葛花提取物在制备防治炎症性肠病药物方面的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及葛花提取物在制备防治炎症性肠病药物方面的应用。

背景技术

炎症性肠病（IBD）是一组病因不明、影响胃肠道的免疫性疾病的总称。IBD患者有许多胃肠道疾病的特征性症状，如不适、腹泻、血便等，多数患者还伴有肠外并发症，如关节炎、皮炎、视力下降等。目前，还没有治疗IBD的特效药，几乎所有的药物都只能缓解症状。由于复发率高，治疗费用高，不仅严重影响患者的生活质量，而且增加了患者的精神和经济负担。因此，寻找安全有效的药物具有重要的理论和实践意义。在所有的动物中，肠道上皮形成了一个物理屏障，可以选择性地吸收营养物质，防止病原体入侵和免疫反应。然而，在炎症状态下，会发生组织损伤，机体必须通过提高增殖和分化的速度来促进组织修复。其中，JAK-STAT和Nrf2-Keap1信号通路已被证明通过促进肠道干细胞的分裂和分化参与了IBD的先天和适应性免疫反应过程。一些有毒化合物，如十二烷基硫酸钠（Sodium dodecylsulfate，SDS）、过氧化氢（H

发明内容

本发明的目的之一是提供葛花提取物（Flowers Puerariae extract，FPE）在制备防治炎症性肠病药物方面的应用，提供一种可靠的抗炎剂来帮助维持肠道环境的平衡，对治疗炎症性肠病疗效好、价格低廉且无明显副作用。

上述目的所针对的炎症性肠病包括肠道炎症状态引起的肠道形态改变、肠粘膜通透性改变和/或肠道长度受损。

上述的肠道炎症状态包括溃疡性结肠炎和/或克罗恩病。

本发明的目的之二是提供葛花提取物在制备缓解炎症性肠病药物方面的应用。

上述目的所针对的缓解炎症性肠病为：缓解由外源性促炎因子导致的前体细胞过度增殖分化。

上述的缓解由外源性促炎因子导致的前体细胞过度增殖分化为：通过负调控JAK-STAT信号通路缓解炎症性肠病。

本发明的目的之三是提供葛花提取物在制备保护肠道屏障及稳定肠道形态药物方面的应用。

为了证实上述目的，本发明采用动物实验进行阐明：

1、以模式生物果蝇为研究对象，经促炎物质SDS处理后造炎症性肠病模型，观察其生存率、肠道通透性、肠道长度等是否发生改变，证明葛花对炎症性肠病的治疗作用。

2、在日常标准饮食中加入葛花提取物对果蝇的摄食量、体重及发育都无明显影响，证明葛花提取物的使用安全性。

3、利用绿色荧光报告蛋白靶向标记JAK-STAT信号通路上关键基因构建的转基因果蝇，结合分子水平验证证明葛花保护上皮细胞损伤的分子机制，是通过调控上述信号通路实现的。

本发明相较于现有技术的有益效果为：

本发明中葛花提取物的原植物葛花，是一种多年生的豆科草本植物，广泛分布在中国、韩国、日本和印度的温带地区。在传统的中医理论和临床实践中，它们被发现具有广泛的生物和药理活性，包括抗炎、抗氧化、治疗酒精中毒和其他疾病。现代药理研究发现，葛花积累了丰富的黄酮类化合物，包括葛根素、大豆苷、大豆苷元等，具有潜在治疗炎症性肠病的药理作用。

本发明发现并验证了葛花提取物具有治疗炎症性肠病的新功效，可通过帮助抵抗促炎症试剂造成的感染提高炎症状态下果蝇的生存率，改善肠道的屏障功能和形态，负调控JAK-STAT信号通路维持肠道环境的平衡。该提取物对于炎症性肠病的疗效显著且价格低廉副作用低，可通过改善机体健康水平，降低肠道通透性，延长肠道长度等几方面宏观改善肠道炎症状态。葛花提取物可通过负调控结肠炎发病机制的重要因素—JAK-STAT信号通路，缓解由外源性促炎因子导致的前体细胞过度增殖分化，维持肠道细胞稳态，达到治疗炎症性肠病的作用。

附图说明

图1为标准品和葛花提取物LC-MS离子流色谱图：其中，A图为标准品离子流色谱图，B图为葛花提取物离子流色谱图；

图2为喂食葛花提取物后炎症状态下果蝇的生存率和生存期影响：其中，A图为各实验组中雌性果蝇暴露于SDS5天内的存活情况，B图为各实验组中雌性果蝇的中位数生存率，C图为为各实验组中雄性果蝇暴露于SDS5天内的存活情况，D图为为各实验组中雄性果蝇的中位数生存率；

图3为日常摄入葛花提取物的安全性评价：

其中，A图为喂食食用蓝色染料后果蝇腹部出现蓝染的情况，按相应打分判断果蝇的食物摄入量，A0图为果蝇未观察到含染料的食物，计分为0分，A1图为果蝇摄食含染料的食物后腹部带有淡淡的蓝色染料或蓝色染料占腹部体积不到三分之一，计分为1分，A2图为果蝇摄食后腹部蓝染大约占腹部的一半，计分为2分，A3图果蝇摄食后腹部蓝染超过腹部的一半，计分为3分，计分越高表明摄食量越多；

B图为日常喂食不同浓度葛花提取物后，检测葛花提取物是否影响果蝇的摄食量，C图喂食不同浓度葛花提取物后果蝇的体重变化；

D图为喂食不同浓度葛花提取物后果蝇幼虫成功孵化为蛹的孵化率；

E图为喂食不同浓度葛花提取物后果蝇幼虫发育为蛹的周期变化；

F图为喂食不同浓度葛花提取物后果蝇幼虫半数发育为蛹的时间变化；

图4为葛花提取物缓解炎症状态下肠道通透性受损及形态改变：

其中，A图的左图为对照组，右图为出现“蓝精灵”现象果蝇的模型组，表明肠道通透性受损；

B图为对照组、模型组和喂食浓度为5mg/ml葛花提取物后果蝇“蓝精灵”的出现率；

C图为对照组、模型组和喂食浓度为5mg/ml葛花提取物后果蝇肠道长度对比；

D图的上图为对照组肠道情况，下图为模型组肠道情况；

E图为对照组、模型组和喂食浓度为5mg/ml葛花提取物后果蝇肠道出现黑色素瘤样物质的百分比；

图5为葛花提取物对SDS诱导的干细胞增殖分化的影响：

其中，A图为实验所用的果蝇中肠的位置示意图；

B-B’’’图为对照组果蝇肠道干细胞的数量和形态，其中B’和B’’为B的局部放大图，B’仅示出GFP阳性细胞；

C-C’’’图为应激后模型组果蝇肠道干细胞的数量和形态，其中C’和C’’为C的局部放大图，C’仅示出GFP阳性细胞；

D-D’’’图为应激后喂食浓度为5mg/ml葛花提取物组果蝇肠道干细胞的数量和形态，其中D’和D’’为D的局部放大图，D’仅示出GFP阳性细胞；

E-E’’’图为对照组果蝇肠道干细胞的分化情况，其中E’和E’’为E的局部放大图，E’仅示出GFP阳性细胞；

F-F’’’图为应激后对模型组果蝇肠道干细胞的分化情况，其中F’和F’’为F的局部放大图，F’仅示出GFP阳性细胞；

G-G’’’图为为应激后喂食浓度为5mg/ml葛花提取物组果蝇肠道干细胞的分化情况，其中G’和G’’为G的局部放大图，G’仅示出GFP阳性细胞；

H图为对照组、模型组和喂食浓度为5mg/ml葛花提取物组果蝇肠道干细胞相对数量变化情况；

I图为对照组、模型组和喂食浓度为5mg/ml葛花提取物组果蝇肠道干细胞面积变化情况；

J图为对照组、模型组和喂食浓度为5mg/ml葛花提取物组果蝇pH3阳性细胞数量变化情况；

图6为明确葛花提取物负调控JAK-STAT信号通路缓解炎症性肠病：

其中，A-A’’’图对照组果蝇肠道中标记STAT信号的GFP阳性细胞数量及形态变化，其中A’、A’’和A’’’为A的局部放大图，A’仅示出GFP阳性细胞，A’’仅示出标记细胞核；

B-B’’’图为应激后模型组果蝇肠道中标记STAT信号的GFP阳性细胞数量及形态变化，其中B’、B’’和B’’’为B的局部放大图，B’仅示出GFP阳性细胞，B’’仅示出标记细胞核；

C-C’’’图为应激后喂食浓度为5mg/ml葛花提取物果蝇肠道中标记STAT信号的GFP阳性细胞数量及形态变化，其中C’、C’’和C’’’为C的局部放大图，C’仅示出GFP阳性细胞，C’’仅示出标记细胞核；

D图为对照组、模型组和喂食浓度为5mg/ml葛花提取物组标记STAT信号的GFP阳性细胞相对数量变化情况；

E图为对照组、模型组和喂食浓度为5mg/ml葛花提取物组标记STAT信号的GFP阳性细胞面积变化情况；

F图为对照组、模型组和喂食浓度为5mg/ml葛花提取物组肠道中Upd3的基因表达水平变化；

G图为对照组、模型组和喂食浓度为5mg/ml葛花提取物组肠道中Socs36E的基因表达水平变化。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。

一、制备葛花提取物：

将干燥的葛花与50%（V/V）甲醇溶液混合，固液比为1∶30的混合物在70℃下用超声提取2小时。萃取后的产品依次用石油醚、乙醇和氯仿-丁醇净化，并在硅胶柱系统中用甲醇-氯仿溶液的混合流动相逐渐洗脱。

二、葛花提取物成分分析：

通过LC-MS离子流色谱对葛花提取物的成分进行分析。标准品的色谱在30min的保留时间内洗脱，确定之前采集的葛花提取物中含有葛根素、大豆苷、大豆苷元、芦丁、芹菜素和染料木素（见图1）。

三、果蝇前期给药方法说明：

基础培养基配置：以总体积800mL为例，电子天平称取琼脂8g、蔗糖12g、无水葡萄糖26.4g、玉米粉12g、黄豆粉10.4g、麦芽粉8g、酵母28g；烧杯放入600mL常温的纯水，加入称取好的琼脂、蔗糖、无水葡萄糖，磁力搅拌器加热至沸腾后，加入冷水溶解的玉米粉、黄豆粉、麦芽粉等于烧杯中混匀，小瓶分装约高4cm，完全凝固后，置于4℃冰箱储存以备后续实验使用。

葛花提取物喂食组和对照组的喂食方法、喂食量和时间：对照组食物为基础培养基，葛花提取物组食物为一定比例葛花提取物与基础培养基混合而成的含药培养基，每组食物厚度为4cm左右。

喂食时间：收集果蝇卵于超纯水中，混匀后形成含卵的悬浮液，用移液枪随机打入各种培养基中，待果蝇羽化后2-3天收集，雌雄分组进行后续实验。

四、葛花提取物对炎症状态下果蝇的生存率和生存期的影响：

将果蝇（每瓶20只）转移到装有5层滤纸的小瓶中，滤纸上分别渗入0.6%SDS和5%蔗糖溶液得到实验组，滤纸上渗入5%蔗糖溶液得到对照组。每2天更换一次滤纸，记录死亡的果蝇数量。

如图2A和2C所示，与对照组相比，经葛花提取物喂食的雌性和雄性果蝇在暴露于SDS5天后，其整体存活率明显提高。为具体分析在炎症应激的状态下葛花提取物的疗效，本发明进一步研究中位数生存率发现，经葛花提取物喂食的果蝇明显高于对照组，如图2B和2D所示，说明葛花提取物可以提高果蝇整体的抗炎能力，延缓半数死亡时间。其中以5mg/ml葛花提取物组效果最佳，因此5mg/ml葛花提取物为最佳有效浓度。葛花提取物对雌性的保护作用比雄性强，其原因为药效学、药动学及激素水平上的性别差异。

结论：果蝇喂食十二烷基硫酸钠（SDS）可刺激肠道炎症的发生，破坏肠道屏障的正常功能，最终导致生物体的死亡。葛花提取物具有显著的抗炎能力。

五、日常摄入葛花提取物的安全性评价：

果蝇发育、摄食量等被认为是评估药物安全性及是否影响正常机体代谢的一种高通量方法。如图3A所示，喂食蓝色染料后果蝇腹部出现不同程度蓝染，代表其食物的摄入情况，并据此进行摄食量的判断。如图3B所示，日常摄入葛花提取物组食物不会影响果蝇的正常摄食量。如图3C所示，对其体重也无明显影响，说明食用葛花提取物不会影响机体正常代谢。一些药物在应用中会对幼体产生毒性，主要表现为降低幼虫的成蛹率或延长其发育周期。因此在喂食葛花提取物后，对每组果蝇幼虫成功孵化为蛹的孵化率（见图3D）和幼虫生长周期（见图3E和F）进行观察，这些结果表明，日常喂食葛花提取物对果蝇的发育没有影响。

结论：日常食用葛花提取物安全。

六、葛花提取物缓解炎症状态下肠道屏障功能障碍及形态改变：

收集在0.6%的SDS处理4天后的雌蝇，将其饥饿6h后，喂养含有蓝色染料的食物，正常情况下，蓝色染料只出现于果蝇腹部，当肠道通透性发生改变时，果蝇口器、四肢全部出现蓝染情况，即“蓝精灵”实验（图4A）。其余于冰上解剖其肠道，观察肠道长度及是否产生黑色素瘤样物质（图4D）。

“蓝精灵”实验发现喂食5mg/ml葛花提取物后，可降低“蓝精灵”的出现率，表明葛花提取物可明显改善SDS诱导的肠道粘膜损伤及肠道通透性下降，提升肠道屏障功能（图4B）。SDS处理后，模型组果蝇肠道长度明显缩短，喂食5mg/ml葛花提取物的果蝇与模型组相比有明显延长（图4C）。在SDS中观察到约30%的黑色素瘤样物质，而在喂食5mg/ml葛花提取物后，黑色素瘤样物质的百分比下降到约12%（图4E），说明葛花提取物能改善SDS引起的肠道粘膜损伤、长度变短以及黑色素瘤样物质的形成。

结论：葛花提取物可一定程度上修复炎症引起的肠道屏障功能障碍及形态改变。

七、葛花提取物对SDS诱导的干细胞增殖的影响：

使用自身携带绿色荧光报告蛋白的

如图5B-5C”所示，SDS刺激导致GFP阳性细胞的面积和数量强烈增加，这表明在炎症会导致肠道干细胞过度增殖分化。而在喂食5mg/ml葛花提取物后，肠道中GFP阳性细胞的面积和数量明显降低，这说明葛花提取物对炎症引起的肠细胞增殖分化紊乱和肠稳态失衡具有调节作用（图5D-5D”，5H，5I）。为进一步探究肠道干细胞的增殖情况，我们使用标记分裂细胞的抗磷酸组蛋白H3（anti-pH3）抗体来染色肠道。在SDS处理的果蝇肠道中检测到大量的pH3阳性细胞，而对照组果蝇肠道中的pH3阳性细胞数量非常少（图5E-5F”）。对喂食5mg/ml葛花提取物组的果蝇观察发现，其肠道中pH3阳性细胞的数量明显下降，这表明葛花提取物可减少炎症状态下肠道干细胞的过度分化（图5G-5G”，5J）。

总结：葛花提取物可一定程度降低由炎症引起的肠道干细胞过度增殖分化，提高细胞分化效率，维持肠道细胞稳态。

八、葛花提取物缓解炎症性肠病的分子机制：

JAK-STAT信号通路在炎症性肠病的发生发展及治疗中发挥着关键作用。本专利使用携带绿色荧光报告蛋白构建的果蝇品系，该品系果蝇主要涉及JAK-STAT信号通路的Stat92E结合位点的10倍重复（称为

正常情况下，如对照组果蝇的中肠GFP信号较弱，因为JAK-STAT信号通路未被激活，GFP信号表达水平低（图6A-6A’’’）。在SDS刺激后，GFP阳性细胞的面积和数量显著增加，这表明SDS引起肠道稳态失衡主要是通过激活肠道中的JAK-STAT通路实现的（图6B-6B’’’）。而在喂食5mg/ml葛花提取物后，明显抑制了SDS刺激下果蝇肠道内GFP表达水平的增加，细胞数量及大小都有一定程度回调，这表明葛花提取物发挥治疗炎症性肠病的作用机制是通过抑制炎症状态下被激活的JAK-STAT通路实现的（图6C-6C’’’，6D，6E）。为了避免实验出现假阳性，本专利采用RT-qPCR技术对JAK-STAT通路上关键基因Upd3和Socs36E的表达水平进行双重验证。实验发现，SDS刺激增加了肠道中Upd3和Socs36E的表达。在喂食葛花提取物物后，Upd3的mRNA表达明显减少，Socs36E作为JAK/STAT信号通路的负调控因子，其基因表达水平持续增加可直接抑制JAK/STAT信号通路（图6F-6G）。这表明，葛花提取物可抑制炎症刺激引起的肠道中JAK-STAT通路的激活。综上所述，本组图说明了葛花提取物治疗炎症性肠病的是通过抑制JAK-STAT信号通路实现的。