)生物量，或(iv)产量。

在本发明的另一方面，提供一种提高OsNPF7.9多肽的功能的方法，包括对其氨基酸序列的第433位进行突变，较佳地突变为Arg；较佳地所述的功能包括：(i)硝酸根吸收或转运能力，(ii)氮素利用效率，(iii)生物量，或(iv)产量。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、将OsNPF7.9与其他NPF家族基因进行序列比对。

图2、OsNPF7.9表达模式分析。

A、水稻幼苗根部GUS染色；

B、水稻幼苗根部横切GUS染色结果；

C、水稻叶片维管组织GUS染色结果；

D、水稻幼穗维管组织GUS染色结果；

E、根部正向探针原位杂交结果；

F、根部反向探针原位杂交结果；

G、OsNPF7.9在水稻不同时期不同组织中的表达量。

其中，YL表示幼苗叶片；YR表示幼苗根部；YP表示幼穗；FL表示旗叶；Culm表示茎；DAFS表示开花以后的水稻颖花ab表示使用anova Tukey多重比较进行显著性检验，柱子上方的字母表示通过anova多重比较之后有显著差异。

图3、OsNPF7.9亚细胞定位；其中，Bar＝5um。

图4、OsNPF7.9电生理特性分析。

A、注射水或NPF7.9 cRNA的卵母细胞培养44-48h后在含10mM

B、注射OsNPF7.9 cRNA的卵母细胞在PH＝5.5的不同

C、注射OsNPF7.9 cRNA卵母细胞的电流电压曲线，以注射水的细胞为对照；

D、NPF7.9在PH分别为5.5以及7.4时外排硝酸根的能力测定；

其中，CHL1为阳性对照。

图5、OsNPF7.9功能鉴定。

A.突变体osnpf7.9-1、osnpf7.9-2的突变位点示意图；

B.突变体与野生型的OsNPF7.9表达情况；

C～D.硝酸根吸收及外排功能进行分析；

E～F.不同处理条件下野生型和突变体在植物地上部分和地下部分转运硝酸根情况；

G.突变体与野生型在不同处理条件下的硝酸根吸收速率比较；

H.突变体以及野生型木质部伤流液中硝酸根的含量，以野生型为对照。

图6、OsNPF7.9参与高硝酸根条件下生物量调控。

A为不同氮源浓度下突变体和野生型的生长图；

B为不同氮源浓度下突变体和野生型的干重；

C为不同氮源浓度下突变体和野生型的总氮；

D改变氮源及浓度条件下突变体和野生型的根的干重；

E改变氮源及浓度条件下突变体和野生型的地上部干重。

其中，HN表示以NH

图7、OsNPF7.9调控产量及NUE。

A、大田条件下野生型和突变体的生长图；

B、野生型和突变体在不同施肥条件下的生物量比较；

C、野生型和突变体在不同施肥条件下的分蘖数比较；

D、野生型和突变体在高氮条件下的产量比较；

E、野生型和突变体在不同施肥条件下的产量比较；

F、野生型和突变体在不同施肥条件下的氮素利用效率(NUE)比较；

其中，HN为高氮(300kg/ha)，LN为低氮(0kg/ha)。

图8、OsNPF7.9存在籼稻和粳稻的分化。

A、OsNPF7.9CDS中的单核苷酸多态性(SNP)位点示意图；

B、籼稻品种的相关序列区段，框线内指示第1298位碱基；

C、粳稻品种的相关序列区段，框线内指示第1298位碱基；

D、注射不同SNP位点cRNA卵母细胞的硝酸根吸收活性；

其中，CHL为阳性对照，H

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了一种可以极好地应用于植物品种的改良、提高植物对氮素的吸收利用效率、提高植物生物量、产量的基因，本发明为开发高效利用氮素的植物提供了有价值的基因资源。

术语

如本文所用，所述的“长途转运”是指将硝酸根通过木质部导管由地下部(根部)转运至地上部。所述的“长途转运”表明，本发明的蛋白并非仅能在细胞内或相邻细胞间实现硝酸根的转运，而是能够将氮素从地下部向地上部转运。

如本文所用，所述的“地上部”也称为“地上部分”是指植物植株的部分组织，当植株种植于土地中或培养于培养液中时，该部分组织位于植株的地面或培养液面以上的部分。

如本文所用，所述的“地下部”也称为“地下部分”是指植物植株的部分组织，当植株种植于土地中或培养于培养液中时，该部分组织位于植株的地面或培养液面以下的部分。

如本文所用，所述的“硝态氮”是指其中的氮素以硝酸根离子的形态存在的物质(包括硝态氮肥)。

如本文所用，所述的“铵态氮”是指其中的氮素以氨(NH3)或铵离子(NH4+)的形态存在的物质(包括铵态氮肥)。

如本文所用，所述的“酰胺态氮”是指其中的氮素以酰胺态的形式存在的物质(包括酰胺态氮肥)。

应理解，不同于实验室环境，在大田环境下，土壤中含有多种成分，且PH值、温度、微生物(如存在硝化细菌)和水分情况复杂，因此所述硝态氮肥、铵态氨肥或酰胺态氮肥在某些培育条件下，会发生一些转换。例如，铵转化成硝态氮的生物氧化过程一般称为硝化作用，此过程可以由自养型好气性细菌引起。

如本文所用，所述的“植物”为能够吸收利用氮素的植物，较佳地其基因组中包含有本发明的OsNPF7.9或其同源物(同源基因)。例如，所述的“植物”可以是各种农作物、花卉植物、或林业植物等。例如，所述植物包括下组植物或所述OsNPF7.9或其同源物来自于包括下组植物：禾本科(Gramineae)、茄科(Solanaceae)、豆科(Leguminosae)、十字花科(Brassicaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、菊科(asteraceae)、杨柳科(Salicaceae)、桑科(Moraceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、石松科(Lycopodiaceae)、(Selaginellaceae)、银杏科(Ginkgoaceae)、松科(Pinaceae)、苏铁科(Cycadaceae)、天南星科(Araceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、悬铃木科(Platanaceae)、榆科(Ulmaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、桦科(Betulaceae)、猕猴桃科(Actinidiaceae)、锦葵科(Malvaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)、椴树科(Tiliaceae)、柽柳科(Tamaricaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、景天科(Crassulaceae)、苏木科(Caesalpinaceae)、蝶形花科(Fabaceae)、石榴科(Punicaceae)、珙桐科(Nyssaceae)、山茱萸科(Cornaceae)、八角枫科(Alangiaceae)、卫矛科(Celastraceae)、冬青科(Aquifoliaceae)、黄杨科(Buxaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、小盘木科(Pandaceae)、鼠李科(Rhamnaceae)、葡萄科(Vitaceae)、漆树科(Anacardiaceae)，橄榄科(Burseraceae)、桔梗科(Campanulaceae)、红树科(Rhizophoraceae)、檀香科(Santalaceae)、木犀科(Oleaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、露兜树科(Pandanaceae)、黑三棱科(Sparganiaceae)、水蕹科(Aponogetonaceae)、眼子菜科(Potamogetonaceae)、茨藻科(Najadaceae、冰沼草科(Scheuchzeriaceae)、泽泻科(Alismataceae)、花蔺科(Butomaceae)、水鳖科(Hydrocharitaceae)、霉草科(Triuridaceae)、莎草科(Cyperaceae)、棕榈科(槟榔科)(Palmae(Arecaceae))、天南星科(Araceae)、浮萍科(Lemnaceae)、须叶藤科(Flagellariaceae)、帚灯草科(Restionaceae)、刺鳞草科(Centrolepidaceae)、黄眼草科(Xyridaceae)、谷精草科(Eriocaulaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、鸭跖草科(Commelinaceae)、雨久花科(Pontederiaceae)、田葱科(Philydraceae)、灯心草科(Juncaceae)、百部科(Stemonaceae)、百合科(Liliaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、蒟蒻薯科(箭根薯科)(Taccaceae)、薯蓣科(Dioscoreaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、芭蕉科(Musaceae)、姜科(Zingiberaceae)、美人蕉科(annaceae)、竹芋科(Marantaceae)、水玉簪科(Burmanniaceae)、藜科(Chenopodiaceae)或兰科(Orchidaceae)的植物。在本发明的优选方式中，所述的“植物”为禾本科植物。

如本文所用，术语“提高”、“改良”或“增强”是相互可以交换的并且在应用含义上应当意指与本文中定义的对照植物相比较，至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选的至少15％或20％、更优选25％、30％更高的氮吸收利用能力或更高的生物量、产量(如种子重量或果实重量)。

关于“对照植物”，选择合适的对照植物是实验设计的例行部分，可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应转基因植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同或属于同一类的品种。对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。

OsNPF7.9

在本发明中，除非特别说明，所述OsNPF7.9可以是具有SEQ ID NO:3所示序列的多肽，还包括具有与OsNPF7.9相同功能的序列变异形式。

所述的变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的OsNPF7.9同源性高(比如与SEQ ID NO:3所示的多肽序列的同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有所述OsNPF7.9相同功能的蛋白也包括在本发明内。但是，优选地，所述变异形式的氨基酸序列在相应于SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的第430位和第434位上的氨基酸是保守的。

来源于水稻以外其它物种的与SEQ ID NO:3所示序列的多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中

本发明中，所述的“OsNPF7.9”也包括它们的同源物。应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种的OsNPF7.9，但是获自其它物种、特别是禾本科植物的与所述OsNPF7.9高度同源(如具有70％以上，更特别80％，85％、90％、95％、甚至98％以上序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考虑的范围之内。但是，优选地，所述同源物的氨基酸序列在相应于SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的第430位和第434位上的氨基酸是保守的。

本发明还提供了分离的蛋白，其是OsNPF7.9的片段或在两端添加其它蛋白或标签等形成的。

本发明还提供了一种优选的OsNPF7.9的突变体，相应于SEQ ID NO:3所示的多肽序列，其第433位发生了突变。更佳地，其具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽。更佳地，为了保持蛋白功能的稳定性，所述的氨基酸序列在相应于SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的第430位和第434位上的氨基酸是保守的。

所述的突变体可以运用本领域已知的或者正在发展的任何突变技术进行制备，例如定点突变技术，基于基因编辑的技术等。

本发明还涉及编码本发明的OsNPF7.9多肽或其序列变异形式的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的基因组序列或SEQ ID NO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:3序列的多肽，但与SEQ ID NO:1所示的基因组序列或SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体(变体)，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。优选地，所述的核苷酸序列在相应于SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的第1289位和第1301位上的碱基是保守的。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或多肽编码核酸经基因工程产生的宿主细胞。

本发明中，编码本发明的多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。较佳地，所述表达载体还可选择性地加入抗性元件、筛选(选择)元件或报告基因元件，如Bar、GUS。

所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。

植物改良

基于本发明人的新发现，提供了一种OsNPF7.9或其上调分子的用途，用于：(a)吸收或转运硝酸根，或促进硝酸根的吸收或转运；(b)调控植物的氮素利用效率；(c)调控植物的生物量；和/或(d)调控植物的产量。

同时，本发明也提供了一种调控植物硝酸根吸收或转运、氮素利用效率、生物量或产量的方法，包括：在植物中调控OsNPF7.9的表达或活性；其中，所述的OsNPF7.9包括其同源物。

应理解，在得知了所述OsNPF7.9与硝酸根转运等的相关性后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的OsNPF7.9的表达或活性，这些方法均被包含在本发明中。

可以利用OsNPF7.9的表达或活性的上调剂来上调OsNPF7.9的活性。所述的OsNPF7.9的表达或活性的上调剂包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、“促进”。任何可提高OsNPF7.9蛋白的活性、提高OsNPF7.9基因或蛋白的稳定性、上调OsNPF7.9基因的表达、增加OsNPF7.9蛋白的有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调OsNPF7.9或其编码的蛋白有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。

作为一种优选的实施方式，提供一种上调植物中OsNPF7.9的表达的方法，所述的方法包括：将OsNPF7.9或其编码的蛋白的表达构建物或载体转入植物中。

优选地，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

(1)将外源的本发明的多肽的编码核酸转入植物器官或组织，获得转化入所述多肽的编码核酸的植物组织或器官；和

(2)将步骤(1)获得的转入了外源的本发明的多肽的编码核酸的植物组织或器官再生成植物植株。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有本发明的OsNPF7.9的编码核酸；

(s2)将植物组织或器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使所述多肽的编码核酸转入并且整合到植物细胞的染色体上；

(s3)选择出转入所述OsNPF7.9的编码核酸的植物组织或器官；以及

(s4)将步骤(s3)中的植物组织或器官再生成植物。

作为本发明的优选方式，在制备上述转基因植物时，优选地，使得所转化的OsNPF7.9的第433位为Arg，使得所述植物具有更为理想的硝酸根转运能力、氮素利用能力，生物量或产量更为理想。

本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了所述多肽的编码核酸的转基因植物。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。

植物定向筛选及分子标记

本领域中，技术人员对于植物利用氮素的效率一直没有清晰的了解，现有技术中缺乏鉴定植物氮素利用情况的分子标记。基于本发明人的新发现，本发明提供了适用于鉴定植物对氮素的利用情况以及植物生物量或产量的分子标记，即OsNPF7.9。本发明还提供了针对所述OsNPF7.9设计的特异性分子标记，以及鉴定策略。

因此，本发明提供了一种定向选择农艺性状改良的植物的方法，所述农艺性状改良包括：硝酸根吸收或转运能力提高、氮素利用效率提高、生物量提高或产量提高；所述方法包括：鉴定测试植物体内OsNPF7.9的表达或活性，若该测试植物中OsNPF7.9的表达或活性高于该类植物(对照植物)中OsNPF7.9的表达或活性的平均值，则其为农艺性状改良的植物。

本发明还提供了一种鉴定植物农艺性状的方法，所述农艺性状包括：(i)硝酸根吸收或转运能力，(ii)氮素利用效率；所述方法包括：硝酸根吸收或转运能力提高、氮素利用效率提高、生物量提高、产量提高；所述方法包括：鉴定测试植物体内OsNPF7.9的表达或活性，若该测试植物中OsNPF7.9的表达或活性高于(显著高于，如高5％以上、10％以上、20％以上、40％以上、60％以上、100％以上或更高)该类植物(对照植物)中OsNPF7.9的表达或活性的平均值，则其为硝酸根吸收或转运能力提高、氮素利用效率提高、生物量提高、产量提高的植物。

在优选的实施方式中，所述的植物为水稻，还可以通过鉴定特定位置即相应于OsNPF7.9 CDS序列中第1298位的碱基的碱基序列，来确定所述水稻属于籼稻还是粳稻的概率；若该位点为G，则该植物为籼稻的概率高(如概率高于70％，80％，85％，90％或95％)；若为A，则该植物为粳稻的概率高(如概率高于70％，80％，85％，90％或95％)。

根据本发明的新发现，本领域技术人员可以采用任何本领域公知的或正在发展的多种技术来进行核酸序列的分析，这些技术均可被包含在本发明中。所述的方法例如包括但不限于：测序法，PCR扩增法，探针法，杂交法，限制性酶切分析法，等位基因多态性分析法(如溶解曲线法)进行核酸序列的鉴定，等等。

本发明的鉴定方法，只需进行PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的长度，就可以准确、快速地判断待测样品的表型或产量，成本低廉，适合于大规模鉴定，而且所需的样品量很少。如果需要，本领域技术人员能够设计出鉴定所述分子标记的引物。

获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。

本发明在植物株型和产量性状的分子设计育种及利用基因工程技术进行农作物品种改良等方面具有良好的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、OsNPF7.9基因信息

OsNPF7.9(Os02g46460)基因序列及其结构如下(日本晴(Japonica)，SEQ ID NO:1；其中5’端斜体部分为5’UTR，下划线部分为CDS，3’端斜体部分为3’UTR)：

ATG开始编码，CDS序列如下(日本晴(Japonica)，SEQ ID NO:2)：

编码蛋白序列如下(日本晴(Japonica)，SEQ ID NO:3)：

本发明人将OsNPF7.9与其他NPF家族基因的家族树如图1，这些家族树基因中，即使与OsNPF7.9具有一定同源性的拟南芥中NRT1.5以及NRT1.8，同源性也仅为55.7％、55.6％。

本发明人分析OsNPF7.9的序列结构，其含5个外显子4个内含子，编码610个氨基酸，存在12个跨膜结构域。

实施例2、OsNPF7.9表达模式分析

OsNPF7.9自ATG上游2.5Kb的序列通过PCR扩增以后连入pCAMBIA1300，构建OsNPF7.9promoter::GUS，载体通过农杆菌介导转入ZH11。转基因植株通过HYG检测。GUS染色方法参考文献(Li et al.，2010)。取各组织经GUS染色后，用FAA固定，进行半薄切片实验，切片厚度为6μm，使用显微镜Leica DM6000B观察，照相使用微型彩色电荷耦合器件照相机Leica DFC495。

生长在Yoshida培养液中五天的水稻幼苗，去掉根尖取0.5-1cm的根在FAA溶液中固定，石蜡包埋，组织切片，使用地高辛标记的RNA探针，原位杂交过程参考(Long和Barton，1998)。427bp包含部分3’UTR的基因特异片段通过PCR扩增然后克隆到pGEM T Easy vector(Promega)。正义和反义探针根据说明书通过T7和SP6 RNA polymerase体外合成。

取不同组织进行表达分析，

结果如图2A～G，OsNPF7.9主要表达于维管组织，在幼苗的根中高表达，主要在薄壁细胞中，地上部主要表达于茎中。

实施例3、OsNPF7.9定位于细胞质膜

PCR扩增OsNPF7.9 CDS构建35S::OsNPF7.9-eYFP/PA7，通过聚乙二醇介导的转化方法瞬时表达在拟南芥原生质体(Yoo et al.，2007)。22℃黑暗下培养12h，随后用荧光共聚焦显微镜(Olympus FV1000)观察荧光并拍照。

结果如图3，可见OsNPF7.9定位于细胞质膜。

实施例4、OsNPF7.9电生理特性分析

PCR扩增OsNPF7.9 CDS，通过酶切位点EcoRI、SacI连入pOO2，构建爪蟾卵母细胞异源表达载体。经MluI酶切线性化以后，按说明书操作用MMESSAGE MMACHINE SP6 KIT25RXNS(invitrogen)体外合成cRNA。蛙卵分离以后注射50ngcRNA(1μg/μl)孵育在ND96(96mM NaCl，2mM KCl，1mM MgCl

硝酸根外排实验，操作如前所述(lin et al.，2008)。将注射50ngcRNA并培养44～48h的蛙卵注射50nL K

实施例5、突变体鉴定

本发明人借助EMS诱变方法以及TILLING技术，经过筛选得到两个点突变的突变体osnpf7.9-1、osnpf7.9-2，它们都是在第五个外显子上的点突变，分别在CDS的1301位以及1289位发生了一个碱基的改变(C1301T、C1289T)，导致氨基酸的变化(T434I、T430M)(图5A)。qRT-PCR结果表明，OsNPF7.9的表达量在突变体与野生型(ZH11；除非另外说明，后文“野生型”水稻均为ZH11)之间并没有明显的差别(图5B)。

本发明人进一步分析了该基因在蛋白水平上的变化，实验方法同上，通过对表达相应cRNA卵母细胞的硝酸根吸收及外排功能进行分析表明，OsNPF7.9突变后其硝酸根吸收以及外排功能均丧失(图5C和D)。

植物体内生理功能验证，方法如下：水稻幼苗在Yoshida(2.5mM NH

本发明人用5mM NH

为验证上述假设，本发明人检测了突变体以及野生型木质部伤流液中硝酸根的含量，结果表明两个突变体中硝酸根含量明显低于野生型(图5H)。

这些结果说明，OsNPF7.9参与硝酸根的长途转运，负责将硝酸根由根向地上部转运。

实施例6、OsNPF7.9参与调控植物幼苗高硝酸根条件下的生物量

水稻幼苗在Yoshida(2.5mM NH

氮源替换实验中，氮源分别用不同浓度NH

结果显示，在水培条件下，高硝酸根时突变体生物量降低。以NH

另外，2.5mM硝酸根作为氮源条件下，无论是根还是地上部，突变体生物量均明显低于野生型，用2.5mM铵根作为氮源时，突变体与野生型之间的差异消失。同时，氮源浓度为0.25mM时，无论是硝酸根还是铵根作为氮源，突变体与野生型之间都没有生物量的差异(图6D和E)。

这些结果说明，高硝酸根条件下突变体生物量低于野生型，生物量的提高依赖于OsNPF7.9参与的硝酸根的转运。

实施例7、OsNPF7.9调控产量及氮素利用效率(NUE)

水稻成苗表型在松江大田完成，于每年6月份播种，自2017～2018重复两年。常规田按正常大田施肥情况进行施肥，以尿素为氮源，尿素用量300kg/ha，每行5棵，单棵间距20cm。高低氮实验在松江功能池完成，N、P、K外源施加，以尿素为氮肥，Ca(H

大田表型包括单株分蘖数、生物量、产量以及NUE。NUE为氮肥利用率，为产量与施肥量的比值。

结果如图7，大田条件下osnpf7.9-1、osnpf7.9-2的长势弱于野生型ZH11(图7A)，其生物量也明显降低(图7B)。此外，突变体分蘖数、产量以及NUE明显减少(图7C～F)。统计单株产量，osnpf7.9-1、osnpf7.9-2产量均明显降低，突变体的NUE(以氮肥利用效率计算)明显低于野生型，分别为野生型的46.88％、73.44％。

高氮以及低氮条件下比较突变体与野生型大田表型的差异表明高氮条件下，突变体生物量、分蘖数均明显低于野生型，单株产量以及NUE比野生型减少。其中，产量的增加包括分蘖数增加、结实率增加、枝梗数增加、总粒数增加、千粒重增加。而在低氮条件下，osnpf7.9-1、osnpf7.9-2生物量、分蘖数以及产量、NUE均与野生型无明显差异。

以上结果说明，OsNPF7.9参与调控水稻的产量以及NUE，并且这一过程是高硝酸根依赖的。

实施例8、OsNPF7.9基因在籼稻以及粳稻之间存在分化

本发明人通过序列比对发现，在籼稻和粳稻之间该基因的序列存在一个碱基的差异，并且本发明人将多个籼稻以及粳稻的序列进行比对发现，在籼稻中该基因CDS的1298位主要为G，而粳稻相应位点则主要为A(图8A～C)。

同时，本发明人将在这两个位点有差异的基因分别异源表达于爪蟾卵母细胞中。具体实验方法同上。结果发现，表达籼稻位点基因的卵母细胞的硝酸根吸收能力明显强于表达粳稻位点的卵母细胞(图8D)。

这一结果说明，在该位点为籼稻中相应序列(G)时，基因的硝酸根转运能力可能更强。

本发明人对序列已知的23个籼稻以及26个粳稻品种进行了序列比对，测算结果显示，该位点为G是籼稻的概率高于95％，该位点为A是粳稻的概率高于90％。

籼稻(Oryza Sativa ssp.indica)来源OsNPF7.9蛋白序列如下(SEQ ID NO:4)：

实施例9、OsNPF7.9基因过表达植物的制备

以ZH11为实验材料，提取RNA并反转录得cDNA，以该cDNA为模板，合成OsNPF7.9CDS(编码序列)，通过同源重组的方法，将OsNPF7.9 CDS连入含Ubi启动子的载体，测序正确后转入农杆菌GV1301，将含Ubi

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 参与硝酸根转运的蛋白、其编码基因和用途

<130> 200116

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3500

<212> DNA

<213> 粳稻( Oryza.Sativa L.spp.japonica )

<400> 1

cacttccata gatcccctcc tcttcttcct cctgctcggc ttcctcacac agagcttctc 60

gttgcattag ccgacggagg ccaccggtga ggagagcccg aggaggagca agaaatggtt 120

agtacgtgct catgatttga tcgttcttgg catatatgtt agcaaagcta cacggtttca 180

gcttgtttct gtagcttgtt ggtctgtagc caagattcag ttttgtctcc atgttcagtg 240

atgaaacacc atgcgtatac atggcagcac atgaaactgg aaactaactg acagcatgta 300

acttgatggt tgcagtctgg caacgacgga gacatgaaga tgagggtgat cgtcgtggaa 360

ggcgatgaga cgagtaacgc cccgaaggat gtatgctgcg agtacaccct cgatggctcc 420

gtggatatca agggctcacc ggcggtgaag ggcaagtccg gcggatggct cgccggcggc 480

cttattcttc gtaagtactt tgtgctgaac tctgctgatt tcaccatctc cttcccggct 540

gagacgggcc agcaaaaaat ggagacaaag tcgatgactg ggctttccag tgaagtgttt 600

tcgcaacagt gcaagtcggt ctgaggtgac tcgacgttga ggcttaaagt ggcggtaggc 660

gccgggtctt tacgcggaat gctgcatgac gaggtgacat cggccatgca acgcccacaa 720

ctggagggtt cctcgccacg ggggattcgg gcgcacgcat tactagcgcc acattaggat 780

ctccgtagga gacatcggac atggtatcca cgatgtagca accatgcata gcgatcaaat 840

gatcgatcga tctgtagggt atgtggagta cgatatcgcc ctaccacagt ttggctttat 900

tgctgctttc atgggggagt taagcggcgc actgtttgca tgtgtgcatc gttttatgtt 960

tgtttagaat tattcttgaa ggccttgaca cctttttatt ttgtgtgtgt tgtgcagtga 1020

accagggtct ggcaaccctg gcgttcttcg gggtaaacgt gaacctggtg ttgttcctga 1080

cgagggtgct gcagcagagc aacggcgacg ccgccaacaa cgtgagcaaa tggaccggca 1140

cggtttacat gttctccctc atcggcgcct tcctcagcga ctcctactgg ggccgctaca 1200

agacctgcgc catattccag gccatctttg tccttgtaag caccaccaca cggcacatcc 1260

ctctctctcc gcagttctat ctgaaaacca cgcgcctttc tcggtgcgat cgattgatct 1320

catgtttcta gctacttcgg tctgatctgt tggtcgggca atcatcagtg accagttttt 1380

tccgttctga ttgcccattt cacgggaaat gatggtctat agatgcgtag gaacgtacgt 1440

acaaagtaac agcgattggt gcgggagaat ctgtccagag tggagttaat tcggcctgta 1500

ctctgtactg ggtggattgt atctgcacgt atgctggtgt cgaaagtgga tggtccatat 1560

agtagaggca tagagtagta cgtggtggcg ccgaccggtc ggtcgatcgg cccaaggcac 1620

atcgcggtcg cgttgcgcgt acgcccagga gatgtggatc acgcggctga ctcgttcgcg 1680

tcacggtgtt ttgcctgcag ggcctcgcgc tgctgtccct gtcgtcgcgg ctgtacctga 1740

tcaggccggt cgggtgcggc acggagcacg tgccctgcga gccgcactcc ggcgcggagc 1800

tggggatctt ctacatcgcg ctgtacatga tcgcgttcgg caacggcggg taccagccca 1860

acgtcgccac cttcggcgcc gaccagttcg acggcgagga cccggccgag tcgcactcca 1920

aggtctcctt cttcagctac ttctacctgg cgctcaacct cggctcgctc ttctccaaca 1980

ccttcctcag cttcctcgag gacgagggca actgggcgct cggcttctgg gtctccaccg 2040

ccgccgcggc caccgcgctg ctgctgttcc tcggcggcac gctccgctac cggtacatcc 2100

gccccagcgg caacccggtt ggcaggatct tccaggtcgc gttcgccgcg tgcaggaact 2160

ggaaggccgg cgagtcgccg ggcgccgtga cactctacga gagcgacgag aaggcggatt 2220

ccggtgggag gaagctcctg cacacggaag gtttcaggta aagtgttgtg tggttttgtg 2280

agctgtgaac tgatcacgca tgcacgcact gaactcgcca tgtattgcag gttcttggac 2340

cgtgcggcgg tggtgggcgc taacccgaag cttggcacgt gcacccaacc gcgtgacccc 2400

tggaagctgt gcacggtgac gcaggtggag gaggtgaaga gcatcctgcg gctcctcccc 2460

atctggctct gcaccatcct ctattcggtc gtgttcacgc agatggcgtc gctgttcgtc 2520

gtgcagggcg ccgcgatgcg ccgcaccacc cggttcccgg gcttctccgt cccgccctcc 2580

agcatgtcgg ccttcgacat cctcaccgtc gccaccacca tcttcctgta ccgccgggcc 2640

gtctgcccgc tcgtgtcgcg gctcacgggc cgccacaccg gcccaaccga gctgcagagg 2700

atgggcctcg gcctggtgct cggcgcgatg gccatggcca ccgccggcac ggtcgagcac 2760

ttcaggaagg ccggcgccac cacggcgatg agcagcgacc tgcacatcat gtggcaggtg 2820

ccgcagtacg cgctgatcgg cgtgtcggag gtgatgatgt acgtcggcca gctcgagttc 2880

ttcaacgggg agatgcccga cgcgctcaag agcttcggga gcgcgctctg catgatgtcc 2940

atgtcgctcg gcaactactt cagcgacgtc atcgtgagcg cggtgaccaa ggccaccgcc 3000

gtgcgcggcc gccccggctg gatccccgcc gaccttaacg agggccacct cgacaagttc 3060

ttcttcctgc tcgccgtgct ggccgtcgcg gacttcgccg tgtacctcgt gtgcgcgagc 3120

cggtacagga gtggcacggt ggacgtcgac cggagcgacg gggaggagga ggatggcgtg 3180

gccggcaggc agatggcggc aacggtgtaa gcgtcaggat gaatcggccg tctgctcgcg 3240

ctcgatagat gcatggcagg ctgtcgtggt tcttgagacg gagactgcag actcttcgag 3300

gggatgagtt gcattgggac gagttggttt agcacgacaa gtctccgttg atgataggac 3360

atgcacgggg ggatagtgac acgatactaa agaataagag gtcgcctaca gatgcagtat 3420

tgttctatca tgtacgcctg tgtttcatcg tttcacattt ttctggccaa tgtaacaaga 3480

gaacgcgact gttactgacc 3500

<210> 2

<211> 1833

<212> DNA

<213> 粳稻( Oryza.Sativa L.spp.japonica )

<400> 2

atgtctggca acgacggaga catgaagatg agggtgatcg tcgtggaagg cgatgagacg 60

agtaacgccc cgaaggatgt atgctgcgag tacaccctcg atggctccgt ggatatcaag 120

ggctcaccgg cggtgaaggg caagtccggc ggatggctcg ccggcggcct tattcttctg 180

aaccagggtc tggcaaccct ggcgttcttc ggggtaaacg tgaacctggt gttgttcctg 240

acgagggtgc tgcagcagag caacggcgac gccgccaaca acgtgagcaa atggaccggc 300

acggtttaca tgttctccct catcggcgcc ttcctcagcg actcctactg gggccgctac 360

aagacctgcg ccatattcca ggccatcttt gtccttggcc tcgcgctgct gtccctgtcg 420

tcgcggctgt acctgatcag gccggtcggg tgcggcacgg agcacgtgcc ctgcgagccg 480

cactccggcg cggagctggg gatcttctac atcgcgctgt acatgatcgc gttcggcaac 540

ggcgggtacc agcccaacgt cgccaccttc ggcgccgacc agttcgacgg cgaggacccg 600

gccgagtcgc actccaaggt ctccttcttc agctacttct acctggcgct caacctcggc 660

tcgctcttct ccaacacctt cctcagcttc ctcgaggacg agggcaactg ggcgctcggc 720

ttctgggtct ccaccgccgc cgcggccacc gcgctgctgc tgttcctcgg cggcacgctc 780

cgctaccggt acatccgccc cagcggcaac ccggttggca ggatcttcca ggtcgcgttc 840

gccgcgtgca ggaactggaa ggccggcgag tcgccgggcg ccgtgacact ctacgagagc 900

gacgagaagg cggattccgg tgggaggaag ctcctgcaca cggaaggttt caggttcttg 960

gaccgtgcgg cggtggtggg cgctaacccg aagcttggca cgtgcaccca accgcgtgac 1020

ccctggaagc tgtgcacggt gacgcaggtg gaggaggtga agagcatcct gcggctcctc 1080

cccatctggc tctgcaccat cctctattcg gtcgtgttca cgcagatggc gtcgctgttc 1140

gtcgtgcagg gcgccgcgat gcgccgcacc acccggttcc cgggcttctc cgtcccgccc 1200

tccagcatgt cggccttcga catcctcacc gtcgccacca ccatcttcct gtaccgccgg 1260

gccgtctgcc cgctcgtgtc gcggctcacg ggccgccaca ccggcccaac cgagctgcag 1320

aggatgggcc tcggcctggt gctcggcgcg atggccatgg ccaccgccgg cacggtcgag 1380

cacttcagga aggccggcgc caccacggcg atgagcagcg acctgcacat catgtggcag 1440

gtgccgcagt acgcgctgat cggcgtgtcg gaggtgatga tgtacgtcgg ccagctcgag 1500

ttcttcaacg gggagatgcc cgacgcgctc aagagcttcg ggagcgcgct ctgcatgatg 1560

tccatgtcgc tcggcaacta cttcagcgac gtcatcgtga gcgcggtgac caaggccacc 1620

gccgtgcgcg gccgccccgg ctggatcccc gccgacctta acgagggcca cctcgacaag 1680

ttcttcttcc tgctcgccgt gctggccgtc gcggacttcg ccgtgtacct cgtgtgcgcg 1740

agccggtaca ggagtggcac ggtggacgtc gaccggagcg acggggagga ggaggatggc 1800

gtggccggca ggcagatggc ggcaacggtg taa 1833

<210> 3

<211> 610

<212> PRT

<213> 粳稻( Oryza.Sativa L.spp.japonica )

<400> 3

Met Ser Gly Asn Asp Gly Asp Met Lys Met Arg Val Ile Val Val Glu

1 5 10 15

Gly Asp Glu Thr Ser Asn Ala Pro Lys Asp Val Cys Cys Glu Tyr Thr

20 25 30

Leu Asp Gly Ser Val Asp Ile Lys Gly Ser Pro Ala Val Lys Gly Lys

35 40 45

Ser Gly Gly Trp Leu Ala Gly Gly Leu Ile Leu Leu Asn Gln Gly Leu

50 55 60

Ala Thr Leu Ala Phe Phe Gly Val Asn Val Asn Leu Val Leu Phe Leu

65 70 75 80

Thr Arg Val Leu Gln Gln Ser Asn Gly Asp Ala Ala Asn Asn Val Ser

85 90 95

Lys Trp Thr Gly Thr Val Tyr Met Phe Ser Leu Ile Gly Ala Phe Leu

100 105 110

Ser Asp Ser Tyr Trp Gly Arg Tyr Lys Thr Cys Ala Ile Phe Gln Ala

115 120 125

Ile Phe Val Leu Gly Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser Ser Arg Leu Tyr

130 135 140

Leu Ile Arg Pro Val Gly Cys Gly Thr Glu His Val Pro Cys Glu Pro

145 150 155 160

His Ser Gly Ala Glu Leu Gly Ile Phe Tyr Ile Ala Leu Tyr Met Ile

165 170 175

Ala Phe Gly Asn Gly Gly Tyr Gln Pro Asn Val Ala Thr Phe Gly Ala

180 185 190

Asp Gln Phe Asp Gly Glu Asp Pro Ala Glu Ser His Ser Lys Val Ser

195 200 205

Phe Phe Ser Tyr Phe Tyr Leu Ala Leu Asn Leu Gly Ser Leu Phe Ser

210 215 220

Asn Thr Phe Leu Ser Phe Leu Glu Asp Glu Gly Asn Trp Ala Leu Gly

225 230 235 240

Phe Trp Val Ser Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Leu Leu Leu Phe Leu

245 250 255

Gly Gly Thr Leu Arg Tyr Arg Tyr Ile Arg Pro Ser Gly Asn Pro Val

260 265 270

Gly Arg Ile Phe Gln Val Ala Phe Ala Ala Cys Arg Asn Trp Lys Ala

275 280 285

Gly Glu Ser Pro Gly Ala Val Thr Leu Tyr Glu Ser Asp Glu Lys Ala

290 295 300

Asp Ser Gly Gly Arg Lys Leu Leu His Thr Glu Gly Phe Arg Phe Leu

305 310 315 320

Asp Arg Ala Ala Val Val Gly Ala Asn Pro Lys Leu Gly Thr Cys Thr

325 330 335

Gln Pro Arg Asp Pro Trp Lys Leu Cys Thr Val Thr Gln Val Glu Glu

340 345 350

Val Lys Ser Ile Leu Arg Leu Leu Pro Ile Trp Leu Cys Thr Ile Leu

355 360 365

Tyr Ser Val Val Phe Thr Gln Met Ala Ser Leu Phe Val Val Gln Gly

370 375 380

Ala Ala Met Arg Arg Thr Thr Arg Phe Pro Gly Phe Ser Val Pro Pro

385 390 395 400

Ser Ser Met Ser Ala Phe Asp Ile Leu Thr Val Ala Thr Thr Ile Phe

405 410 415

Leu Tyr Arg Arg Ala Val Cys Pro Leu Val Ser Arg Leu Thr Gly Arg

420 425 430

His Thr Gly Pro Thr Glu Leu Gln Arg Met Gly Leu Gly Leu Val Leu

435 440 445

Gly Ala Met Ala Met Ala Thr Ala Gly Thr Val Glu His Phe Arg Lys

450 455 460

Ala Gly Ala Thr Thr Ala Met Ser Ser Asp Leu His Ile Met Trp Gln

465 470 475 480

Val Pro Gln Tyr Ala Leu Ile Gly Val Ser Glu Val Met Met Tyr Val

485 490 495

Gly Gln Leu Glu Phe Phe Asn Gly Glu Met Pro Asp Ala Leu Lys Ser

500 505 510

Phe Gly Ser Ala Leu Cys Met Met Ser Met Ser Leu Gly Asn Tyr Phe

515 520 525

Ser Asp Val Ile Val Ser Ala Val Thr Lys Ala Thr Ala Val Arg Gly

530 535 540

Arg Pro Gly Trp Ile Pro Ala Asp Leu Asn Glu Gly His Leu Asp Lys

545 550 555 560

Phe Phe Phe Leu Leu Ala Val Leu Ala Val Ala Asp Phe Ala Val Tyr

565 570 575

Leu Val Cys Ala Ser Arg Tyr Arg Ser Gly Thr Val Asp Val Asp Arg

580 585 590

Ser Asp Gly Glu Glu Glu Asp Gly Val Ala Gly Arg Gln Met Ala Ala

595 600 605

Thr Val

610

<210> 4

<211> 610

<212> PRT

<213> 籼稻(Oryza Sativa ssp.indica)

<400> 4

Met Ser Gly Asn Asp Gly Asp Met Lys Met Arg Val Ile Val Val Glu

1 5 10 15

Gly Asp Glu Thr Ser Asn Ala Pro Lys Asp Val Cys Cys Glu Tyr Thr

20 25 30

Leu Asp Gly Ser Val Asp Ile Lys Gly Ser Pro Ala Val Lys Gly Lys

35 40 45

Ser Gly Gly Trp Leu Ala Gly Gly Leu Ile Leu Leu Asn Gln Gly Leu

50 55 60

Ala Thr Leu Ala Phe Phe Gly Val Asn Val Asn Leu Val Leu Phe Leu

65 70 75 80

Thr Arg Val Leu Gln Gln Ser Asn Gly Asp Ala Ala Asn Asn Val Ser

85 90 95

Lys Trp Thr Gly Thr Val Tyr Met Phe Ser Leu Ile Gly Ala Phe Leu

100 105 110

Ser Asp Ser Tyr Trp Gly Arg Tyr Lys Thr Cys Ala Ile Phe Gln Ala

115 120 125

Ile Phe Val Leu Gly Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser Ser Arg Leu Tyr

130 135 140

Leu Ile Arg Pro Val Gly Cys Gly Thr Glu His Val Pro Cys Glu Pro

145 150 155 160

His Ser Gly Ala Glu Leu Gly Ile Phe Tyr Ile Ala Leu Tyr Met Ile

165 170 175

Ala Phe Gly Asn Gly Gly Tyr Gln Pro Asn Val Ala Thr Phe Gly Ala

180 185 190

Asp Gln Phe Asp Gly Glu Asp Pro Ala Glu Ser His Ser Lys Val Ser

195 200 205

Phe Phe Ser Tyr Phe Tyr Leu Ala Leu Asn Leu Gly Ser Leu Phe Ser

210 215 220

Asn Thr Phe Leu Ser Phe Leu Glu Asp Glu Gly Asn Trp Ala Leu Gly

225 230 235 240

Phe Trp Val Ser Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Leu Leu Leu Phe Leu

245 250 255

Gly Gly Thr Leu Arg Tyr Arg Tyr Ile Arg Pro Ser Gly Asn Pro Val

260 265 270

Gly Arg Ile Phe Gln Val Ala Phe Ala Ala Cys Arg Asn Trp Lys Ala

275 280 285

Gly Glu Ser Pro Gly Ala Val Thr Leu Tyr Glu Ser Asp Glu Lys Ala

290 295 300

Asp Ser Gly Gly Arg Lys Leu Leu His Thr Glu Gly Phe Arg Phe Leu

305 310 315 320

Asp Arg Ala Ala Val Val Gly Ala Asn Pro Lys Leu Gly Thr Cys Thr

325 330 335

Gln Pro Arg Asp Pro Trp Lys Leu Cys Thr Val Thr Gln Val Glu Glu

340 345 350

Val Lys Ser Ile Leu Arg Leu Leu Pro Ile Trp Leu Cys Thr Ile Leu

355 360 365

Tyr Ser Val Val Phe Thr Gln Met Ala Ser Leu Phe Val Val Gln Gly

370 375 380

Ala Ala Met Arg Arg Thr Thr Arg Phe Pro Gly Phe Ser Val Pro Pro

385 390 395 400

Ser Ser Met Ser Ala Phe Asp Ile Leu Thr Val Ala Thr Thr Ile Phe

405 410 415

Leu Tyr Arg Arg Ala Val Cys Pro Leu Val Ser Arg Leu Thr Gly Arg

420 425 430

Arg Thr Gly Pro Thr Glu Leu Gln Arg Met Gly Leu Gly Leu Val Leu

435 440 445

Gly Ala Met Ala Met Ala Thr Ala Gly Thr Val Glu His Phe Arg Lys

450 455 460

Ala Gly Ala Thr Thr Ala Met Ser Ser Asp Leu His Ile Met Trp Gln

465 470 475 480

Val Pro Gln Tyr Ala Leu Ile Gly Val Ser Glu Val Met Met Tyr Val

485 490 495

Gly Gln Leu Glu Phe Phe Asn Gly Glu Met Pro Asp Ala Leu Lys Ser

500 505 510

Phe Gly Ser Ala Leu Cys Met Met Ser Met Ser Leu Gly Asn Tyr Phe

515 520 525

Ser Asp Val Ile Val Ser Ala Val Thr Lys Ala Thr Ala Val Arg Gly

530 535 540

Arg Pro Gly Trp Ile Pro Ala Asp Leu Asn Glu Gly His Leu Asp Lys

545 550 555 560

Phe Phe Phe Leu Leu Ala Val Leu Ala Val Ala Asp Phe Ala Val Tyr

565 570 575

Leu Val Cys Ala Ser Arg Tyr Arg Ser Gly Thr Val Asp Val Asp Arg

580 585 590

Ser Asp Gly Glu Glu Glu Asp Gly Val Ala Gly Arg Gln Met Ala Ala

595 600 605

Thr Val

610