一种金鲳鱼片风味成分的分析方法

技术领域

本发明涉及食品技术领域，尤其是涉及一种金鲳鱼片风味成分的分析方法。

背景技术

金鲳鱼体内含水量高，营养丰富，为微生物的生长繁殖提供了有利的条件，使鱼肉易发生腐败变质。随着金鲳鱼产量不断增加，营养、安全、方便的金鲳鱼制品的需求量日益增大，并逐步成为消费者的共识。

目前，金鲳鱼加工形式以条冻、鱼片、鱼丸和调味制品为主，冷冻过程易造成鱼肌肉中的水分散失和蛋白变性，导致鱼肉的感官品质变差。因此，通过不同的加工技术延长鱼肉的贮藏期显得尤为重要。干燥可使酶失活，抑制微生物生长繁殖，有效防止或延缓产品品质劣变，最大限度地保留水产品特有风味质地，同时还可以节省包装和运输费用。

因此，研究金鲳鱼片的干燥方式尤为重要。除了日晒的传统的干燥方法外，越来越多的新型的干燥技术，包括真空冷冻干燥(VFD)、真空微波干燥(VMD)、热风干燥(HAD)、微波干燥(MD)、热泵干燥(HPD)和红外干燥等，逐渐应用于水产品的加工。

因此，开发一种适合的干燥方式使得干燥的金鲳鱼片对蛋白质降解具有保护作用同时风味良好。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决技术问题在于提供一种金鲳鱼片风味成分的干燥方法和分析方法，干燥的金鲳鱼片对蛋白质降解具有保护作用同时风味良好。

本发明提供了一种金鲳鱼片风味成分的分析方法，包括：

A)将金鲳鱼干制，得到干制后的金鲳鱼；

B)将干制后的金鲳鱼采用同时蒸馏萃取得到提取液；

C)将提取液浓缩后进行GC-MS分析；

检测条件为：

色谱柱：HP-5MS弹性毛细管柱；

升温程序：柱初始温度40℃，保持3min，以3℃/min升至100℃，然后以5℃/min的速度加热到230℃保持5min。

优选的，步骤A)所述干制具体为真空冷冻干燥、真空微波干燥、热风干燥或微波干燥。

优选的，所述

真空冷冻干燥的参数具体为：-80℃预冷冻10～12h，而后置于冻干机中-40℃下干燥500～600min；

真空微波干燥的参数具体为：功率300～350W；真空度为0.06～0.07Mpa；干燥时间为15～20min；干燥温度为80～90℃；

热风干燥的参数具体为：温度60～70℃；时间250～280min；

微波干燥的参数具体为：功率300～330W；时间为10～12min。

优选的，所述干制后的金鲳鱼的水分含量为10wt％～12wt％。

优选的，所述同时蒸馏萃取的萃取液为二氯甲烷；萃取时间为2.5～3h。

优选的，载气为He；载气流量为：0.8mL/min；不分流进样。

优选的，所述色谱柱规格为30m×0.25mm，0.25μm。

优选的，进样口温度为280℃；离子源温度为230℃；四极杆温度为150℃；扫描为全扫描；扫描范围为30-550m/z，电离电压为70eV；溶剂延迟3min。

优选的，所述浓缩具体为：用旋蒸仪浓缩后采用氮气吹扫浓缩。

优选的，金鲳鱼干制前进行预处理，所述预处理具体为：

将金鲳鱼去皮去内脏，然后将鱼的背部区域切成约25mm×20mm×3mm的鱼片，用滤纸吸去表面水分，待用。

与现有技术相比，本发明提供了一种金鲳鱼片风味成分的分析方法，包括：A)将金鲳鱼干制，得到干制后的金鲳鱼；B)将干制后的金鲳鱼采用同时蒸馏萃取得到提取液；C)将提取液浓缩后进行GC-MS分析；检测条件为：色谱柱：HP-5MS弹性毛细管柱；升温程序：柱初始温度40℃，保持3min，以3℃/min升至100℃，然后以5℃/min的速度加热到230℃保持5min。本发明利用真空微波、真空冷冻、微波和热风四种方法对金鲳鱼片进行干制，对干制鱼片的品质定性定量分析，首次揭示真空微波干制对金鲳鱼片蛋白质降解的保护作用及机制。同时本发明利同时蒸馏萃取-气相色谱-质谱联用技术准确构建干制鱼片气味和滋味成分的图谱。

附图说明

图1是新鲜金鲳鱼片样品示意图；

图2是干制金鲳鱼片样品示意图；

图3是干燥过程中金鲳鱼片的T2弛豫时间的关系图；

图4是不同干燥方法对金鲳鱼片蛋白质热稳定性的影响的示意图；

图5是不同干燥方法对金鲳鱼片TBARS含量的影响的示意图；

图6是不同干制金鲳鱼片肌原纤维蛋白的SDS-PAGE示意图；图中条带1表示VFD，2表示VMD，3表示HAD，4表示MD；MHC表示肌球蛋白重链，Actin表示肌动蛋白；

图7是干燥金鲳鱼片的傅里叶变换红外光谱图的关系图；

图8是不同干燥方法对金鲳鱼片IMP、Hx和HxR含量的影响的关系图；

图9是干燥金鲳鱼片的PC1与PC2(A)、PC1与PC3(B)、PC2与PC3(C)的主成分图，以及PC1与PC2(a)、PC1与PC3(b)、PC2与PC3(c)的旋转空间组分图(n＝6)的关系图。C00：苦涩；AAE：鲜味；CT0：咸味；CA0：酸味；AE1：涩；

图10是干燥鱼片挥发性风味成分的GC-MS总离子色谱图(TIC图)(A)、香味成分的比较(％)(B)的示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种金鲳鱼片风味成分的分析方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种金鲳鱼片风味成分的分析方法，包括：

A)将金鲳鱼干制，得到干制后的金鲳鱼；

B)将干制后的金鲳鱼采用同时蒸馏萃取得到提取液；

C)将提取液浓缩后进行GC-MS分析；

检测条件为：

色谱柱：HP-5MS弹性毛细管柱；

升温程序：柱初始温度40℃，保持3min，以3℃/min升至100℃，然后以5℃/min的速度加热到230℃保持5min。

本发明提供的一种金鲳鱼片风味成分的分析方法首先将金鲳鱼干制，得到干制后的金鲳鱼。

本发明金鲳鱼干制前进行预处理，所述预处理具体为：

将金鲳鱼去皮去内脏，然后将鱼的背部区域切成约25mm×20mm×3mm的鱼片，用滤纸吸去表面水分，待用。

将上述切好的金鲳鱼片放置于玻璃器皿中，采用四种不同干燥方式：真空冷冻干燥(VFD)、真空微波干燥(VMD)、热风干燥(HAD)、微波干燥(MD)对金鲳鱼片进行干燥；

本发明所述干制后的金鲳鱼的水分含量为10wt％～12wt％。

具体的：

真空冷冻干燥的参数具体优选为：-80℃预冷冻10～12h，而后置于冻干机中-40℃下干燥500～600min；更优选为：-80℃预冷冻11～12h，而后置于冻干机中-40℃下干燥540～560min；

真空微波干燥的参数优选具体为：功率300～350W；真空度为0.06～0.07Mpa；干燥时间为15～20min；干燥温度为80～90℃；更优选具体为：

功率300～320W；真空度为0.07Mpa；干燥时间为17～18min；干燥温度为85～86℃；

热风干燥的参数优选具体为：温度60～70℃；时间250～280min；更优选为：温度65～70℃；时间260～270min；

微波干燥的参数优选具体为：功率300～330W；时间为10～12min；更优选为功率300～310W；时间为10～12min。

特别优选的，真空微波干燥。

本发明人发现，真空微波干燥干制对金鲳鱼片蛋白质降解具有保护作用。

将干制后的金鲳鱼采用同时蒸馏萃取得到提取液。

本发明所述同时蒸馏萃取的萃取液为二氯甲烷；所述二氯甲烷为重蒸二氯甲烷；更优选的，将二氯甲烷重新蒸馏，去掉前、后30mL馏分，取中间二氯甲烷馏分备用，重蒸后的二氯甲烷经GC-MS检测无杂质峰出现。

同时蒸馏萃取具体为：将的搅碎样品与蒸馏水混合，置于同时蒸馏萃取仪的重相一侧；装有重蒸二氯甲烷的圆底烧瓶放于萃取仪的另一侧，加入适量沸石，加热使装置的两端处于沸腾状态。待出现回流时开始计时，提取完毕，将溶剂侧的萃取液与U型管中的溶剂层合并，加入适量的无水硫酸钠干燥，置于-18℃冰箱中过夜，过滤除去硫酸钠得提取液。所述萃取时间为2.5～3h。

萃取后为浓缩，所述浓缩具体为：用旋蒸仪浓缩后采用氮气吹扫浓缩。

将提取液浓缩后进行GC-MS分析。

检测条件为：

色谱柱：HP-5MS弹性毛细管柱；30m×0.25mm，0.25μm。

升温程序：柱初始温度40℃，保持3min，以3℃/min升至100℃，然后以5℃/min的速度加热到230℃保持5min。

本发明载气为He；载气流量为：0.8mL/min；不分流进样。

按照本发明，进样口温度为280℃；离子源温度为230℃；四极杆温度为150℃；

扫描为全扫描；扫描范围为30-550m/z，电离电压为70eV；溶剂延迟3min。

本发明提供了一种金鲳鱼片风味成分的分析方法，包括：A)将金鲳鱼干制，得到干制后的金鲳鱼；B)将干制后的金鲳鱼采用同时蒸馏萃取得到提取液；C)将提取液浓缩后进行GC-MS分析；检测条件为：色谱柱：HP-5MS弹性毛细管柱；升温程序：柱初始温度40℃，保持3min，以3℃/min升至100℃，然后以5℃/min的速度加热到230℃保持5min。本发明利用真空微波、真空冷冻、微波和热风四种方法对金鲳鱼片进行干制，对干制鱼片的品质定性定量分析，首次揭示真空微波干制对金鲳鱼片蛋白质降解的保护作用及机制。同时本发明利同时蒸馏萃取-气相色谱-质谱联用技术准确构建干制鱼片气味和滋味成分的图谱。

本发明优选采用如下方式对金鲳鱼片进行测定：

用质构仪测定鱼片的硬度、弹性、咀嚼性和内聚性。选取TA41直径6mm平底圆柱形探头，测试前后的测试速度均设置为1mm/s；

使用差式扫描量热仪(DSC)测定了干燥金鲳鱼片的蛋白质热稳定性。

横向弛豫时间(T

同时，对于脂肪酸测定、硫代巴比妥酸值(TBARS)的测定、氨基酸组成分析、肌原纤维蛋白的SDS-PAGE测定、傅里叶红外光谱仪(FTIR)的测定、干燥金鲳鱼片的ATP及其关联物含量的测定等实施例已经有了清楚的描述，在此不再赘述。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种金鲳鱼片风味成分的分析方法进行详细描述。

实施例1

材料预处理：

金鲳鱼的重量为780～820g，长度为20～25cm。将金鲳鱼去皮去内脏，然后将鱼的背部区域切成约25mm×20mm×3mm的鱼片，用滤纸吸去表面水分，待用。

实施例2

将上述切好的金鲳鱼片放置于玻璃器皿中(参见图1，图1是新鲜金鲳鱼片样品示意图；)，采用四种不同干燥方式：真空冷冻干燥(VFD)、真空微波干燥(VMD)、热风干燥(HAD)、微波干燥(MD)对金鲳鱼片进行干燥。直到鱼片含水量在10～12％之间。

实施例2中保证每个玻璃器皿中的鱼片质量相差≦1g。

取实施例1中的鱼片进行热风干燥，设置温度为70℃，连续干燥270min，室温储藏备用。

其中室温温度为25℃。

取实施例1中的鱼片进行微波干燥，将样品放在微波炉中，使鱼片在300W功率下干燥的10～12min，冷却，室温储藏备用。干燥温度为85～95℃。

取实施例1中的鱼片进行真空微波干燥，取相同质量的鱼片放在真空微波干燥箱中，设置功率为300W，真空度为0.07MPa，干燥时间约为18min，取出样品冷却至室温，待用。真空微波干燥箱功率为300W，真空度为0.07MPa，干燥时间约为18min，干燥温度大约为85℃。

取实施例1中的鱼片进行真空冷冻干燥，先将鱼片先放在-80℃冰箱中预冻12h，然后置于冻干机中在-40℃条件下干燥540min，取出样品，待用。

干燥鱼片的最终水分含量为10.9％～11.4％(参见图2，图2是干制金鲳鱼片样品示意图)。

实施例3干燥金鲳鱼片的质构的测定：

用质构仪测定鱼片的硬度、弹性、咀嚼性和内聚性。选取TA41直径6mm平底圆柱形探头，测试前后的测试速度均设置为1mm/s，样品的变形量为50％(参见表1)。

表1不同干燥方法对金鲳鱼片质构的影响

同一行不同字母表示数据间存在显著性差异(P<0.05)。

实施例4

干燥金鲳鱼片干燥过程中的水分迁移规律的测定：

横向弛豫时间(T

MRI成像：用标准样进行仪器采样前校正后，将鱼片以同样的方式放在磁体腔中，利用MRI软件对样品的水分分布成像。测试条件：field of view＝100mm×100mm，slicewidth＝3.4mm，slice gap＝1.3mm，average＝4，read size＝256，phase size＝192，T

T

表2干燥过程中金鲳鱼水分T

同一列的不同字母表示数据间存在显著性差异(P<0.05)。.

实施例5使用差式扫描量热仪(DSC)测定了干燥金鲳鱼片的蛋白质热稳定性。

取280～320mg的粉碎鱼肉和680～720μL蒸馏水混合均匀。然后将180～220mg混匀样品放入样品盘中，以1℃/min的速度从20℃加热到100℃。结果显示，干燥过程影响了金鲳鱼肌肉蛋白的热性能，VFD样品的热稳定性优于其他三个样品(参见图4)。

实施例6总脂肪含量

取0.8～1.2g粉碎金鲳鱼片，加入8～12mL氯仿–甲醇混合液，充分浸提，过滤后加入8～10mL氯化钾溶液，震荡15min后离心，取下层氯仿层，氮气吹干后称重，测得总脂肪含量(参见表3)。其中氯仿–甲醇混合液体积比为2:1。

实施例7脂肪酸测定

将实施例6中粗脂肪甲酯化，分别取1.8～2.1mg不同干燥的鱼油样品，加入1.2～1.8mL正己烷溶解，加入40μL乙酸甲酯和100μL甲醇钠–甲醇溶液，涡旋震荡混匀，室温下反应20min后立即冷冻10min，迅速加入60μL草酸，离心弃去沉淀，滤液用无水硫酸钠过滤以除去水分，氮气吹干后，加入0.8～1.2mL正己烷，以供气相色谱分析(参见表3)。

实施例7中甲醇钠–甲醇溶液浓度为0.5N。

实施例7中冷冻温度为–20℃。

表3不同干燥方法对金鲳鱼片脂质和脂肪酸的影响

“ND”：未检测出；∑SFA：饱和脂肪酸总和；∑MUFA：单不饱和脂肪酸总和；∑PUFA：多不饱和脂肪酸总和；∑n-3PUFA：n-3多不饱和脂肪酸总和；∑n-6PUFA：n-6多不饱和脂肪酸总和；每一行的小写字母表示不同样品同一脂肪酸之间的差异显著(P<0.05)。VFD：真空冷冻干燥；VMD：真空微波干燥；HAD：热风干燥；MD：微波干燥。

实施例8干燥金鲳鱼片的硫代巴比妥酸值(TBARS)的测定

将4.8～5.2g粉碎的样品与48～52mL三氯乙酸混合。随后，将混合物过滤，并取5mL滤液于试管中，加入4～6mL硫代巴比妥酸(TBA)溶液。95℃加热10min后，用分光光度计测定上清液在532nm处的吸光度。采用丙二醛(MDA)构建标准曲线，结果以mg丙二醛当量/kg表示(mg MDAeq/kg)。结果显示，VMD鱼片的TBARS值明显低于HAD的鱼片，但高于VFD的鱼片(参见图5)。

实施例9样品氨基酸组成分析

称取18～22mg粉碎干燥鱼肉，置于20mL安瓿瓶中，加入8～12mL的6mol/L盐酸，并在真空下密封。随后，密封好的安瓿瓶放在110℃的烘箱中水解22h取出，冷却至室温。再取0.4～0.6mL过滤后的样品放入试管中，氮气吹干，加入10mL样品稀释液。混匀后过0.22μm滤膜，过滤液用全自动氨基酸分析仪测定干燥鱼片中氨基酸的含量(参见表4)。

其中盐酸浓度为6mol/L。

表4不同干燥方法对金鲳鱼片蛋白质和氨基酸的影响(g/100g)

同一行中具有不同上标字母的值存在显著差异(P<0.05)。VFD：真空冷冻干燥；VMD：真空微波干燥；HAD：热风干燥；MD：微波干燥。

实施例10

干燥鱼片肌原纤维蛋白的SDS-PAGE测定：

使用SDS-PAGE对样品中的肌原纤维蛋白质进行分离。将干燥鱼肉的肌原纤维蛋白提取液(5mg/mL)与2X上样缓冲液1:1混合后，100℃下沸水浴4～6min，离心5min，按表2配方配置12％分离胶和5％浓缩胶，待胶凝后，将其放入电泳槽中，加入电极缓冲液，拔掉梳子后，每孔加入7～9μL的蛋白Marker和6～8μL的蛋白样品，先在80V电压下电泳30min，当样品进入分离胶时，电压调为120V，继续电泳至Marker至分离胶底部，停止电泳，取下胶板于染色液中染色40min。染色结束后，使用蒸馏水冲洗分离胶，摇床脱色过夜，待分离胶中条带清晰，停止，并再次用蒸馏水冲洗后拍照分析。

步骤10中肌原纤维蛋白提取液浓度为5mg/mL。

表5 SDS-PAGE试剂配方

表6 SDS-PAGE凝胶配方

结果显示，干燥温度越高，蛋白质降解速度越快。因此，不同干燥方式对鱼片的蛋白分子量分布有不同的影响(参见图6，图6是不同干制金鲳鱼片肌原纤维蛋白的SDS-PAGE示意图；图中条带1表示VFD，2表示VMD，3表示HAD，4表示MD；MHC表示肌球蛋白重链，Actin表示肌动蛋白)。

实施例11干燥金鲳鱼片傅里叶红外光谱仪(FTIR)的测定：

将8～12mg冻干鱼肉肌纤维样品与100mg KBr粉末混合后压片，然后使用傅里叶红外光谱仪在4000-400cm

实施例12干燥金鲳鱼片的ATP及其关联物含量的测定

准确称取8～12mg ATP，ADP，AMP，IMP和HxR标准品用流动相定容到10mL，再稀释到0.200μg/mL、0.500μg/mL、1.00μg/mL、5.00μg/mL、15.00μg/mL和40.00μg/mL。然后准确称取5mg Hx用流动相定容到10mL，再稀释到0.100μg/mL、0.250μg/mL、0.500μg/mL、2.50μg/mL、7.50μg/mL、20.00μg/mL和50.00μg/mL来配置标准液。

流动相磷酸氢二钾的浓度为0.02mol/L，磷酸二氢钾体积比为1:1。

标准液要现配现用。

称取粉碎后的四种干燥鱼片各0.8～1.2g于烧杯中，加入8～12mL10％高氯酸，均质，离心。将上清液转移到烧杯中，沉淀加入4～6mL5％高氯酸洗涤，离心，合并上清液。重复上述操作1次。上清液用KOH的调节pH至6.0后，用超纯水定容至25mL。摇匀并用0.22μm膜过滤，样品提取完成后，冷冻储藏备用。

离心条件，温度为4℃，4320g，时间为15min。

将提取的样品放置4℃储存。

设置色谱柱：ZORBAXSB-Aq(4.6×250mm，5μm)液相色谱柱。流动相：0.02mol/L磷酸氢二钾：磷酸二氢钾(1:1，v/v)，流速为0.8mL/min。柱温：28℃；进样量：20μL；测试波长：254nm对样品进行检测。结果显示，不同的干燥方式对干燥鱼片的味道有重要影响(参见图7)。MD和VMD样品的IMP含量高于HAD样品，但显著低于VFD样品。而HAD鱼片中HxR和Hx的含量明显高于其他三种干燥方式(参见图8，图8是不同干燥方法对金鲳鱼片IMP、Hx和HxR含量的影响的关系图)。

实施例13

将1.8～2.2g的搅碎鱼肉与18～22mL的蒸馏水混合，磁力搅拌浸提30min，然后在4℃，5000g条件下离心10min，取上清液，过滤后倒入电子舌专用烧杯中，采用TS-5000Z电子舌对其进行测定。

TS-5000Z对味觉传感系统配有7个化学传感器，分别代表不同的味觉和3个相应的参比电极：苦味(AC0，AN0，C00)，鲜味(AAE)，咸味(CT0)，酸味(CA0)和涩味(AE1)。电子舌分析参数：传感器分别在清洗溶液(90s)和参比溶液(120s+120s)中清洗后，对样品溶液数据采集，采集时间为25～30s。结果显示，在PCA图中，MD和VMD鱼片的空间区域相距较近或部分重叠，说明这两种干燥鱼片味道相对相似(参见图9；图9是干燥金鲳鱼片的PC1与PC2(A)、PC1与PC3(B)、PC2与PC3(C)的主成分图，以及PC1与PC2(a)、PC1与PC3(b)、PC2与PC3(c)的旋转空间组分图(n＝6)的关系图。C00：苦涩；AAE：鲜味；CT0：咸味；CA0：酸味；AE1：涩)。

实施例14挥发性化合物的提取

将二氯甲烷重新蒸馏，去掉前、后30mL馏分，取中间二氯甲烷馏分备用，重蒸后的二氯甲烷经GC-MS检测无杂质峰出现。

将38～42g的搅碎样品与360mL蒸馏水混合，置于同时蒸馏萃取仪的重相一侧；装有50mL重蒸二氯甲烷的250mL圆底烧瓶放于萃取仪的另一侧，加入适量沸石，加热使装置的两端处于沸腾状态。待出现回流时开始计时3h，提取完毕，将溶剂侧的萃取液与U型管中的溶剂层合并，加入适量的无水硫酸钠干燥，置于-18℃冰箱中过夜，过滤除去硫酸钠得提取液。所得提取液用旋蒸仪浓缩至5mL，用氮气吹扫浓缩至0.5mL，得浓缩液，用GC-MS分析(参见图10A；图10是干燥鱼片挥发性风味成分的GC-MS总离子色谱图(TIC图)(A)、香味成分的比较(％)(B)的示意图)。

实施例15

将实施例14制备的浓缩液进行挥发性化合物的GC-MS分析：

色谱柱：HP-5MS弹性毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)。升温程序：柱初始温度40℃，保持3min，以3℃/min升至100℃，然后以5℃/min的速度加热到230℃保持5min；进样口温度：250℃，载气流量(He)：0.8mL/min；不分流。

MS条件：进样口、离子源、四极杆温度分别为280℃、230℃、150℃；扫描范围为30-550m/z，电离电压为70eV；溶剂延迟3min。

金鲳鱼片的水分在不同干燥条件下水分损失的方式不同，导致微观结构下鱼片存在不同数量的气孔。四种干燥鱼片中共检测出86种挥发性化合物(参见图7)。挥发性化合物主要为烃类(39)、醛类(15)、酯类(10)和醇类(9)。在VFD、HAD、MD和VMD鱼片中，分别测定出63、54、48和37种挥发性物质(参见表7与图10B)。

表7不同干燥方式鱼片挥发性风味成分的相对含量

续表7不同干燥方式鱼片挥发性风味成分的相对含量

续表7不同干燥方式鱼片挥发性风味成分的相对含量

ND：未检测到。VFD：真空冷冻干燥；VMD：真空微波干燥；HAD：热风干燥；MD：微波干燥。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。