一种利用TaqMan探针和特异性引物鉴别山银花及其制剂的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及制剂及药材检验检测方法，尤其涉及一种利用TaqMan探针和特异性引物鉴别山银花及其制剂的方法。

背景技术

山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬或黄褐毛忍冬的干燥花蕾或带初开的花，根据查阅文献及市场调研发现目前市场上销售流通的山银花基原样品主要为灰毡毛忍冬和黄褐毛忍冬，其中以灰毡毛忍冬最为常见。金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花。金银花与山银花均用于温病发热、喉痹、热毒血痢、风寒感冒等病症。自2005年版《中国药典》将山银花列出作为单个药材后，由于金银花价格昂贵，市场上常有用山银花假冒或混淆金银花的现象；两者虽然在药理作用上有一定共性，但在某些药理作用上两者还是有一定差异，如山银花中存在致敏反应的皂苷成分，而金银花中皂苷则不发生过敏反应。因此为保证临床用药安全，建立快速简便灵敏度好的检测方法是十分必要的。

通过查阅文献，目前鉴别山银花与金银花的主要方法为性状及液相色谱法，性状鉴别易受采收加工及炮制方法的影响，同时性状鉴别对检验人员专业能力及水平要求较高；液相鉴别方法主要根据化学成分的差异进行鉴别，山银花(灰毡毛忍冬)中含有灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙，金银花则不含这两种化学成分，这种鉴别方法需要高效液相色谱仪，需要购买相应的对照品，成本较高。目前虽已有金银花与山银花的鉴别方法，但该方法检测灵敏度较低，成本高，对检验人员专业技术水平要求较高，不适合广泛应用。

TaqMan探针法是实时荧光PCR方法的一种，该法是在原有实时荧光PCR基础上引入探针。探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，当探针引物特异性结合，DNA模板开始扩增，当Taq DNA聚合酶碰到探针5’端荧光报告基团，外切酶将5’端报告基团切割，游离出来，发出荧光信号。该方法目前主要应用到食品领域，对于药品领域则应用较少。与传统理化鉴别方法相比TaqMan探针法特异性好，灵敏度高，不仅可以鉴别药材及饮片，还可以鉴别山银花制剂中原料药材的真伪。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用TaqMan探针和特异性引物鉴别山银花及其制剂的方法。本发明设计出山银花共同特有的特异性引物及TaqMan探针，这一特异引物和探针可以同时检查金银花药材及制剂中有无掺加山银花，山银花药材及饮片是否为正品基源山银花，山银花制剂中是否投料山银花，原料药基源是否正确。该方法灵敏度高，特异性好，重复性好，成本低，对于检查金银花药材、饮片及制剂中是否掺有山银花，及山银花制剂中是否投料山银花药材或粉末具有较好适用性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用TaqMan探针和特异性引物鉴别山银花及其制剂的方法，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为5'-TCCAACAGTTTTTCTTTTATTTTTA-3'，所述下游引物的核苷酸序列为5'-GTCTTAGTGTATACGAGTTAAAAAA-3；所述TaqMan探针5'端标记荧光素基团FAM，3'端标记淬灭基团BHQ1，所述TaqMan探针的核苷酸序列为5'FAM-TAAAAAATGAAAGCCCAAAACACAA-BQ13'。

作为优选，所述方法包括：

结合所述TaqMan探针和特异性引物进行实时荧光PCR反应，检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有山银花；

结合所述TaqMan探针和特异性引物进行实时荧光PCR反应，检测或辅助检测待测样品是否为或候选为山银花。

作为优选，所述方法的主要步骤包括：

(1)提取待测样品的总DNA；

(2)以提取的DNA为模板，配制PCR反应体系，所述PCR反应体系中包括权利1要求所述的上游引物、下游引物和TaqMan探针，设置反应条件，将PCR反应体系置于荧光定量PCR仪中进行反应；

(3)根据反应结果对山银花及其制剂进行特异性鉴别。

作为优选，步骤(2)中所述的PCR反应体系为：总体积为20μL时，荧光PCR反应混合液(2×)10μL、权利要求1所述TaqMan探针(5μmol/L)1μL、权利要求1所述上游引物(20μmol/L)1μL、权利要求1所述下游引物(20μmol/L)1μL、模板DNA溶液2μL、灭菌超纯水5μL。

作为优选，步骤(2)中所述的反应条件为：阶段1：95℃，3分钟；阶段2：95℃，10秒，58℃，32秒，40个循环。

作为优选，步骤(3)中所述根据反应结果对山银花及其制剂进行特异性鉴别，包括：

(1)无荧光对数增长，视为未检出山银花；

(2)有荧光对数增长，且相应的CT值＞30.0，视为未检出山银花；

(3)有荧光对数增长，且相应的CT值＜30.0，视为检出山银花。

本发明所述鉴别方法的原理为：

将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

有益效果

本发明公开了一种鉴别山银花及其制剂的特异性引物及TaqMan探针和鉴别方法，与现有技术相比本发明具有以下有益效果：

(1)TaqMan探针法是首次应用到山银花的鉴别；

(2)专属性强，从物种DNA层面鉴别山银花，本发明所述引物及探针序列是山银花所专有，其他物种或药材则无此序列；

(3)灵敏度高，只要ng级别的模板DNA浓度，当药材、饮片及制剂中掺入1％的山银花药材或粉末即可检出，对于山银花制剂中检查山银花投料是否准确；

(4)适用性广，不受药材生长环境及外观性状的影响，性状完全破碎的药材粉末均可应用，即使经过加工炮制的山银花制剂也适用；

(5)特异性引物和TaqMan探针及DNA模板稳定性好，-80℃可保存数十年；

(6)该方法不受操作人员专业能力影响，操作简便；

(7)试验成本较低，无须大型试验仪器；

(8)对环境友好，无环境污染。

附图说明

图1：探针及引物筛选中金银花对照药材扩增曲线；

图2：探针及引物筛选中山银花对照药材扩增曲线；

图3：探针及引物筛选中山银花样品扩增曲线；

图4：探针及引物筛选中空白对照扩增曲线；

图5：专属性试验金银花药材扩增曲线；

图6：专属性试验山银花药材扩增曲线；

图7：重复性结果扩增曲线；

图8：不同掺伪比例扩增曲线；

图9：典型PCR扩增曲线。

具体实施方式

以下，将详细地描述本发明。在进行描述之前，应当理解的是，在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义，而应当在允许发明人适当定义术语以进行最佳解释的原则的基础上，根据与本发明的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此，这里提出的描述仅仅是出于举例说明目的的优选实例，并非意图限制本发明的范围，从而应当理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以由其获得其他等价方式或改进方式。

以下实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。除非特别说明，以下实施例中使用的试剂和仪器均为市售可得产品。

实施例

样品收集：共收集明确基源的金银花和山银花样品55批，其中金银花22批，灰毡毛忍冬14批，黄褐毛忍冬19批，3批山银花配方颗粒。具体样品信息见表1。

表1样品信息

1、仪器与试剂试药

电子分析天平(Sartorius CP225D)，纯水仪，离心机，QuantStudio 5定量PCR仪，植物基因组DNA提取试剂盒(DP305，TIANGEN)，实时荧光PCR反应混合液(4440038-1605043，AB)，引物(上海生工生物工程有限公司合成)。

无水乙醇(分析纯)，三氯甲烷(分析纯)，引物(上海生工生物工程有限公司合成)，金银花对照药材(中检院批号：121060-201608)，山银花对照药材(中检院批号：121591-201202)。

2、样品处理及DNA提取

2.1样品处理

取样品，依次用75％乙醇、灭菌超纯水清洗，吸干表面水分，置乳钵中研磨成极细粉。

2.2DNA提取

2.2.1模板DNA提取

样品模板DNA提取：取供试品粉末30mg，置1.5ml离心管中，用植物基因组DNA提取试剂盒(DP305，TIANGEN)提取DNA，具体操作：加入700μl65℃预热的缓冲液GP1(试验前再预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。加入700μl三氯甲烷，充分混匀，12000rpm(～13400×g)离心5min。小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2，充分混匀。将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm(～13400×g)离心30sec，弃掉废液。向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm(～13400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液PW，12000rpm(～13400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。再向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液PW，12000rpm(～13400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(～13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000rpm(～13400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中，得到DNA溶液。

阳性对照模板DNA提取：取山银花对照药材(灰毡毛忍冬)，置乳钵中研磨成极细粉，同样品模板DNA提取方法制成阳性对照药材模板DNA溶液。

阴性对照模板DNA提取：取金银花对照药材，置乳钵中研磨成极细粉，同样品模板DNA提取方法制成阴性对照药材模板DNA溶液。

3、实时荧光PCR方法建立

3.1探针及引物设计、筛选

3.1.1探针及引物设计从GenBank数据库中下载登陆的山银花(灰毡毛忍冬、黄褐毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬)、金银花及常见混伪品的ITS和ITS 2序列或全基因组序列，与测序获得的序列共同使用BioEdit软件进行同源对齐，手动校正后寻找差异性SNP位点，通过软件分析，在种内保守、种间差异区域设计引物和探针，其中探针5＇端标记荧光素基团FAM，3＇端标记淬灭基团BHQ1,通过Primer Premier 5.0软件设计出山银花特异性鉴别引物2对，根据探针和引物的专属性进行筛选。探针及引物序列见表2。

表2探针及引物序列表

3.1.2探针及引物筛选

PCR反应体系配制总体积为20μl，分别加入荧光PCR反应混合液(2×)10μl，探针(5μmol/L)1μL，上下游引物(20μmol/L)各1μL，模板DNA溶液2μL，灭菌超纯水5μL。上下游引物和探针分别为：表2中编号为SHY-1和SYH-2的引物和探针。阳性对照反应体系为用等体积阳性对照溶液代替供试品溶液的反应体系；阴性对照反应体系为用等体积阴性对照溶液代替供试品溶液的反应体系，空白对照反应体系为用等体积灭菌超纯水代替供试品溶液。供试品及对照均设两个重复，CT值取两个重复的平均值作为最终结果。

PCR反应：将以上反应体系置于荧光定量PCR仪中进行反应，设定如下参数：

阶段1：95℃，3分钟；阶段2：95℃，10秒，58℃，32秒，40个循环。

结果编号为SYH-2的引物和探针山银花样品、阳性对照药材和阴性对照药材均有荧光扩增曲线和荧光对数增长，有效性较好，但无专属性。编号为SYH-1的引物和探针山银花样品和阳性对照药材有S型荧光扩增曲线和荧光对数增长，而阴性对照药材无S型荧光扩增曲线和荧光对数增长，专属性和有效性均良好，因此选择编号为SYH-1的引物和探针进行方法学考察。具体结果见表3及图1-4。

表3专属性和有效性考察结果

*“+”代表有荧光扩增曲线“－”代表无荧光扩增曲线

4方法学考察

4.1专属性考察

取不同产地金银花药材6批(编号JHY-1～6)，山银花药材6批(编号HZM-1～3，HHM-1～3)，依次用75％乙醇、灭菌超纯水清洗，吸干表面水分，置乳钵中研磨成极细粉。取约30mg，置1.5ml离心管中，用植物基因组DNA提取试剂盒提取，即得模板DNA溶液。

PCR反应体系配制总体积为20μl，分别加入荧光PCR反应混合液(2×)10μl，探针(5μmol/L)1μL，上游引物(20μmol/L)1μL，下游引物(20μmol/L)1μL，模板DNA溶液2μL，灭菌超纯水5μL。

上游引物为：5'-TCCAACAGTTTTTCTTTTATTTTTA-3'，下游引物为：

5'-GTCTTAGTGTATACGAGTTAAAAAA-3，探针：

5'FAM-TAAAAAATGAAAGCCCAAAACACAA-BQ13'。

空白对照反应体系为用等体积灭菌超纯水代替供试品溶液。供试品及对照均设两个重复，CT值取两个重复的平均值作为最终结果。

PCR反应：将以上反应体系置于荧光定量PCR仪中进行反应，设定如下参数：阶段1：95℃，3分钟；阶段2：95℃，10秒，58℃，32秒，40个循环。

结果6批不同产地的金银花药材均无S型荧光扩增曲线，6批山银花药材均有S型荧光扩增曲线，且CT值＜30。表明该方法专属性较强。结果见图5-6。

4.3精密度

取山银花对照药材，置乳钵中研磨成极细粉，取约30mg，置1.5ml离心管中，用植物基因组DNA提取试剂盒提取，即得模板DNA溶液。

取模板DNA溶液，设6个复孔，6个复孔平均CT值为22.884，RSD为1.5％，结果表明精密度良好，结果见表4。

表4精密度试验结果

4.2重复性

取灰毡毛忍冬药材(编号：HZM-3)，依次用75％乙醇、灭菌超纯水清洗，吸干表面水分，置乳钵中研磨成极细粉，平行取样六份，每份约30mg，置1.5ml离心管中，用植物基因组DNA提取试剂盒提取，即得模板DNA溶液。

PCR反应体系配制：总体积为20μl，分别加入荧光PCR反应混合液(2×)10μl，探针(5μmol/L)1μL，上、下游引物(20μmol/L)各1μL，模板DNA溶液2μL，灭菌超纯水5μL。上游引物为：5'-TCCAACAGTTTTTCTTTTATTTTTA-3'，下游引物为：5'-GTCTTAGTGTATACGAGTTAAAAAA-3，探针：5'FAM-TAAAAAATGAAAGCCCAAAACACAA-BQ13'。

PCR反应条件：将以上反应体系置于荧光定量PCR仪中进行反应，设定如下参数：阶段1：95℃，3分钟；阶段2：95℃，10秒，58℃，32秒，40个循环。

结果6份灰毡毛忍冬药材平均CT值为20.239，RSD为1.7％，表明该方法重复性良好。结果见表5及图7。

表5重复性结果

4.4检测线

为了考察方法的检测灵敏度，在金银花对照药材中掺入不同比例的山银花对照药材进行实验，山银花比例分别为1.2％、2.9％、4.3％、12.4％、19.5％、45.7％。置1.5ml离心管中，用植物基因组DNA提取试剂盒提取，即得模板DNA溶液。

结果显示当掺伪比例为1.2％时，有荧光对数增长，但CT值为31.3015＞30.0，视为未检出，当掺伪比例为2.9％时，有荧光对数增长且CT值为28.822<30，视为检出。考虑到药材及饮片的市场现状和实验环境等因素带来的误差，将掺伪比例为5％时定为检出限。结果见表6及图8。

表6不同掺伪比例CT值

5样品测定

采用建立的方法对收集到的山银花药材和金银花药材进行TaqMan探针实时荧光PCR反应。结果33批山银花药材均有荧光对数增长，且CT值<30，检测结果阳性，为检出山银花，22批金银花药材无荧光对数增长，检测结果为阴性，为未检出，且实时荧光PCR检测结果与测序结果一致，3批山银花配方颗粒有荧光扩增曲线且CT值均<30，说明山银花配方颗粒投的原料药材为山银花。结果见表7及图9。

表7实时荧光检测结果

*N代表无荧光扩增曲线或未检出

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110>

<120> 一种利用TaqMan探针和特异性引物鉴别山银花及其制剂的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 203

<212> DNA

<213> 山银花(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

ttttagagga tataaaggga tataaagatt tttcataaca gaataaaaaa tgaaagccca 60

aaacacaatc aggacccgcc cctaaaaata agaagattga ctatttttct tgaaagaaaa 120

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