一种高活性羟基类固醇脱氢酶的表达方法

技术领域

本发明涉及生物酶技术领域，具体涉及一种高活性羟基类固醇脱氢酶的表达方法。

背景技术

熊胆粉为熊科动物胆汁的干燥品，具有清热解毒、平肝明目、杀虫止血等功效。天然熊胆粉的特征活性成分为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，也含有牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)，且TUDCA：TCDCA在1.0:1.0～1.5:1.0之间。家禽胆汁与熊胆汁在化学成分组成上的差异为：家禽胆汁中牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)为主要成分，且不含有TUDCA。研究表明，TUDCA可由TCDCA经由氧化还原化学反应生成：TCDCA依次经过7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)的催化转变成TUDCA。将生物酶技术应用于牛磺熊去氧胆酸化合物的定向生物合成，能够将低价值的家禽胆汁制品转化为高附加值产物，既可以作为熊胆粉的替代资源，可以很大程度上解决药用熊胆粉来源问题，也可以作为新的药用资源，具有强大竞争力和潜力。

现有技术中，如中国专利CN107058250B是通过基因构建，将7β-HSDH的基因构建到pGEX-6p-1质粒上，再通过电转化或化学转化的方法，将构建好的表达载体，转入BL21(DE3)宿主菌里，培养表达7α-HSDH或7β-HSDH，用其将家禽胆汁里的TCDCA定向转化为TUDCA，但是该方法表达出的7αHSDH和7βHSDH酶活较低，不能很好地满足实际需要。中国专利CN112852652A将7α-HSDH或7β-HSDH的基因构建到酵母表达系统里，用酵母表达系统的修饰作用来提高酶活性。但是酵母的构建要比大肠杆菌困难的多，培养周期也更长，酶的表达量也比大肠杆菌差得多。

因此，十分有必要提供一种表达系统构建简单、又可以显著提高酶活的羟基类固醇脱氢酶的表达方法。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高活性羟基类固醇脱氢酶的表达方法，该方法能够有效提高羟基类固醇脱氢酶的表达量和酶活。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种高活性羟基类固醇脱氢酶的表达方法，包括以下步骤：构建含有羟基类固醇脱氢酶基因的重组表达质粒，将构建的重组表达质粒导入宿主细胞，培养宿主细胞使羟基类固醇脱氢酶基因表达，其中，所述宿主细胞为Origami 2(DE3)。

作为本发明优选的实施方式，用于构建含羟基类固醇脱氢酶基因的重组表达质粒的出发载体为pET 32a。

作为本发明优选的实施方式，所述羟基类固醇脱氢酶为7α-HSDH或7β-HSDH。

作为本发明优选的实施方式，所述重组表达质粒为pET32a-N_His-7α-HSDH或pET32a-N_His-7β-HSDH。

作为本发明优选的实施方式，重组表达质粒导入宿主细胞的具体步骤如下：将重组表达质粒加入感受态的宿主细胞Origami 2(DE3)中，轻弹混匀，冰上放置30分钟，42℃下热激90秒，加入SOC培养基于150rpm 37℃振荡培养1.5小时后，均匀涂在氨苄霉素抗性平板上，培养箱内37℃过夜静置培养。

作为本发明优选的实施方式，培养宿主细胞过程中加入诱导剂IPTG诱导羟基类固醇脱氢酶基因表达。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明以pET32a作为7α-HSDH和7β-HSDH的表达载体、以Origami2(DE3)作为宿主菌，其中pET32a载体具有T7转录翻译系统，经宿主T7RNA聚合酶的诱导后进行表达。T7RNA聚合酶具有超强、特异的启动T7启动子基因表达功能，当其被完全诱导时，可使宿主本身的表达几乎全部转化为目的基因的表达，诱导几个小时后即可使得最终目的基因表达产物接近最高水平，同时pET32a载体具有Trx蛋白标签，可以帮助表达蛋白正确折叠。Origami2(DE3)宿主菌是K-12细胞的衍生而来，在thioredoxin reductase(trxB)和glutathionereductase(gor)基因上同时含有突变，这使得该菌株能够更加高效的在细胞质内生成二硫键，有助于含二硫键蛋白的活性蛋白形成，DE3是溶源性的λDE3，因此在lacUV5启动子下携带有T7 RNA聚合酶的染色体拷贝。

7α-HSDH蛋白和7β-HSDH蛋白在表达和折叠过程中会形成二硫键，蛋白二级结构的正确折叠特别是二硫键的正确形成对蛋白活性具有重要影响，因此以pET32a作为7α-HSDH的表达载体、以Origami2(DE3)作为宿主菌能够有效提高7α-HSDH和7β-HSDH等羟基类固醇脱氢酶的表达量和活性。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1一种7α-HSDH(7α羟基类固醇脱氢酶)的表达方法

一种7α-HSDH的表达方法，包括以下步骤：

S1、构建含有羟基类固醇脱氢酶基因的重组表达质粒

7α-HSDH的基因序列如SEQ ID NO:1所示，来源于中国专利CN106701707B，目的基因表达载体为pET32a，委托通用生物(安徽)股份有限公司合成得到重组表达质粒；感受态宿主细胞为Origami 2(DE3)，来源于优宝生物。

S2、重组表达质粒导入宿主细胞

将重组表达质粒pET32a-N_His-7α-HSDH从-20℃冰箱内取出，融化，取Origami 2(DE3)感受态细胞一支(100ul)，放于冰上融化2分钟，加入2ul重组表达质粒pET32a-N_His-7α-HSDH，轻弹混匀，冰上放置30分钟，42℃热激90秒，冰上静置2分钟，加入900ul SOC培养基，150rpm 37℃振荡培养1.5小时后，取100ul均匀涂在氨苄霉素抗性平板上(氨苄霉素工作浓度100ug/ml，下同)，培养箱内37℃过夜静置培养。

S3、诱导7α-HSDH基因表达

取5支试管，分别加入5ml含氨苄霉素的LB培养基，挑取5个边缘规则，大小适中的菌落，分别接种在5支试管中，180rpm，37℃培养4小时，取800ul作为菌种，将余下培养基加入2ul IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，继续培养2小时，SDS-PAGE检测表达量，选出表达最好的一个菌种用于后续表达。

S4、7α-HSDH的制备

取20ul菌种，接种在200ml含氨苄霉素的LB培养基内，37℃180rpm振荡培养6小时，降温到20℃，加入200ul IPTG，继续培养16小时，4000rpm离心收集菌体。用细胞破碎液(50mM HEPES，200mM NaCl，pH 8.0)重悬菌体，超声破碎机破碎菌体，超速离心机12000rpm离心1小时，取上清，用HisHP柱子纯化，得到7α-HSDH酶，标记为实施例1-1；重复S1～S4两次，所获得的纯化酶标记为实施例1-2、实施例1-3，检测酶活。

S5、酶活检测

在比色皿中加入2930ul 100mM PB(磷酸盐缓冲液，pH 7.0)，加入30ul 50mMNADP，加入30ul 50mM TCDCA，混匀后作为空白对照，在分光光度计内333nm波长处归零，加入10ul纯化后蛋白液的稀释液(根据实际情况稀释，使得最终A333的吸光度在0.2-0.6之间)，立刻混匀，读取1分钟后的吸光值，按照以下公式计算酶活：

式中，Vt为反应总体积(3ml)；df为稀释倍数；5.8222为消光系数；1.0为测量光程；Vs为酶液体积(0.01ml)。

对比例1：

一种7α-HSDH的表达方法，包括以下步骤：

S1、7α-HSDH的基因序列如SEQ ID NO:1所示，来源于中国专利CN106701707B，目的基因表达载体为pGEX-6p-1，委托通用生物(安徽)股份有限公司合成得到重组表达质粒；感受态宿主细胞为Origami 2(DE3)，来源于优宝生物。

S2、重组表达质粒导入宿主细胞

将重组表达质粒pGEX-6p-1-N_GST-7α-HSDH从-20℃冰箱内取出，融化，取Origami2(DE3)感受态细胞一支(100ul)，放于冰上融化2分钟，加入2ul重组表达质粒pET32a-N_His-7α-HSDH，轻弹混匀，冰上放置30分钟，42℃热激90秒，冰上静置2分钟，加入900ul SOC培养基，150rpm 37℃振荡培养1.5小时后，取100ul均匀涂在氨苄霉素抗性平板上，封口后倒置在培养箱内37℃过夜静置培养。

S3、诱导7α-HSDH基因表达

取5支试管，分别加入5ml含氨苄霉素的LB培养基，挑取5个边缘规则，大小适中的菌落，分别接种在5支试管中，180rpm，37℃培养4小时，取800ul作为菌种，将余下培养基加入2ul IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，继续培养2小时，SDS-PAGE检测表达量，选出表达最好的一个菌种用于后续表达。

S4、7α-HSDH的制备

取20ul菌种，接种在200ml含氨苄霉素的LB培养基内，37℃180rpm振荡培养6小时，降温到20℃，加入200ul IPTG，继续培养16小时，4000rpm离心收集菌体。用细胞破碎液(50mM HEPES，200mM NaCl，pH 8.0)重悬菌体，超声破碎机破碎菌体，超速离心机12000rpm离心1小时，取上清，用GSTHP柱子纯化，得到7α-HSDH酶，标记为对比例1-1；重复S1～S4两次，所获得的纯化酶标记为对比例1-2、对比例1-3，检测酶活。

对比例2：

对比例2与对比例1的区别在于：出发载体为pBV220，构建所得的重组质粒载体为pBV220-N_His-7a-HSDH，纯化柱为HisHP柱子，其他操作步骤与对比例1相同。所获得的纯化酶标记为对比例2-1、对比例2-2、对比例2-3。

效果实施例1：

对实施例1、对比例1～2所获得的纯化酶进行表达量和酶活检测，结果见表1。

表1实施例1、对比例1-2所制得的7α-HSDH表达量和酶活结果

由表1可知，以pET32a作为表达载体，表达出来的7α-HSDH酶量更多且具有更高活性。

对比例3：

一种7α-HSDH的表达方法，包括以下步骤：

S1、7α-HSDH的基因序列如SEQ ID NO:1所示，来源于中国专利CN106701707B，目的基因表达载体为pET32a，委托通用生物(安徽)股份有限公司合成得到重组表达质粒；感受态宿主细胞为BL21(DE3)，来源于优宝生物。

S2、重组表达质粒导入宿主细胞

将重组表达质粒pET32a-N_His-7α-HSDH从-20℃冰箱内取出，融化，取BL21(DE3)感受态细胞一支(100ul)，放于冰上融化2分钟，加入2ul重组表达质粒pET32a-N_His-7α-HSDH，轻弹混匀，冰上放置30分钟，42℃热激90秒，冰上静置2分钟，加入900ul SOC培养基，150rpm 37℃振荡培养1.5小时后，取100ul均匀涂在氨苄霉素抗性平板上，培养箱内37℃过夜静置培养。

S3、诱导7α-HSDH基因表达

取5支试管，分别加入5ml含氨苄霉素的LB培养基，挑取5个边缘规则，大小适中的菌落，分别接种在5支试管中，180rpm，37℃培养4小时，取800ul作为菌种，将余下培养基加入2ul IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，继续培养2小时，SDS-PAGE检测表达量，选出表达最好的一个菌种用于后续表达。

S4、7α-HSDH的制备

取20ul菌种，接种在200ml含氨苄霉素的LB培养基内，37℃180rpm振荡培养6小时，降温到20℃，加入200ul IPTG，继续培养16小时，4000rpm离心收集菌体。用细胞破碎液(50mM HEPES，200mM NaCl，pH 8.0)重悬菌体，超声破碎机破碎菌体，超速离心机20000rpm离心1小时，取上清，用HisHP柱子纯化，得到7α-HSDH酶，标记为对比例3-1；重复S1～S4两次，所获得的纯化酶标记为对比例3-2、对比例3-3，检测酶活。

对比例4：

对比例4与对比例3的区别在于：宿主细胞为HB101，其他操作步骤与对比例3相同。所获得的纯化酶标记为对比例4-1、对比例4-2、对比例4-3。

效果实施例2：

对实施例1、对比例3～4所获得的纯化酶进行表达量和酶活检测，结果见表2。

表2实施例1、对比例3-4所制得的7α-HSDH表达量和酶活结果

由表2可知，以Origami2(DE3)菌株作为宿主细胞表达出来的7α-HSDH酶量更多、活性更高，在HB101菌株中未见表达。

实施例2：一种7β-HSDH(7β羟基类固醇脱氢酶)的表达方法

一种7β-HSDH的表达方法，包括以下步骤：

S1、构建含有羟基类固醇脱氢酶基因的重组表达质粒

7β-HSDH的基因序列如SEQ ID NO:2所示，来源于中国专利CN 107058250B，目的基因表达载体为pET32a，委托通用生物(安徽)股份有限公司合成得到重组表达质粒；感受态宿主细胞为Origami 2(DE3)，来源于优宝生物。

S2、重组表达质粒导入宿主细胞

将重组表达质粒pET32a-N_His-7β-HSDH从-20℃冰箱内取出，融化，取Origami 2(DE3)感受态细胞一支(100ul)，放于冰上融化2分钟，加入2ul表达载体pET32a-N_His-7β-HSDH，轻弹混匀，冰上放置30分钟，42℃热激90秒，冰上静置2分钟，加入900ul SOC培养基，150rpm 37℃振荡培养1.5小时后，取100ul均匀涂在氨苄霉素抗性平板上，培养箱内37℃过夜静置培养。

S3、诱导7β-HSDH基因表达

取5支试管，分别加入5ml含氨苄霉素的LB培养基，挑取5个边缘规则、大小适中的菌落，分别接种在5支试管中，180rpm，37℃培养4小时，取800ul作为菌种，将余下培养基加入2ul IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，继续培养2小时，SDS-PAGE检测表达量，选出表达最好的一个菌种用于后续表达。

S4、7β-HSDH的制备

取20ul菌种，接种在200ml含氨苄霉素的LB培养基内，37℃180rpm振荡培养6小时，降温到20℃，加入200ul IPTG，继续培养16小时，4000rpm离心收集菌体。用细胞破碎液(50mM HEPES，200mM NaCl，pH 8.0)重悬菌体，超声破碎机破碎菌体，超速离心机12000rpm离心1小时，取上清，用HisHP柱子纯化，得到7β-HSDH酶，标记为实施例2-1；重复S1～S4两次，所获得的纯化酶标记为实施例2-2、实施例2-3，检测酶活。

S5、酶活检测

在比色皿中加入2930ul 100mM PB(磷酸盐缓冲液，pH 7.0)，加入30ul 50mMNADP，加入30ul 50mM TUDCA，混匀后作为空白对照，在分光光度计内333nm波长处归零，加入10ul纯化后蛋白液的稀释液(根据实际情况稀释，使得最终A333的吸光度在0.2-0.6之间)，立刻混匀，读取1分钟后的吸光值，按照以下公式计算酶活：

式中，Vt为反应总体积(3ml)；df为稀释倍数；5.8222为消光系数；1.0为测量光程；Vs为酶液体积(0.01ml)。

对比例5：

一种7β-HSDH的表达方法，包括以下步骤：

S1、7β-HSDH的基因序列如SEQ ID NO:2所示，目的基因表达载体为pGEX-6p-1，委托通用生物(安徽)股份有限公司合成得到重组表达质粒；感受态宿主细胞为Origami 2(DE3)，来源于优宝生物。

S2、重组表达质粒导入宿主细胞

将重组表达质粒pGEX-6p-1-N_GST-7β-HSDH从-20℃冰箱内取出，融化，取Origami2(DE3)感受态细胞一支(100ul)，放于冰上融化2分钟，加入2ul重组表达质粒pET32a-N_His-7β-HSDH，轻弹混匀，冰上放置30分钟，42℃热激90秒，冰上静置2分钟，加入900ul SOC培养基，150rpm 37℃振荡培养1.5小时后，取100ul均匀涂在氨苄霉素抗性平板上，封口后倒置在培养箱内37℃过夜静置培养。

S3、诱导7β-HSDH基因表达

取5支试管，分别加入5ml含氨苄霉素的LB培养基，挑取5个边缘规则，大小适中的菌落，分别接种在5支试管中，180rpm，37℃培养4小时，取800ul作为菌种，将余下培养基加入2ul IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，继续培养2小时，SDS-PAGE检测表达量，选出表达最好的一个菌种用于后续表达。

S4、7β-HSDH的制备

取20ul菌种，接种在200ml含氨苄霉素的LB培养基内，37℃180rpm振荡培养6小时，降温到20℃，加入200ul IPTG，继续培养16小时，4000rpm离心收集菌体。用细胞破碎液(50mM HEPES，200mM NaCl，pH 8.0)重悬菌体，超声破碎机破碎菌体，超速离心机12000rpm离心1小时，取上清，用GSTHP柱子纯化，得到7β-HSDH酶，标记为对比例5-1；重复S1～S4两次，所获得的纯化酶标记为对比例5-2、对比例5-3，检测酶活。

对比例6：

对比例6与对比例5的区别在于：出发载体为pBV220，构建所得的重组质粒载体为pBV220-N_His-7β-HSDH，纯化柱为HisHP柱子，其他操作步骤与对比例5相同。所获得的纯化酶标记为对比例6-1、对比例6-2、对比例6-3。

效果实施例3：

对实施例2、对比例5～6所获得的纯化酶进行表达量和酶活检测，结果见表3。

表3实施例2、对比例5-6所制得的7β-HSDH表达量和酶活结果

由表3可知，以pET32a作为表达载体，表达出来的7β-HSDH酶量更多且具有更高活性。

对比例7：

一种7β-HSDH的表达方法，包括以下步骤：

S1、7β-HSDH的基因序列如SEQ ID NO:2所示，目的基因表达载体为pET32a，委托通用生物(安徽)股份有限公司合成得到重组表达质粒；感受态宿主细胞为BL21(DE3)，来源于优宝生物。

S2、重组表达质粒导入宿主细胞

将重组表达质粒pET32a-N_His-7β-HSDH从-20℃冰箱内取出，融化，取BL21(DE3)感受态细胞一支(100ul)，放于冰上融化2分钟，加入2ul表达载体pET32a-N_His-7β-HSDH，轻弹混匀，冰上放置30分钟，42℃热激90秒，冰上静置2分钟，加入900ul SOC培养基，150rpm37℃振荡培养1.5小时后，取100ul均匀涂在氨苄霉素抗性平板上，培养箱内37℃过夜静置培养。

S3、诱导7β-HSDH基因表达

取5支试管，分别加入5ml含氨苄霉素的LB培养基，挑取5个边缘规则，大小适中的菌落，分别接种在5支试管中，180rpm，37℃培养4小时，取800ul作为菌种，将余下培养基加入2ul IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，继续培养2小时，SDS-PAGE检测表达量，选出表达最好的一个菌种用于后续表达。

S4、7β-HSDH的制备

取20ul菌种，接种在200ml含氨苄霉素的LB培养基内，37℃180rpm振荡培养6小时，降温到20℃，加入200ul IPTG，继续培养16小时，4000rpm离心收集菌体。用细胞破碎液(50mM HEPES，200mM NaCl，pH 8.0)重悬菌体，超声破碎机破碎菌体，超速离心机20000rpm离心1小时，取上清，用HisHP柱子纯化，得到7β-HSDH酶，标记为对比例7-1；重复S1～S4两次，所获得的纯化酶标记为对比例7-2、对比例7-3，检测酶活。

对比例8：

对比例8与对比例7的区别在于：宿主细胞为HB101，其他操作步骤与对比例3相同。所获得的纯化酶标记为对比例8-1、对比例8-2、对比例8-3。

效果实施例4：

对实施例2、对比例7～8所获得的纯化酶进行表达量和酶活检测，结果见表4。

表4实施例2、对比例7-8所制得的7β-HSDH表达量和酶活结果

由表4可知，以Origami2(DE3)菌株作为宿主细胞表达出来的7β-HSDH酶量更多、活性更高，在HB101菌株中未见表达。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 宋建芳

<120> 一种高活性羟基类固醇脱氢酶的表达方法

<130> 20220420

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 804

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgaaaaagt tagaagataa agtagcaata attactgcag ctacaaaagg cataggtctt 60

gcttcagcag aagtgttagc tgaaaatgga gctttagtct atatagcagc aagatctgag 120

gaattagcca aggaagttat atccaacatt gaaagtaatg gtggtagagc taagttcgta 180

tatttcaatg ctcgtgagcc acaaacctat actactatgg tagaaactgt ggcacaaaat 240

gaaggaaggt tagacatatt agtaaataac tacggtgaaa ctaacgtaaa gctcgacaga 300

gatttagtta atggggacac agaggaattt tttaggatag ttcaagataa cttacaaagc 360

gtttatttac ctagtaaggc tgcaatacct cgtatggcta aaaatggagg tggaagtata 420

gtaaatatat caacaatagg atctgttgtt ccagacttag gaaggattgc ttattgtgtt 480

tcaaaggcag caataaactc tttaactcaa aatatagctc ttcaatatgc gagacaaggg 540

gtaagatgta atgctgtgct tccaggctta attggaacta aagcagctat ggagaatatg 600

accgatgaat ttagggattc cttcttaaga catgtaccaa taaacagagt cggaaaacca 660

gaagatattg caaaggcagt actttattat gcaagtgatg attcagatta tgtaactgga 720

atgattcatg aagttgctgg aggatatgct ttaggaagtc cacaatatgc tgagttttct 780

gcaatgatgg agagaagtag atag 804

<210> 2

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgaatatga atttaagaga aaaatatgga gaatggggaa ttatattagg tgctactgaa 60

ggtgtaggaa aagccttttg tgaaaaaatc gctgctggtg gaatgaatgt agtaatggta 120

ggcagaagag aggagatgtt aaaggactta ggtagagaaa taagtaataa atatggagtt 180

gaacatttag taataaaggc agattttgca gatccatcat ctgtggacaa gatatttgag 240

caaactaagg aattagatat gggattcatg tcttatgttg cttgcttcca tacatttggt 300

aagttacaag atacgccttg ggaaaaacat gagcaaatga taaatgtaaa tgttattaca 360

ttttttaaat gtttttatca ttatatgggt atatttgcaa agcaagatag aggggctatt 420

ataaatgtat catctcttac tggaataagt agttcacctt ataatgctca atatggtgca 480

ggaaaatcat atatattaaa gttaacagaa gcagttgctt gtgaagctgc taagacaaat 540

gttgatgttg aagtaataac tttaggaact actattacac caagtttatt aaaaaatctt 600

cctggtggac cagctggaga agcagtaatg aaatcagcat taactccaga ggcatgtgtt 660

gatgaagctt ttgaaaatct aggaaaaact ttttcagtta tagcaggtga gcacaacaag 720

aaaaatgtac acaactggaa agctaatcat acagctgatg agtatataac atatatgggg 780

tctttctatg agaaataa 798