一种金纳米簇及其制备方法与在制备放射动力学治疗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学材料技术领域，具体地说，涉及一种金纳米簇及其制备方法与在制备放射动力学治疗肿瘤药物中的应用。

背景技术

放射治疗是用放射线局部治疗肿瘤的一种方式。放射线包括放射性同位素产生的α、β、γ射线和各类X射线治疗机或加速器产生的X射线、电子线、质子束及其他粒子束等。伦琴发现X射线和居里夫人发现镭之后，便开启了肿瘤放射治疗的时代(

如何既高效杀伤肿瘤细胞又能避免对正常细胞的伤害，这是历代科学家面临的挑战。很多方法被尝试来增强肿瘤对射线的敏感度，一种有效的方式就是把高原子序数的材料输送到肿瘤部位，在低剂量射线照射下可明显区分正常组织与肿瘤部位。这种高原子序数材料具有强吸收射线的特征，像碘，钆和金纳米材料，被称为放射敏化剂(radiosensitizer)。放射动力学治疗(Radiodynamic therapy，RDT)是射线结合光敏剂或放射敏化剂治疗肿瘤的一种新兴的方法。

近年来，金纳米材料因生物相容性好，易合成，可调控尺寸，大相互作用截面及高质量能量系数等特征受到科学家的关注，用于放射动力学治疗中的敏化剂，达到增强肿瘤治疗的效果。Zhang的GSH-Au

现有已知的一种金纳米簇AuNCs@DHLA在发明专利“金纳米簇在制备治疗肿瘤药物中的应用(CN201810411468.8)”中已有公开，虽然其也涉及金纳米簇对肿瘤的杀伤，但是该专利是基于金纳米簇的光动力学治疗(Photodynamic therapy,PDT)，而非放射动力学治疗(Radiodynamic therapy,RDT)。两种疗法涉及的激发光源、作用机理、适用范围等存在巨大差异，经研究发现，以CN201810411468.8中方法制备得到的金纳米簇AuNCs@DHLA并不能在放射动力学治疗中取得理想的效果，故仍有必要对如何使金纳米材料在低X射线剂量下，即可有效杀死肿瘤细胞的方案进行研究。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明的目的之一是提供一种在放射动力学治疗肿瘤时，可在低X射线剂量下，实现有效肿瘤细胞杀死效果的新型金纳米簇(Gold clusters,AuNC)纳米材料及其合成方法与应用。

为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

一种制备金纳米簇的方法，所述金纳米簇为AuNCs@DHLA，其包括：

(1)以氯金酸为原料，以二氢硫辛酸和硼氢化钠为还原剂，制备金纳米颗粒；氯金酸、二氢硫辛酸和硼氢化钠的摩尔质量比为1：(2.8-3.2)：(7-9)；

(2)再以二氢硫辛酸通过化学蚀刻法制备所述金纳米簇。

本发明对金纳米簇的制备进行了深入的研究，不同于先前采用超声法进行制备，本发明先用二氢硫辛酸或/和硼氢化钠还原剂将氯金酸还原生成金纳米颗粒，在此基础上，再用二氢硫辛酸蚀刻金纳米颗粒进而得到金纳米簇。本发明发现以特定原料配比采用化学蚀刻法进行金纳米簇的制备，获得的产品具有良好的生物兼容性，并可实现在低剂量X射线下，更有效的肿瘤细胞杀死效果。

优选，步骤(1)中氯金酸、二氢硫辛酸和硼氢化钠的摩尔质量比为1：3：8，以利于使合成的金纳米颗粒尺度更均匀。

本发明方法步骤(2)中，二氢硫辛酸的用量与步骤(1)中所述氯金酸的摩尔质量比为(3-5)：1，优选为4.5:1。以利于合成的金纳米簇荧光强度更强且在水溶液中分散性更好。

本发明方法步骤(2)中，先将所述金纳米颗粒分散在pH为11-13的碱性溶液中，补加水至pH为10-12后，再与二氢硫辛酸混合，调整反应体系pH为5.0-6.0之后在油浴中进行反应。

本发明发现在化学蚀刻时，先将金纳米颗粒分散在pH为11-13的碱性溶液中，可使其获得良好的分散性，之后在进行二氢硫辛酸混合前补加特定量的水，可既进一步稀释金纳米颗粒以利于后续与二氢硫辛酸的混合，又可使金纳米颗粒仍保持理想的分散性以利于保证后续金纳米簇的蚀刻效果，进而保证终产品的治疗效果。

本发明还研究发现，金纳米颗粒在与二氢硫辛酸油浴加热反应前，反应体系的pH值十分关键，其在本发明限定范围内时可既保证蚀刻反应顺利进行，又保证获得的金纳米簇具有均一、理想的构型，进而保证应用效果。若pH值过高，则反应时间过长且难以合成满足需求的金纳米簇结构，若pH值过低，则沉淀很容易析出，难以控制金纳米簇的质量及尺寸的一致性。

作为一个具体优选方式，本发明方法包括：

(1)将氯金酸的醇溶液在冰浴条件下与DHLA混合，之后与硼氢化钠水溶液混合进行还原反应，通过将反应溶液的pH值调为酸性沉淀反应物以获得金纳米颗粒；

(2)将所述金纳米颗粒与pH值为11.9的碱性溶液混合，并补加水后至pH为10.4后与DHLA混合，接着调整反应体系的pH值为5.6，在40-60℃油浴中反应(可为3-18小时)，出现沉淀后继续蚀刻1-6h，待反应结束后，离心分离沉淀获得所述金纳米簇。

本发明方法步骤(1)中，所述氯金酸的醇溶液的摩尔浓度为5-10mM，所述还原反应的时间为0.5-1.5小时，在沉淀反应物后还包括以酸性溶液进行洗涤离心的步骤；

和/或，步骤(2)中，所述离心的速率为4000-7000rpm。

油浴反应在低速搅拌(300-600r/min)下进行。

本发明另提供一种金纳米簇，其由上述方法制备得到。

所述金纳米簇由1～200个金原子组成，直径为0.1～10纳米。

本发明将上述获得的金纳米簇与肿瘤细胞共培养，实验结果显示金纳米簇可吸附在细胞膜上，结合X射线照射，可产生大量的ROS进而有效杀伤肿瘤细胞。通过荷瘤小鼠实验，发现该金纳米簇通过超低的X射线剂量对肿瘤的生长起到显著的抑制治疗效果。因此，本发明还提供一种上述金纳米簇在制备放射动力学治疗肿瘤药物中的应用。

本发明的应用中，所述放射动力学治疗肿瘤药物在0.001-3.0Gy X射线下照射使用，优选为0.25Gy。

所述肿瘤为包括肝癌在内的或/和其他的深部肿瘤，以及浅表肿瘤。

本发明提供了一种基于金纳米簇的放射动力学疗法，该疗法在上述金纳米簇存在情况下，结合低剂量X射线，可实现深层肿瘤的治疗。区别于传统的放射治疗，本发明所述方法主要作用机理是：在X射线照射下，特定金纳米簇诱发大量的自由基，进而起到杀伤肿瘤的目的。

本发明的有益效果至少在于：

本发明涉及的金纳米簇纳米材料可用于X射线动力学治疗肿瘤，其具有如下优点：

1)本发明的金纳米簇纳米材料对X射线具有强吸收的特征。

2)本发明的金纳米簇纳米材料经X射线照射后可产生大量的ROS,在不影响杀伤肿瘤细胞效率的同时可大幅度降低X射线的辐照剂量。

3)本发明的金纳米簇纳米材料在用于放射动力学治疗肿瘤时，所需的剂量非常低，使用的照射剂量平均每次为0.25Gy。

4)本发明的金纳米簇纳米材料溶液分散性好，具有良好的生物安全性，细胞层面的实验证明该系统无明显的毒副作用。

附图说明

图1为金纳米簇对X射线的吸收性能结果。图中，(A)为不同浓度金纳米簇X射线成像图；(B)为不同浓度的金纳米簇与CT值的对应关系；(C)为荷瘤小鼠模型的CT成像。

图2为金纳米簇的放射动力学性质测试结果。图中，(A)为金纳米簇超氧阴离子自由基产生情况；(B)、(C)、(D)为金纳米簇溶液自由基生成种类测试结果；(E)为金纳米簇在X射线照射后肿瘤细胞产生ROS的结果；(F)为金纳米簇在不同剂量X射线照射后肿瘤细胞产生ROS的测试结果。

其中，(B)中**代表与0mg/mL浓度的金纳米簇相比，0.2-1.0mg/mL浓度的金纳米簇在不同剂量的X射线下产生的超氧阴离子O

图3为金纳米簇的放射动力学效应对肿瘤细胞的抑制作用统计结果。图中，**代表p<0.01，有极显著性差异。

图4为金纳米簇的放射动力学疗法RDT对肿瘤细胞的杀伤作用统计结果。图中，**代表p<0.01，有极显著性差异；N.S.表示无显著差异。

图5为金纳米簇的放射动力学疗法RDT对肿瘤细胞的DNA破坏统计结果。图中，**代表p<0.01，有极显著性差异。

图6为金纳米簇的放射动力学疗法RDT对小鼠肿瘤的杀伤作用统计结果。图中，**代表p<0.01，有极显著性差异。

图7为小鼠体重随天数的变化曲线。

图8为小鼠血常规统计结果。图中，*代表p<0.05，表示与正常小鼠相比，荷瘤小鼠的血小板压积(PCT)有显著性差异。

图9为小鼠血生化统计结果。图中，*代表p<0.05，表示与正常小鼠相比，RDT荷瘤小鼠的白蛋白(ALB)有显著性差异，**代表p<0.01，表示与正常小鼠相比，荷瘤小鼠的白蛋白(ALB)有极显著性差异。

图10为对比例1的超氧阴离子自由基的产生能力对比结果。图中，**代表p<0.01，有显著性差异。

图11为对比例2的Zeta电势对比结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或按本领域常规方法制备。

本发明具体实施方式部分研制了一种金纳米簇纳米材料，平均尺寸在1.65±0.12nm，由148～153个金原子组成，高原子序数的金纳米簇通过对X射线的吸收，可产生大量ROS，肿瘤细胞死亡。整个制备和实验思路如下：

1.金纳米簇的制备以及表征。

采用先合成金纳米颗粒，再通过油浴蚀刻的方法合成金纳米簇，并对其进行TEM表征及热重分析等，分析颗粒形态、颗粒直径以及金原子含量等；

2.金纳米簇对X射线的吸收性能测试。

配置不同浓度的金纳米簇，通过CT成像方法探究金纳米簇溶液的CT值(或吸收系数)。

向荷瘤小鼠部位原位注射金纳米簇溶液，采用上述相同的方法在活体小鼠上探究金纳米簇对X射线的吸收情况。

3.金纳米簇结合X射线在水溶液及肿瘤细胞中ROS的检测。

通过荧光法以及吸收值方法检测金纳米簇溶液在X射线照射下产生ROS的类型以及相对含量等情况。

肿瘤细胞与金纳米簇共培养，通过X射线照射后，运用DCFH-DA来定量检测细胞中ROS的产生量。

4.金纳米簇结合X射线杀伤肿瘤细胞的实验。

肿瘤细胞与金纳米簇共培养后，通过X射线照射后，采用实时无标记细胞检测系统明场成像法或者细胞克隆数等定量分析肿瘤细胞的杀伤效果。

经过上述相同处理后，采用免疫荧光法检测组蛋白H2AX上磷酸化的Ser139(γ-H2AX)，以评估DNA双链断裂的程度。

5.金纳米簇结合X射线治疗活体肿瘤的实验。

金纳米簇原位注射到活体肿瘤内，经X射线照射后，统计活体肿瘤块的体积，观察治疗效果。

6.基于金纳米簇的放射动力学疗法的系统安全性评估。

统计上述第5点实验处理后的肿瘤小鼠的体重以及检测血项指标，进而评估基于金纳米簇的放射动力学疗法的系统安全性。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容和本领域的常规手段给予实施，下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明具体实施方式部分所有DHLA的制备方法可参见中国专利CN108619512实施例1的记载。

实施例1

1.金纳米簇的制备

将5mL氯金酸的甲醇溶液(5mM)加入25mL反应瓶中，在冰浴条件下加入14μL DHLA(0.076mmol)，混合搅拌30min。快速搅拌下，将预冷的1.25mL硼氢化钠水溶液(0.16M)快速加入上述反应溶液中，并继续反应1h。将反应溶液转移入15mL离心管，加入0.6mL盐酸(1mol/L)沉淀反应物。静止5min后，离心10min(4000r/min)，沉淀以pH 1.4的盐酸洗涤1次。

向上述得到的固体沉淀中加入pH 11.9的NaOH溶液6mL，并补加6mL水至pH为10.4。加入21μL DHLA(0.114mmol)，用NaOH溶液将反应体系的pH调至约5.6，在55℃油浴中以300r/min低速搅拌反应，出现沉淀后继续蚀刻1h。待反应结束后，在转速为7000r/min下，离心15min，弃上清。沉淀以水溶解储存待用。

2.金纳米簇用于放射动力治疗动物试验

2.1荷瘤小鼠模型的构建

本研究由中国科学院遗传与发育生物学研究所机构动物护理与使用委员会批准。C57BL/6j小鼠，4周龄，体重为15-20g，无特定病原体(SPF)级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。所有小鼠均在室温下，以标准的12小时光/暗周期，在无特定病原体的室内饲养。允许小鼠以标准颗粒饮食的形式自由饮水和进食。将Hepa 1-6细胞(0.1mL PBS中的2×10

2.2荷瘤小鼠放射动力学治疗

将荷瘤小鼠随机分组：空白对照组(荷瘤小鼠肿瘤部位只注射PBS，不再做其他处理)、X射线对照组(荷瘤小鼠肿瘤部位注射PBS后用X射线照射处理)、金纳米簇对照组(荷瘤小鼠肿瘤部位只注射金纳米簇，不再做其他处理)和金纳米簇放射动力治疗组——RDT试验组(荷瘤小鼠肿瘤部位注射金纳米簇后用射线对照组相同剂量的X射线照射处理)，每组4只。金纳米簇剂量为6.1mg kg

3.金纳米簇性能检测及结果

3.1金纳米簇对X射线的吸收性能测试：

以双蒸水为溶剂将上述第1点制备的金纳米簇配置为0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0以及10.0mg/mL不同浓度的金纳米簇溶液。置于CT的旋转中心位置，设置仪器参数为105kV，1.0mA，并且在X射线光机出口处加5mm厚的铝板过滤射线，采集CT图像。通过ImageJ软件统计金纳米簇溶液的CT值(或吸收系数)。

依据相同测试方法，对上述2.1部分构建的荷瘤小鼠模型注射金纳米簇前后的情况进行CT成像。

结果参见图1金纳米簇对X射线的吸收性能。图中，(A)为不同浓度金纳米簇X射线成像图。(B)为不同浓度的金纳米簇与CT值的对应关系。(C)为荷瘤小鼠模型的CT成像，图中标尺代表1cm。注射金纳米簇前，肿瘤部分(图中虚线圈所示)的CT灰度值较低，为6.19±5.66；肿瘤原位注射金纳米簇后，肿瘤部分(图中虚线圈所示)的CT值较高，为131.78±13.29，呈现较为清晰的像。

3.2金纳米簇的放射动力学性质测试，结果见图2：

以双蒸水为溶剂将上述1.2部分制备的金纳米簇配置为0、0.1、0.2、0.5、1.0mg/mL不同浓度的金纳米簇溶液作为实验组。

通过荧光法以及吸收值方法检测金纳米簇溶液在X射线照射下产生ROS的类型以及相对含量等情况。每组三个平行实验，结果见图2中的(A)，从中可知，在6Gy剂量的X射线照射下，金纳米簇溶液可产生大量超氧阴离子自由基。

进一步将上述不同浓度的金纳米簇溶液在不同剂量的X射线下进行照射，通过检测O

将Hepa 1-6细胞接种于培养皿，培养24h，使细胞充分贴壁生长。细胞培养基分别替换为不加金纳米簇的RPMI 1640培养基、含金纳米簇(工作浓度为0.2mg/mL)的RPMI 1640培养基，然后在黑暗条件下孵育2h后，快速加入ROS检测探针DCFH-DA(2μM)，照射处理(0.1、0.5、1.0、3.0和6.0Gy剂量的X射线)，设置没有照射X射线的金纳米簇作对照。随后，将培养皿置于激光共聚焦显微镜(Observer Z1，德国Zeiss)下观察每组细胞内的荧光情况。与空白对照(不加金纳米簇不进行X射线照射)、单纯X-射线、单纯金纳米簇对照组相比，金纳米簇+X射线照射的试验组(RDT实验组)产生大量的自由基，并且具有显著统计学差异(**p<0.01)，参见图2中的(E)，其为在X射线剂量为0.5Gy下的测试结果，以及图2中的(F)，其为不同X射线剂量下的测试结果。从中可知，在X射线照射下，金纳米簇溶液可诱发肿瘤细胞内产生大量ROS。

3.3金纳米簇的放射动力学效应对肿瘤细胞的抑制作用测试，结果见图3：

将Hepa 1-6细胞接种于96孔板中进行培养，每孔4000个细胞，培养24h，使细胞充分贴壁生长。细胞培养基分别替换为不加金纳米簇的RPMI 1640培养基、含金纳米簇(工作浓度为0.1mg/mL)的RPMI 1640培养基，然后黑暗条件下孵育2h后，分别用0或1.0Gy剂量的X射线照射处理，获得不加金纳米簇不进行X射线照射处理的空白对照，含金纳米簇不进行X射线照射处理的金纳米簇对照组，不加金纳米簇但进行X射线照射处理的X射线对照组以及加金纳米簇并进行X射线照射处理的RDT试验组。

随后，将96孔板置于实时无标记细胞检测系统(IncuCyte S3，美国EssenBioscience)下原位观察每组细胞的增殖情况。从中可知在X射线照射下，金纳米簇可以高效抑制肿瘤细胞生长。与空白对照、单纯X-射线(X射线对照组)、单纯金纳米簇对照组相比，金纳米簇+X射线照射的试验组(RDT试验组)产生更高效抑制效率，并且具有显著统计学差异(**p<0.01)。

3.4金纳米簇的放射动力学疗法RDT对肿瘤细胞的杀伤作用测试，结果见图4：

将Hepa 1-6细胞接种于培养皿中，细胞数为8×10

从图4中可知在X射线照射下，金纳米簇可以高效杀伤肿瘤细胞，形成的细胞克隆数最少。更重要的是，该杀伤效率不受环境中氧气含量的影响，即乏氧环境下，仍然可以高效杀伤肿瘤细胞。这为实体瘤的治疗奠定了很好的基础。

3.5金纳米簇的放射动力学疗法RDT对肿瘤细胞DNA的影响测试：

将Hepa 1-6细胞接种培养皿中，细胞数为6×10

3.6上述2.2部分记载的金纳米簇的放射动力学疗法RDT治疗测试结果统计：

第一次治疗视为第0天，每两天监测各个小鼠的肿瘤体积和体重变化，结果参见图6和图7。从中可知在X射线照射下，金纳米簇可以高效杀伤肿瘤，显著抑制肿瘤生长。并且对小鼠体重无显著性影响。

在第20天，对小鼠进行异氟烷麻醉处理，测试血项信息。结果参见图8小鼠血常规统计结果和图9小鼠血生化统计结果。实验结果显示未发现明显的血项指标的损伤，再结合图7对小鼠体重无显著性影响的结果，表明基于金纳米簇的RDT疗法安全、可靠。图中，正常小鼠为不进行Hepa 1-6细胞注射的对照小鼠，荷瘤小鼠为空白对照组，金纳米簇(荷瘤小鼠)为金纳米簇对照组，X射线(荷瘤小鼠)为X射线对照组，RDT(荷瘤小鼠)为金纳米簇放射动力治疗组。

对比例1

本对比例根据中国专利CN108619512实施例1的记载进行AuNCs@DHLA的制备以及以CN108619512实施例1的方法形成的金纳米粒子与本申请方法的蚀刻方式相配合的方法进行AuNCs@DHLA的制备，即将CN108619512实施例1中通过盐酸沉淀下来的反应物离心后弃上清，用去离子水将残余甲醇溶液洗掉后获得的产物，继续依本发明实施例1的方法分散在pH 11.9的NaOH溶液中，接着进行本发明实施例1记载的蚀刻流程。并将它们与本发明实施例1制备的AuNCs@DHLA在相同条件下测试产生超氧阴离子自由基的能力。

具体测试方法为：将三种方法合成的0.2mg/mL浓度的金纳米簇溶液用0、0.25、3.0及4.0Gy不同剂量的X射线辐照。X射线辐照仪的参数设置为160kV，25.0mA，剂量率为1.0Gy/min。通过检测O

对比例2

本对比例接着对上述对比例1中获得的三种AuNCs@DHLA在温度25℃，以超纯水为溶剂条件下，通过ZetaPALS型号的Zeta电位与粒径分析仪测试它们分散在水中的能力，即Zeta电势。实验结果表明本发明实施例1的金纳米簇Zeta电势的绝对值大于30mV，纳米粒子在溶剂中分散的效果最好。具体结果见图11。

对比例3

本对比例制备一种AuNCs@DHLA，其与实施例1中记载的制备方法相同，区别仅在于，减少硼氢化钠的用量，使其与氯金酸的摩尔质量比为4:1，其余步骤参见实施例1。

使用TU-190紫外-可见分光光度计测试本对比例与实施例1所获得的金纳米颗粒在200-800nm之间的吸收光谱，发现本对比例合成的金纳米颗粒在520nm处的吸收峰的半峰宽为16nm，而实施例1的金纳米颗粒在520nm处的吸收峰的半峰宽为10nm。本发明实施例1的吸收峰的半峰宽更小，表示合成的纳米颗粒的尺寸范围更小、粒径更均一。

对比例4

本对比例制备一种AuNCs@DHLA，其与实施例1中记载的制备方法相同，区别仅在于，当在碱性条件下，以DHLA对金纳米颗粒进行蚀刻时，减少DHLA的用量，使其与氯金酸的摩尔质量比为2:1，其余步骤参见实施例1。

通过F-4500荧光分光光度计测试本对比例与实施例1所获得的金纳米簇的发射光谱(λex＝470nm)。实验条件为：温度为25℃，狭缝宽度Ex～5nm，Em～5nm，PMT电压为700V，扫描速度为2400nm/min。实验发现本对比例合成的金纳米簇的荧光强度为3100a.u.，而实施例1的金纳米簇的荧光强度是其的2.13倍(6603a.u.)。

本对比例合成的金纳米簇溶液保存在4℃一个月时会析出沉淀，实施例1制备的金纳米簇溶液在相同的条件下保存三个月未观察到明显的沉淀析出。以上实验数据表明本发明合成的金纳米簇荧光强度更强、分散性更好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。