一种耳软骨细胞及制备方法、再生耳软骨组织与应用

技术领域

本发明属于生物材料领域，尤其涉及一种耳软骨细胞及制备方法、再生耳软骨组织与应用。

背景技术

耳软骨细胞是组织工程耳再造中重要的种子细胞，种植在合成材料构建的支架上，分泌软骨细胞外基质，最终形成成熟的软骨组织，可用于小耳畸形耳再造，耳软骨创伤缺损修复等，减少了自体软骨组织移植所造成的医源性损伤。同时耳软骨细胞也可作为工具细胞用于小耳畸形等发病机制的研究。但软骨组织细胞含量仅为5％-10％，是少细胞组织，主要由胶原、糖胺多糖、弹性纤维等细胞外基质构成。提取耳软骨细胞过程中，在降解细胞外基质的同时也会使细胞长时间暴露在消化酶中，不仅减少提取细胞数量，同时也降低了细胞活力。此外，我们发现耳软骨组织不同部位细胞外基质成分含量，细胞外基质作用力差异较大，若采用传统的统一胶原酶浓度进行消化，会降低耳根、耳中央等部位的提取效率，造成组织的浪费，而延长消化时间会对细胞活力造成很大影响，降低细胞产量和活力。

耳软骨细胞传统制备方法是：采用浓度为2-3g/L的II型胶原酶溶液消化软骨组织，消化条件为37℃摇床10h，每克软骨组织最终获取细胞数量为1.5*10

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的之一在于提供一种可对不同部位耳软骨组织进行梯度消化的耳软骨细胞制备方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种耳软骨细胞制备方法,包括如下步骤:

步骤1:分别取耳尖、耳中央和耳根处的软骨组织，并分别剪碎得到耳尖软骨碎末、耳中央软骨碎末和耳根软骨碎末；

步骤2：将步骤1所得的耳尖软骨碎末置于浓度为2-3g/L(可以是2g/L、2.5g/L或3g/L，优选的为2g/L)的II型胶原酶液中进行消化，将耳中央软骨碎末置于浓度为4-6g/L(可以是4g/L、5g/L或6g/L，优选的为6g/L)的II型胶原酶液中进行消化，将耳根软骨碎末置于浓度为6-8g/L(可以是6g/L、7g/L或8g/L，优选的为8g/L)的II型胶原酶液中进行消化，其中，消化液中固液质量体积比均为0.08-0.12g/mL(可以是0.8g/mL或0.12g/mL)，消化条件均为在36.3-37.2℃(可以是36.3℃、36.8℃或37.2℃，优选的为37℃)条件下摇床孵育8-12h，分别得到耳尖软骨消化液、耳中央软骨消化液和耳根软骨消化液；

步骤3：将步骤2所得的耳尖软骨消化液、耳中央软骨消化液和耳根软骨消化液混合后经40μm的细胞滤器过滤组织残渣，将滤液离心，去上清，重悬细胞，以1*10

上述技术方案中所述耳尖软骨碎末、耳中央软骨碎末和耳根软骨碎末的质量比为1:4:4。

上述技术方案中所述步骤1中软骨组织为剥离皮肤及软骨膜的软骨。

上述技术方案中所述步骤2中消化条件为在37℃条件下摇床孵育10h。

上述技术方案中所述步骤3中离心条件为转速1000rpm/min的条件下离心5min。

本发明的目的之二在于提供一种采用如上所述制备方法所制备的耳软骨细胞。

本发明的目的之三在于提供一种采用如上所述耳软骨细胞所制备的再生耳软骨组织。

本发明的目的之四在于提供一种采用如上所述再生耳软骨组织的应用，用于耳软骨缺损再造。

本发明的有益效果在于：通过将耳尖软骨碎末、耳中央软骨碎末和耳根软骨碎末根据其自身成分的不同分别置于不同浓度的II型胶原酶溶液中进行消化(2-3g/L、4-6g/L、6-8g/L)，如此可显著的提高耳中央和耳根软骨细胞产量，并且避免长时间酶消化对细胞活性产生不利影响，另外较传统制备方法而言，本方法提高了外基质分泌旺盛、活力强的软骨细胞产量。

附图说明

图1为实施例1、实施例2和实施例3中糖胺多糖含量变化图；

图2为实施例1、实施例2和实施例3中弹性纤维含量变化图；

图3为实施例1、实施例2和实施例3中胶原含量变化图；

图4为原子力显微镜(AFM)检测从耳尖到耳根的细胞外基质分子间作用力变化趋势图；

图5为耳尖处的透射电子显微镜图；

图6为耳中央的透射电子显微镜图；

图7为耳根处的透射电子显微镜图；

图8为实施例4与对照例的细胞产量的比较图；

图9为实施例4与对照例所得细胞迁移能力的比较图；

图10为实施例4与对照例所得细胞增殖能力的比较图；

图11为对照例所得细胞分泌细胞外基质能力的示意图；

图12为实施例4所得细胞培养形成软骨微球能力的示意图；

图13为猪耳廓的耳尖、耳中央和耳根的分布示意图；

图14为人耳廓耳尖、耳中央和耳根的分布示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

步骤1：取猪耳廓的耳尖软骨组织，并剪碎至尺寸近似为1mmx1mmx1mm,得到耳尖软骨碎末；

步骤2：将步骤1所得的耳尖软骨碎末置于浓度为2g/L的II型胶原酶液中进行消化，其中，消化液中固液质量体积比(是指耳尖软骨碎末与II型胶原酶液的体积质量比)为0.1g/mL，消化条件均为在37℃条件下摇床孵育10h，得到耳尖软骨消化液；

步骤3：将步骤2所得的耳尖软骨消化液经40μm的细胞滤器过滤组织残渣，将滤液离心，去上清，重悬细胞，以5*10

其中，所述步骤1中软骨组织为剥离皮肤及软骨膜的软骨。

其中，所述步骤3中离心条件为转速1000rpm/min的条件下离心5min。

实施例2

同实施例1，其区别在于，本实施例所取组织为猪耳廓的耳中央软骨组织，剪碎后得到耳中央软骨碎末，且所述耳中央软骨碎末对应的II型胶原酶液的浓度为6g/L。

实施例3

同实施例1，其区别在于，本实施例所取组织为猪耳廓的耳根软骨组织，剪碎后得到耳根软骨碎末，且所述耳根软骨碎末对应的II型胶原酶液的浓度为8g/L。

实施例4

步骤1:分别取猪耳廓的耳尖、耳中央和耳根处的软骨组织，并分别剪碎得到耳尖软骨碎末、耳中央软骨碎末和耳根软骨碎末；

步骤2：将步骤1所得的耳尖软骨碎末置于浓度为2g/L的II型胶原酶液中进行消化，将耳中央软骨碎末置于浓度为6g/L的II型胶原酶液中进行消化，将耳根软骨碎末置于浓度为8g/L的II型胶原酶液中进行消化，其中，消化液中固液质量体积比均为0.1g/mL，消化条件均为在37℃条件下摇床孵育10h，分别得到耳尖软骨消化液、耳中央软骨消化液和耳根软骨消化液；

步骤3：将步骤2所得的耳尖软骨消化液、耳中央软骨消化液和耳根软骨消化液混合后经40μm的细胞滤器过滤组织残渣，将滤液离心，去上清，重悬细胞，以1*10

上述技术方案中所述耳尖软骨碎末、耳中央软骨碎末和耳根软骨碎末的质量比为1:4:4。

上述技术方案中所述步骤1中软骨组织为剥离皮肤及软骨膜的软骨。

上述技术方案中所述步骤3中离心条件为转速1000rpm/min的条件下离心5min。

对照例

同实施例4，其区别在于，所述步骤2中将耳尖软骨碎末、耳中央软骨碎末和耳根软骨碎末按照质量比为1:4:4混合后放入到浓度为2g/L的II型胶原酶液。

上述实施例1-4以及对照例中对于猪耳廓和人耳廓的耳尖、耳中央和耳根处的部位划分具体如图13和图14所示,其中图13表示猪耳廓的示意图,图14表示人耳廓的结构简图。

检测

分别对实施例1、实施例2和实施例3中耳尖、耳中央、耳根软骨组织细胞外基质中的糖胺多糖[阿尔新蓝比色法定量检测，采用试剂盒GMS19236.2(厂家为GENMEDSCIENTIFICS INC.U.S.A)检测]、胶原[碱水法羟脯氨酸定量检测，采用试剂盒A030-2-1(厂家为南京建成生物工程研究所，中国)检测]、弹性纤维[Fastin弹性蛋白染料结合法定量检测，采用试剂盒F2000(厂家为Biocolor Life Science Assays,UK)检测]，的平均细胞产生量进行分析，具体结果如图1-图3所示，即实施例1、实施例2和实施例3中耳尖、耳中央和耳根的细胞外基质中的糖胺多糖、胶原、弹性纤维的平均细胞产生量呈递增趋势，如图4所示，采用原子力显微镜(Diemnsion FastScan,Bruke,Germany)从耳尖到耳根的细胞外基质分子间作用力进行检测发现从耳尖到耳根的细胞外基质分子间作用力逐渐增加；如图5-图7所示，采用透射电子显微镜观察发现耳中央和耳根处的细胞与细胞外基质的连接更为致密。

如图8所示，实施例4的平均细胞产量为2.5*10

上述各试剂盒的检测方法见对应试剂盒的产品说明书。

实施例4所得软骨细胞可用于制备再生耳软骨组织并应用于耳软骨缺损再造。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。