抗TIGIT抗体

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及特异性结合TIGIT的抗体或抗原结合片段。

背景技术

TIGIT(T cell immunoglobulin and ITIM domain)，具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体，也称为VSIG9，VSTM3或WUCAM，属于免疫球蛋白超家族成员，由免疫球蛋白可变区(IgV)、跨膜区和免疫受体酪氨酸抑制基序(immuno receptor tyrosine-basedinhibitor motif，ITIM)组成。TIGIT是表达于NK细胞和T细胞表面的共抑制信号分子，与T细胞、NK细胞及树突状细胞DC等的功能调节密切相关(Stengel KF,et a1.(2012)ProcNatlAcad Sci USA.109)。有研究发现，TIGIT在肿瘤浸润性Treg细胞上高度富集。肿瘤组织中的TIGIT+Treg细胞表现出高度活性和抑制性的Treg细胞表型。

TIGIT是一种共抑制性受体蛋白，TIGIT与共刺激受体CD226竞争性结合配体CD155(脊髓灰质炎病毒受体PVR)和CD122(脊髓灰质炎病毒受体2)从而介导免疫抑制作用。配体CD155和CD112存在于树突细胞和巨噬细胞上，并且在一些癌细胞中高度表达，例如在黑色素瘤等其他肿瘤细胞上(Inozume et al.(2014)J.Invest,Dermato1.134:S121-Abstract693)过表达。尽管CD155可与共活化受体CD226相互作用增强T细胞活化，增强肿瘤杀伤，但在TIGIT存在的情况下，高亲和力TIGIT/CD155相互作用会抑制T细胞应答，抑制NK细胞毒性，刺激并增加其分泌IL-10，降低IL-12分泌水平，减弱抗肿瘤反应。另外，TIGIT表达与其他共抑制分子(包括PD-1)的表达高度相关。这些表明肿瘤细胞通过上调TIGIT途径以及其他抑制性检查点网络以促进免疫抑制机制，进而保护肿瘤细胞逃避免疫系统攻击。

已有研究表明，特异性结合人TIGIT的单克隆抗体，在动物模型中显示了显著的抗肿瘤效果(Martinet and Smyth 2015)。在WO2006/124667专利中已经证实阻断人TIGIT的抗体可用于治疗癌症。也有研究表明，TIGIT可增强Tregs稳定性及其对产生γ-干扰素(IFN-γ)的T细胞增殖的抑制功能，选择性抑制辅助性T细胞1(Th1)和辅助性T细胞17(Th17)反应——这是驱动自身免疫组织炎症的主要反应。此外，通过抑制NK细胞的细胞溶解活性，TIGIT减少NK细胞细胞因子IFN-γ的产生，降低其细胞毒性。因此，阻断TIGIT信号转导具有增强自身免疫反应的作用。此外，在WO2009126688、WO2014089113、WO2015009856、WO2015143343、WO2015174439、WO2017053748、WO2017030823、WO2016106302、US20160176963、US20130251720等专利中也报道了TIGIT的抗体及相关应用。

多个研究表明，TIGIT与癌症、自身免疫、感染等多种疾病相关，TIGIT是极具潜力的多种疾病治疗的新靶点，开发专门针对TIGIT的拮抗抗体将阻断它对T细胞的抑制作用并增强抗击癌症的免疫力。然而，目前国内外还没有针对TIGIT的特异性抗体药物上市，因此亟须研发新型高效特异性TIGIT抗体，尤其是特异性靶向TIGIT的CD155/CD112阻断型抗体，这将给癌症或感染疾病患者提供更多的用药选择。

发明内容

本发明的目的是提供一种分离的抗体，该抗体能够阻断TIGIT/CD155的结合，在人源化小鼠肿瘤模型中，本发明的抗体具有抑制肿瘤生长的作用，这表明本发明的抗体对肿瘤有积极的治疗作用。

本发明第一方面，提供了结合人/猴TIGIT的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含选自以下群组：

(1)如SEQ ID NO：1、4、7、15、19所示的HCDR1；

(2)如SEQ ID NO：2、5、8、10、11、12、14、16、17、20所示的HCDR2；

(3)如SEQ ID NO：3、6、9、13、18、21所示的HCDR3；

(4)如SEQ ID NO：22、25所示的LCDR1；

(5)如SEQ ID NO：23、26、31所示的LCDR2；以及

(6)如SEQ ID NO：24、27、28、29、30、32所示的LCDR3；或者与所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3序列相比具有一个或几个氨基酸的保守取代(例如1个，2个或3个氨基酸的保守取代)的序列。

进一步地，所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含选自以下群组：

(1)如SEQ ID NO：1或7所示的HCDR1；如SEQ ID NO：2、8、11、12或17所示的HCDR2；如SEQ ID NO：3、9、13、或18所示的HCDR3；如SEQ ID NO：22所示的LCDR1；如SEQ ID NO：23所示的LCDR2；以及如SEQ ID NO：24或28所示的LCDR3；或者与所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3序列相比具有一个或几个氨基酸的保守取代(例如1个，2个或3个氨基酸的保守取代)的序列；

(2)如SEQ ID NO：4、15、或19所示的HCDR1；如SEQ ID NO：5、10、14、16或20所示的HCDR2；如SEQ ID NO：6或21所示的HCDR3；如SEQ ID NO：25所示的LCDR1；如SEQ ID NO：26所示的LCDR2；以及如SEQ ID NO：27、29、30或32所示的LCDR3；或者与所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3序列相比具有一个或几个氨基酸的保守取代(例如1个，2个或3个氨基酸的保守取代)的序列；

(3)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：11所示的HCDR2，如SEQID NO：9所示的HCDR3，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：31所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：28所示的LCDR3；或者与所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3序列相比具有一个或几个氨基酸的保守取代(例如1个，2个或3个氨基酸的保守取代)的序列。

进一步地，其中所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含选自以下群组：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的HCDR1，如SEQ ID NO：2所示的HCDR2，如SEQID NO：3所示的HCDR3，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：23所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：24所示的LCDR3；或者与所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3序列相比具有一个或几个氨基酸的保守取代(例如1个，2个或3个氨基酸的保守取代)的序列；

(2)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：5所示的HCDR2，如SEQID NO：6所示的HCDR3，如SEQ ID NO：25所示的LCDR1，如SEQ ID NO：26所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：27所示的LCDR3；或者与所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3序列相比具有一个或几个氨基酸的保守取代(例如1个，2个或3个氨基酸的保守取代)的序列；

(3)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：8所示的HCDR2，如SEQID NO：9所示的HCDR3，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：23所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：28所示的LCDR3；或者与所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3序列相比具有一个或几个氨基酸的保守取代(例如1个，2个或3个氨基酸的保守取代)的序列；

(4)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：10所示的HCDR2，如SEQID NO：6所示的HCDR3，如SEQ ID NO：25所示的LCDR1，如SEQ ID NO：26所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：29所示的LCDR3；或者与所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3序列相比具有一个或几个氨基酸的保守取代(例如1个，2个或3个氨基酸的保守取代)的序列；

(5)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：11所示的HCDR2，如SEQID NO：9所示的HCDR3，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：23所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：28所示的LCDR3；或者与所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3序列相比具有一个或几个氨基酸的保守取代(例如1个，2个或3个氨基酸的保守取代)的序列；

(6)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：12所示的HCDR2，如SEQID NO：13所示的HCDR3，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：23所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：28所示的LCDR3；或者与所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3序列相比具有一个或几个氨基酸的保守取代(例如1个，2个或3个氨基酸的保守取代)的序列；

(7)氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示的HCDR1，如SEQ ID NO：16所示的HCDR2，如SEQ ID NO：6所示的HCDR3，如SEQ ID NO：25所示的LCDR1，如SEQ ID NO：26所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：27所示的LCDR3；或者与所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3序列相比具有一个或几个氨基酸的保守取代(例如1个，2个或3个氨基酸的保守取代)的序列；

(8)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：11所示的HCDR2，如SEQID NO：9所示的HCDR3，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：31所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：28所示的LCDR3；或者与所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3序列相比具有一个或几个氨基酸的保守取代(例如1个，2个或3个氨基酸的保守取代)的序列；

(9)氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示的HCDR1，如SEQ ID NO：20所示的HCDR2，如SEQ ID NO：21所示的HCDR3，如SEQ ID NO：25所示的LCDR1，如SEQ ID NO：26所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或者与所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3序列相比具有一个或几个氨基酸的保守取代(例如1个，2个或3个氨基酸的保守取代)的序列；

(10)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：17所示的HCDR2，如SEQ ID NO：18所示的HCDR3，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：23所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：28所示的LCDR3；或者与所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3序列相比具有一个或几个氨基酸的保守取代(例如1个，2个或3个氨基酸的保守取代)的序列；

(11)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：14所示的HCDR2，如SEQ ID NO：6所示的HCDR3，如SEQ ID NO：25所示的LCDR1，如SEQ ID NO：26所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：30所示的LCDR3；或者与所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3序列相比具有一个或几个氨基酸的保守取代(例如1个，2个或3个氨基酸的保守取代)的序列。

更进一步地，其中所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3包含选自以下群组：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：5所示的HCDR2，如SEQID NO：6所示的HCDR3，如SEQ ID NO：25所示的LCDR1，如SEQ ID NO：26所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：27所示的LCDR3；

(2)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：11所示的HCDR2，如SEQID NO：9所示的HCDR3，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：23所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：28所示的LCDR3；

(3)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：12所示的HCDR2，如SEQID NO：13所示的HCDR3，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：23所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：28所示的LCDR3；

(4)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：11所示的HCDR2，如SEQID NO：9所示的HCDR3，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：31所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：28所示的LCDR3；

(5)氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示的HCDR1，如SEQ ID NO：20所示的HCDR2，如SEQ ID NO：21所示的HCDR3，如SEQ ID NO：25所示的LCDR1，如SEQ ID NO：26所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；

(6)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：17所示的HCDR2，如SEQID NO：18所示的HCDR3，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：23所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：28所示的LCDR3；

(7)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：14所示的HCDR2，如SEQID NO：6所示的HCDR3，如SEQ ID NO：25所示的LCDR1，如SEQ ID NO：26所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：30所示的LCDR3。

在一些实施方案中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3具有1个，2个或3个氨基酸差异的CDRs变体是经人源化改造或经亲和力成熟方法筛选得到的具有1个，2个或3个氨基酸差异的序列。

在一些实施方案中，人源化改造或经亲和力成熟后的抗体或抗原结合片段包含如下CDRs序列：

如SEQ ID NO：4或7所示的HCDR1；如SEQ ID NO：14、17或81所示的HCDR2；如SEQ IDNO：6或18所示的HCDR3；如SEQ ID NO：82、85或89所示的LCDR1；如SEQ ID NO：23、26、83或86所示的LCDR2；和如SEQ ID NO：28、30、84、87、88、90、91、92、93所示的LCDR3。

优选地，人源化改造或经亲和力成熟后的抗体或抗原结合片段选自如下所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3群组：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：17所示的HCDR2，如SEQID NO：18所示的HCDR3，如SEQ ID NO：82所示的LCDR1，如SEQ ID NO：23所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：28所示的LCDR3；

(2)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：17所示的HCDR2，如SEQID NO：18所示的HCDR3，如SEQ ID NO：82所示的LCDR1，如SEQ ID NO：83所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：28所示的LCDR3；

(3)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：81所示的HCDR2，如SEQID NO：18所示的HCDR3，如SEQ ID NO：82所示的LCDR1，如SEQ ID NO：83所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：28所示的LCDR3；

(4)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：81所示的HCDR2，如SEQID NO：18所示的HCDR3，如SEQ ID NO：82所示的LCDR1，如SEQ ID NO：83所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：84所示的LCDR3；

(5)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：81所示的HCDR2，如SEQID NO：18所示的HCDR3，如SEQ ID NO：82所示的LCDR1，如SEQ ID NO：83所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：88所示的LCDR3；

(6)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：81所示的HCDR2，如SEQID NO：18所示的HCDR3，如SEQ ID NO：89所示的LCDR1，如SEQ ID NO：83所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：90所示的LCDR3；

(7)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：81所示的HCDR2，如SEQID NO：18所示的HCDR3，如SEQ ID NO：82所示的LCDR1，如SEQ ID NO：83所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：91所示的LCDR3；

(8)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：14所示的HCDR2，如SEQID NO：6所示的HCDR3，如SEQ ID NO：85所示的LCDR1，如SEQ ID NO：26所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：30所示的LCDR3；

(9)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：14所示的HCDR2，如SEQID NO：6所示的HCDR3，如SEQ ID NO：85所示的LCDR1，如SEQ ID NO：86所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：30所示的LCDR3；

(10)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：14所示的HCDR2，如SEQ ID NO：6所示的HCDR3，如SEQ ID NO：85所示的LCDR1，如SEQ ID NO：86所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：87所示的LCDR3；

(11)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：14所示的HCDR2，如SEQ ID NO：6所示的HCDR3，如SEQ ID NO：85所示的LCDR1，如SEQ ID NO：86所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：92所示的LCDR3；

(12)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：14所示的HCDR2，如SEQ ID NO：6所示的HCDR3，如SEQ ID NO：85所示的LCDR1，如SEQ ID NO：86所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：93所示的LCDR3；

更优选地，人源化改造或经亲和力成熟后的抗体或抗原结合片段选自如下所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3群组：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：81所示的HCDR2，如SEQID NO：18所示的HCDR3，如SEQ ID NO：82所示的LCDR1，如SEQ ID NO：83所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：28所示的LCDR3；

(2)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：81所示的HCDR2，如SEQID NO：18所示的HCDR3，如SEQ ID NO：82所示的LCDR1，如SEQ ID NO：83所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：84所示的LCDR3；

(3)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：14所示的HCDR2，如SEQID NO：6所示的HCDR3，如SEQ ID NO：85所示的LCDR1，如SEQ ID NO：86所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：30所示的LCDR3；

(4)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的HCDR1，如SEQ ID NO：14所示的HCDR2，如SEQID NO：6所示的HCDR3，如SEQ ID NO：85所示的LCDR1，如SEQ ID NO：86所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：87所示的LCDR3。

本发明第二个方面，提供了结合人/猴TIGIT的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区：

(1)其中所述的重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:33-43构成的群组中的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:33-43构成的群组中的氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或者与选自由SEQ ID NO:33-43构成的群组中的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；并且

(2)其中所述的轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:44-51构成的群组中的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:44-51构成的群组中的氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或者与选自由SEQ ID NO:44-51构成的群组中的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

优选地，所述的置换为保守置换。

优选地，其中所述的重链可变区和轻链可变区包含：

(1)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:33所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；并且

(2)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:44所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

其中(b)中所述置换为保守置换。

优选地，其中所述的重链可变区和轻链可变区包含：

(1)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:34所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；并且

(2)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:45所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

其中(b)中所述置换为保守置换。

优选地，其中所述的重链可变区和轻链可变区包含：

(1)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:35所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；并且

(2)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:46所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

其中(b)中所述置换为保守置换。

优选地，其中所述的重链可变区和轻链可变区包含：

(1)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:36所示氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:36所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；并且

(2)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:47所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

其中(b)中所述置换为保守置换。

优选地，其中所述的重链可变区和轻链可变区包含：

(1)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列

(a)如SEQ ID NO:37所示氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:37所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；并且

(2)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:48所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

其中(b)中所述置换为保守置换。

优选地，其中所述的重链可变区和轻链可变区包含：

(1)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:38所示氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:38所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；并且

(2)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:46所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

其中(b)中所述置换为保守置换。

优选地，其中所述的重链可变区和轻链可变区包含：

(1)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:40所示氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:40所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；并且

(2)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:45所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

其中(b)中所述置换为保守置换。

优选地，其中所述的重链可变区和轻链可变区包含：

(1)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:42所示氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:42所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；并且

(2)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:50所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

其中(b)中所述置换为保守置换。

优选地，其中所述的重链可变区和轻链可变区包含：

(1)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:43所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；并且

(2)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:51所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

其中(b)中所述置换为保守置换。

优选地，其中所述的重链可变区和轻链可变区包含：

(1)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:41所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；并且

(2)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:46所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

其中(b)中所述置换为保守置换。

优选地，其中所述的重链可变区和轻链可变区包含：

(1)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:39所示氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:39所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；并且

(2)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：

(a)如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列；

(b)与SEQ ID NO:49所示氨基酸序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、或添加(例如1个，2，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；

(c)与SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

其中(b)中所述置换为保守置换。

更优选地，其中所述的重链可变区和轻链可变区选自以下群组：

(1)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；

(2)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:37所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列；

(3)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:38所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；

(4)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:42所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；

(5)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；

(6)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；

(7)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:39所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段经人源化改造或经亲和力成熟筛选，所述的抗体或抗原结合片段还包含如SEQ ID NO:54-59所示的重链可变区；或者与所示SEQ ID NO:54-59具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；并且所述的抗体或抗原结合片段还包含如SEQ ID NO:60-72所示的轻链可变区；或者与所示SEQ ID NO:60-72具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

优选地，其中所述的重链可变区和轻链可变区可选自以下群组：

(1)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:54所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:60所示氨基酸序列，或者与所述轻重链可变区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

(2)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:55所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:61所示氨基酸序列，或者与所述轻重链可变区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

(3)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:56所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:62所示氨基酸序列，或者与所述轻重链可变区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

(4)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:55所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:62所示氨基酸序列，或者与所述轻重链可变区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

(5)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:56所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:61所示氨基酸序列，或者与所述轻重链可变区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

(6)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:55所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:66所示氨基酸序列，或者与所述轻重链可变区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

(7)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:55所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:67所示氨基酸序列，或者与所述轻重链可变区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

(8)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:55所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:68所示氨基酸序列，或者与所述轻重链可变区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

(9)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:57所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:63所示氨基酸序列，或者与所述轻重链可变区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

(10)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:58所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:64所示氨基酸序列，或者与所述轻重链可变区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

(11)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:59所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:65所示氨基酸序列，或者与所述轻重链可变区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

(12)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:59所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:69所示氨基酸序列，或者与所述轻重链可变区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

(13)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:59所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:70所示氨基酸序列，或者与所述轻重链可变区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

(14)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:59所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:71所示氨基酸序列，或者与所述轻重链可变区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

(15)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:59所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:72所示氨基酸序列，或者与所述轻重链可变区氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；

更优选地，其中所述的重链可变区和轻链可变区选自以下群组：

(1)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:55所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列；

(2)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:55所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；

(3)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:59所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列；

(4)所述重链可变区具有如SEQ ID NO:59所示氨基酸序列，并且所述轻链可变区具有如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。

本发明第三方面，提供了结合人/猴TIGIT的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段是鼠源的、嵌合的、人源化的、亲和力成熟的；其中所述的人源化抗体轻链和重链可变区上的FR区序列分别来源于人种系轻链和重链或其突变序列；本发明抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区。

优选地，所述抗体包含人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的重链恒定结构域和人κ或λ类型的轻链恒定结构域或其变体，其中所述变体包括一个或几个氨基酸的取代。

优选地，所述抗体包含人IgG1恒定结构域或其变体，和κ恒定结构域或其变体，其中所述变体包括一个或几个氨基酸的取代。

更优选地，所述抗体包含如SEQ ID NO:52所示的重链恒定区和包含如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区。

更优选地，本发明抗体包含具有两条轻链和两条重链的完整结构，所述抗体选自以下群组：

(1)重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQID NO:52所示的重链恒定区，并且轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示的轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区；

(2)重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQID NO:52所示的重链恒定区，并且轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示的轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区；

(3)重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQID NO:52所示的重链恒定区，并且轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区；

(4)重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQID NO:52所示的重链恒定区，并且轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示的轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区；

(5)重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQID NO:52所示的重链恒定区，并且轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示的轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区；

(6)重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQID NO:52所示的重链恒定区，并且轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区；

(7)重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQID NO:52所示的重链恒定区，并且轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示的轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区；

(8)重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQID NO:52所示的重链恒定区，并且轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示的轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区；

(9)重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQID NO:52所示的重链恒定区，并且轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示的轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区；

(10)重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQID NO:52所示的重链恒定区，并且轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示的可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区；

(11)重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQID NO:52所示的重链恒定区，并且轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:69所示的轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区。

更优选地，本发明抗体包含具有两条轻链和两条重链的完整结构，所述抗体选自以下群组：

(1)重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQID NO:52所示的重链恒定区，并且轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示的轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区；

(2)重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQID NO:52所示的重链恒定区，并且轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示的轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区；

(3)重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQID NO:52所示的重链恒定区，并且轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示的轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区；

(4)重链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQID NO:52所示的重链恒定区，并且轻链包含氨基酸序列如SEQ ID NO:69所示的轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示的轻链恒定区。

本发明第四方面，提供了一种分离的核酸分子，其编码本发明所述的抗体或抗原结合片段。编码本发明的抗体的重链和/或轻链的核酸在本发明的范围内，根据重链和/或轻链的氨基酸序列，本领域技术人员能够很容易得到相应的核酸序列。

本发明第五方面，提供了一种组合物，该组合物含有治疗有效量的本发明所述抗体或抗原结合片段，以及药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。

本发明第六方面，提供一种疫苗，其包含本发明抗体或抗原结合片段。

本发明第七方面，提供本发明所述抗体在制备用于检测样品中TIGIT的试剂中的用途。

本发明第八方面，提供本发明所述抗体或抗原结合片段、所述组合物、所述疫苗在制备用于预防和/或治疗肿瘤相关药物中的用途。其中所述肿瘤选自食管癌、胃肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、结直肠癌、肾癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌、头颈癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、生殖细胞癌、骨癌、皮肤癌、胸腺癌、胆管癌、黑素瘤、间皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、肉瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质母细胞瘤、白血病或癌症的转移性、难治性或复发性病灶。

本发明取得的有益效果：

本发明提供了高效结合人TIGIT的抗体或抗原结合片段，本发明抗体能特异性阻断TIGIT与CD155的相互作用，抑制肿瘤的生长，具有抗肿瘤活性。

术语

为容易地理解本发明，首先定义本文中使用的某些术语。

术语“TIGIT”是一种I型跨膜蛋白，具有Ig样结构域。该术语包括变体、异体、同源物、直向同源物和平行同源物。例如，对人TIGIT特异的抗体可以在某些情况下与另一物种例如猴的TIGIT蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人TIGIT蛋白特异的抗体可以完全地对人TIGIT蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的TIGIT蛋白交叉反应。

术语“交叉反应”是指本文所述的抗体结合来自不同物种的TIGIT的能力。例如，本文所述的结合人TIGIT的抗体还可结合来自其它物种的TIGIT(例如，食蟹猴TIGIT)。交叉反应性可通过检测在结合测定法(例如，SPR、ELISA)中与纯化抗原的特定反应性，或与生理表达TIGIT的细胞的结合或以其它方式与生理表达TIGIT的细胞功能相互作用来测量。测定交叉反应性的方法包括本文所述的方法以及本领域已知的标准结合测定法，例如通过使用

本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。

本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即Kabat定义和Chothia定义，例如参见见Kabat etal,“Seq uen ces ofPro teinsofImmunological Interest”，National Institutes of Health,Bethesda，MD.(1991)；Al-Lazikanietal.，JMolBiol273:927-948(1997)；以及Martinetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中的CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。在本文中，重链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为HCDR1、HCDR2及HCDR3；轻链可变区的CDR1、CDR2及CDR3分别简称为LCDR1、LCDR2及LCDR3。

“特异性结合”是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体与抗原表位的结合，例如抗体以比其对非特异性抗原的亲和性大至少两倍的亲和性结合于特异性抗原的能力。然而应了解，抗体能够特异性结合于两种或更多其序列相关的抗原。例如，本发明的抗体可特异性结合于人类与非人类(例如小鼠或非人类灵长动物)的TIGIT。

本文所用的术语“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，与TIGIT蛋白特异结合的分离抗体基本不含特异结合TIGIT蛋白之外抗原的抗体。但是，特异结合人TIGIT蛋白的分离抗体可能对其他抗原例如其他物种的TIGIT蛋白具有交叉结合性。此外，分离的抗体基本不含其他细胞材料和/或化学物质。

术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。

术语“小鼠源抗体”是指可变区框架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，其也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本发明的鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变。然而，术语“鼠源抗体”不包括在小鼠框架序列中插入得自其他哺乳动物物种的CDR序列的抗体。

术语“嵌合抗体”是指其中可变区源自一个物种和恒定区源自另一个物种的抗体，例如其中可变区源自小鼠抗体和恒定区源自人抗体的抗体。

术语“人源化抗体”是指利用重组DNA技术，将来自一个物种(如小鼠)的单克隆抗体的恒定区和可变区的非CDR(Fv骨架区(FR))氨基酸序列全部替换为来自另一个物种(如人)的抗体的恒定区和可变区的非CDR氨基酸序列而获得的重组抗体。也即，一个抗体的恒定区被人源化时称为嵌合抗体，而恒定区和可变区的非CDR氨基酸序列全部人源化后称为人源化抗体。人源化的方法可以参照常规的抗体工程技术进行，在此不再赘述。

术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而术语“Kdis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的离解速率。术语“KD”是指平衡解离常数，由Kd与Ka比(Kd/Ka)得到，并以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可以通过领域内已知的方法确定。确定抗体KD的方法包括使用表面等离子共振仪(SPR)测得的，优选使用生物传感系统例如BiacoreTM系统测得；生物层干涉(BLI)分析，优选地使用Fortebio Octet RED装置；或流式细胞术和Scatchard分析。

术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指引起反应的抗体或其抗原结合片段的浓度，所述反应是最大反应的50％，即最大反应和基线之间的一半。

半数最大抑制浓度(IC50)是物质(例如抗体)抑制特定生物或生物化学功能的有效性的量度。它表明需要多少特定药物或其它物质(抑制剂，例如抗体)来抑制特定的生物过程(例如，TIGIT与CD155，或过程的组分即酶、细胞、细胞受体或微生物之间的结合)达一半。IC50或EC50可以通过生物测定来测量，例如通过FACS分析(竞争结合测定)配体结合的抑制、基于细胞的细胞因子释放测定或扩增的发光邻近均相测定(AlphaLISA)。

术语“受试者”是指接受预防性或治疗性的任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。

术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状和/或减轻疾病严重程度的本发明抗体量。治疗有效量与被治疗的疾病相关，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际的有效量。

术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中可以与术语“特异结合抗原的抗体”互换使用。

“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变的一种抗体，所述一个或多个改变导致与不拥有一个或多个那些改变的亲本抗体相比抗体对抗原的亲和力得到改善。在一些实施方案中，亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的程序产生。例如，Marks等人，Bio/Technology10:779-783(1992)描述了通过VH-和VL-结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变被例如以下参考文献所描述：Barbas等人Proc Nat’l.Acad.Sci.USA91:3809-3813(1994)；Schier等人Gene 169:147-155(1995)；Yelton等人J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等人,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和Hawkins等人,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。

附图说明

图1huTIGIT-CHO、cynoTIGIT-CHO细胞株构建成功验证实验

图2嵌合抗体与huTIGIT-CHO结合活性检测-1

图3嵌合抗体与huTIGIT-CHO结合活性检测-2

图4嵌合抗体与huTIGIT-CHO结合活性检测-3

图5嵌合抗体与cynoTIGIT-CHO结合活性检测-1

图6嵌合抗体与cynoTIGIT-CHO结合活性检测-2

图7嵌合抗体与cynoTIGIT-CHO结合活性检测-3

图8候选抗体阻断TIGIT与CD155的结合活性检测-1

图9候选抗体阻断TIGIT与CD155的结合活性检测-2

图10人源化抗体与huTIGIT-CHO结合活性检测-1

图11人源化抗体与huTIGIT-CHO结合活性检测-2

图12人源化抗体与huTIGIT-CHO结合活性检测-3

图13人源化抗体与huTIGIT-CHO结合活性检测-4

图14人源化抗体与huTIGIT-CHO结合活性检测-5

图15人源化抗体与cynoTIGIT-CHO结合活性检测-1

图16人源化抗体与cynoTIGIT-CHO结合活性检测-2

图17人源化抗体阻断TIGIT与CD155的结合活性检测-1

图18人源化抗体阻断TIGIT与CD155的结合活性检测-2

图19人源化抗体阻断TIGIT与CD155的结合活性检测-3

图20亲和力成熟抗体与huTIGIT-CHO结合活性检测-1

图21亲和力成熟抗体与cynoTIGIT-CHO结合活性检测-1

图22亲和力成熟抗体与huTIGIT-CHO结合活性检测-2

图23亲和力成熟抗体与cynoTIGIT-CHO结合活性检测-2

图24亲和力成熟抗体阻断TIGIT与CD155的结合活性检测-1

图25亲和力成熟抗体阻断TIGIT与CD155的结合活性检测-2

图26亲和力成熟抗体阻断TIGIT与CD155的结合活性检测-3

图27亲和力成熟抗体阻断TIGIT与CD155的结合活性检测-4

图28 P2-2

图29 SY15-84-231抗体功能检测

图30 SY15-84-231和P2-2

图31 SY15-84-231和P2-2

具体实施方式

实施例1原材料的制备

在本实施例中，TIGIT抗原及其配体均购自ACRO Biosystems，同时，根据专利(CN108290946A)制备了Genentech公司的阳性抗体Tiragolumab。

1.1抗原的准备

本申请中用到的抗原如下：human-TIGIT-mFc、cyno-TIGIT-Fc、human-TIGIT-his和cyno-TIGIT-His，均购买于ACRO Biosystems，货号分别为TIT-H5253、TIT-C5254、TIT-H52H3和TIT-C5223。

1.2配体的准备

本申请中使用的配体为human-CD155-Fc，购买于ACRO Biosystems，货号为CD5-H5251。

1.3阳性对照抗体的制备

本申请中，阳性对照抗体Tiragolumab采用瞬转系统(ExpiCHO)进行表达，其中，用到的主要材料包括：Gibco培养基，Gibco转染试剂盒。首先，根据专利CN108290946A披露的序列合成Tiragolumab的轻链序列和重链序列，通过分子克隆方法构建出包含完整Tiragolumab抗体轻链和重链基因的质粒。将含有Tiragolumab抗体轻链的质粒和重链的质粒按照2:1的质量比进行混合，在25mL表达体系内，按照标准流程将上述质粒混合物(25μg)与转染试剂进行混合并滴加入25mL的ExpiCHO细胞表达体系中。充分混匀后，于37℃细胞培养箱内表达18-22h。随后，向上述转染混合物中添加补料培养基并置于32℃细胞培养箱内继续培养。转染后第5天，添加第二次补料，并将细胞置于32℃细胞培养箱内继续培养10-12天。接着，将表达好的细胞混悬液进行高速离心并取上清，所得上清经0.22μm滤膜过滤后，采用Protein A亲和层析柱亲和法进行纯化。纯化后，用100mM甘氨酸盐(pH3.0)洗脱目的蛋白，浓缩，置换，分装，经SDS-PAGE鉴定和活性鉴定后入库冻存。Tiragolumab重轻链氨基酸序列如SEQ IDNO：94、95所示。

实施例2细胞株的制备

在本实施例中，分别构建了过表达人TIGIT的huTIGIT-CHO细胞株和过表达猴TIGIT的cynoTIGIT-CHO细胞株。

(1)huTIGIT-CHO和cynoTIGIT-CHO细胞株的制备

a、表达人和猴TIGIT全长的质粒的构建

根据人和猴的氨基酸序列，通过基因合成技术分别合成含有人和食蟹猴的TIGIT全长蛋白的DNA片段，并将其克隆至表达载体。通过转化的方法导入大肠杆菌，挑取大肠杆菌单克隆后测序得到正确的质粒克隆，进行质粒抽提并再次测序确认。其中，人的TIGIT的氨基酸序列如SEQ ID NO：96所示，食蟹猴的TIGIT的氨基酸序列如SEQ ID NO：97所示。

b、电转

使用Gibco的CD-CHO无血清培养基培养CHO-S细胞。电转前一天，将细胞传代至5×10

c、电转后细胞铺板

将电转后的CHO-S细胞按2000个细胞/孔铺到96孔板中，加入终浓度30μM MSX和GSsupplement，放置于37℃二氧化碳培养箱中培养，10天后补充加入含30μM MSX和1×GSsupplement的培养基。

d、克隆挑选、细胞扩培和FACS鉴定

挑取96孔板中长出的单细胞克隆，转移至24孔培养板中继续扩大培养，之后通过FACS方法，利用对照抗体Tiragolumab分别鉴定人和猴TIGIT稳转成功的细胞株。图1为FACS鉴定结果，结果显示，huTIGIT-CHO和cynoTIGIT-CHO分别高表达人和猴TIGIT蛋白，图中的hu-IgG为同种型对照抗体。

实施例3动物免疫

在本实施例中，动物免疫包括数种方案且同时进行，在免疫过程中，取小鼠血清进行效价检测并评估免疫的效果，最终根据血清效价决定建库的小鼠编号。

(1)动物免疫

通过皮下注射和腹腔注射的方式免疫Balb/c小鼠(雌性，6-8周)，材料包括上述提到的huTIGIT-mFc和cynoTIGIT-Fc抗原蛋白(ACRO Biosystems)，采用交叉免疫的方式。首次免疫剂量为100μg/只，并辅以CFA(完全弗氏佐剂)，之后免疫剂量降至50μg/只，并辅以IFA(弗式不完全佐剂)，均为两周一交叉免疫。并对小鼠进行编号。

(2)血清效价ELISA检测

a、抗原包被和封闭：在ELISA板上，提前一天分别包被huTIGIT-his和cynoTIGIT-his抗原，包被浓度为2μg/mL，30μL/孔，4℃过夜。在免疫效价测定当日，用PBST洗板三次，并用5％的脱脂牛奶室温封闭2h，再用PBST洗板三次。

b、一抗和二抗孵育：各个血清样本在原液的基础上先稀释500倍，再进行3倍梯度稀释后，作为一抗加到ELISA板中，室温下孵育1h，PBST洗板三次后，加入二抗，室温下孵育1h。

c、显色、终止和读板：孵育完成后，PBST洗板六次，加TMB显色，根据显色结果，加入2M HCl终止反应，通过酶标仪在OD450下读板。

d、选择对人TIGIT蛋白和猴TIGIT蛋白的效价均很高的免疫小鼠作为备用小鼠，用于下一步的抗体库构建。

实施例4候选抗体产生

(1)噬菌体展示抗体基因文库构建

在免疫结束后，按安乐死标准流程处理小鼠。取备用小鼠脾脏，经研磨和过滤后，收集脾细胞，加入1mL的TRIzol

(2)噬菌体展示抗体基因文库筛选

a、磁珠法筛选噬菌体展示抗体基因文库

磁珠法筛选是基于将Biotin标记的抗原蛋白和偶联有Avidin的磁珠结合，通过将结合抗原的磁珠和文库进行孵育、洗涤和洗脱的海选过程，经历2-4轮的海选，最终将针对抗原的特异性单克隆抗体富集下来的过程。本实施例中利用Biotin标记的人TIGIT抗原和猴TIGIT抗原交叉海选的原则，其中第一和第三轮采用人TIGIT海选，第二轮采用猴TIGIT海选，一共海选3轮，然后将富集的抗体序列混合物，进行人和猴抗原的单克隆初筛。

具体实施方法如下：

首先用Biotin标记的人TIGIT-mFc蛋白与Avidin偶联的磁珠孵育，使得人TIGIT-mFc蛋白结合到磁珠上。将结合有TIGIT-Fc-biotin抗原的磁珠和构建的噬菌体库室温下孵育2h。经PBST洗涤6-8次后，去除非特异性吸附的噬菌体，加入Trypsin轻轻混匀并反应20min，以洗脱特异性结合的抗体展示噬菌体。随后，用洗脱下来的噬菌体侵染对数期的SS320菌体并静置30min，然后在220rpm条件下培养1h，再加入VSCM13辅助噬菌体并静置30min，继续在220rpm条件下培养1h，最后离心并置换至氨苄青霉素和四环素的2×YT培养基中，最终得到的噬菌体继续用于下一轮的海选，二轮海选使用猴TIGIT-Fc-biotin蛋白，三轮海选继续使用人TIGIT-mFc-biotin，三轮海选结束则海选完成。

b、免疫管法筛选噬菌体展示抗体基因文库

免疫管筛选的原理是将人和猴TIGIT蛋白包被在具有高吸附力的免疫管表面，通过将噬菌体展示抗体文库加入免疫管中并和吸附于免疫管表面的抗原蛋白进行孵育、洗涤和洗脱的海选过程，经历2-4轮海选，最终将针对抗原的特异性单克隆抗体富集下来的过程。免疫管法和磁珠法的目的均为富集针对抗原的特异性抗体，为两个互补的实验方法。本实施例中以人TIGIT-his抗原和猴TIGIT-his抗原交叉海选的原则，其中第一和第三轮采用人抗原海选，第二轮采用猴抗原海选，一共海选3轮，然后将富集的抗体序列混合物，进行人和猴TIGIT-his的单克隆初筛。具体实施方法与磁珠法筛选类同。

(3)单克隆的挑选

在三轮筛选后，从第三轮的Pool中挑选部分单克隆进行ELISA检测，包括与人和猴TIGIT的结合。最终，在960个克隆中共挑到22个能够与人和猴TIGIT都结合的阳性克隆，经测序分析及与人和猴TIGIT亲和力排序结果分析后，最终选取了SY15-4、SY15-20、SY15-25、SY15-39、SY15-47、SY15-61、SY15-84、SY15-96以及SY15-P2-001、SY15-P2-003和SY15-P5-001共11个克隆，根据Kabat编码，抗体CDRs氨基酸序列信息见表1(SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：32)，轻重链可变区序列如表2(SEQ ID NO：33-SEQ ID NO：51)所示。

表1抗体CDRs氨基酸序列

表2抗体轻重链可变区氨基酸序列

实施例5嵌合抗体构建、表达与纯化

5.1质粒的构建

将获得的11个鼠源抗体的重链与轻链可变区基因分别与人IgG1的重链恒定区及κ轻链恒定区基因连接而成的。将得到的重链与轻链嵌合基因分别插入载体pCDNA3.4(Invitrogen，美国)，用以表达嵌合抗体。重链和轻链恒定区氨基酸分别对应SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53。

SEQ ID NO:52：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:53：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS

KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

5.2抗体的表达纯化

本申请中，抗体采用的是ExpiCHO瞬转表达系统。具体方法如下：转染前一天将ExpiCHO细胞进行传代，在25mL体系内，将构建好的质粒25μg与转染试剂混合之后滴加入25mL ExpiCHO细胞中，充分混匀后，于37℃细胞培养箱内表达18-22h。随后，向上述转染混合物中添加补料培养基并置于32℃细胞培养箱内继续培养。转染后第5天，添加第二次补料，并将细胞置于32℃细胞培养箱内继续培养10-12天。接着，将表达好的细胞混悬液进行高速离心并取上清，所得上清经0.22μm滤膜过滤后，采用ProteinA亲和层析柱亲和法进行纯化。纯化后，用100mM甘氨酸(pH3.0)洗脱目的蛋白，浓缩，置换，分装，经SDS-PAGE鉴定、SEC纯度检测、活性鉴定后入库冻存。

上述鼠源抗体的轻重链可变区与人源抗体的轻重链恒定区连接后形成的嵌合抗体，将鼠源SY15-4抗体对应的嵌合抗体命名为chSY15-4，其他抗体类推。以上嵌合抗体将作为进行人源化的候选抗体，并进行相关活性检测。

实施例6候选抗体与人/猴TIGIT过表达细胞株的亲和活性检测

在本实施例中，基于FACS方法验证候选抗体对表达人和猴TIGIT细胞的亲和活性。

6.1基于FACS检测候选抗体对huTIGIT-CHO细胞的亲和效果

收集指数生长期的huTIGIT-CHO细胞，300g离心去上清，将细胞用配制好的FACS缓冲液重悬，计数并将细胞悬液密度调整为2×10

表3候选抗体与huTIGIT-CHO结合的EC50值

6.2基于FACS检测候选抗体对猴TIGIT-CHO细胞的亲和效果

本实施例中，操作流程与6.1完全一致，与之不同的是，细胞为猴TIGIT-CHO细胞，其结果显示在表4、图5、图6、图7中，结果表明抗体chSY15-20、chSY15-47、chSY15-61、chSY15-84、chSY15-P2-001、chSY15-P2-003、chSY15-P5-001与猴TIGIT-CHO细胞交叉结合力明显强于阳性对照抗体Tiragolumab，chSY15-4、chSY15-25次之，chSY15-39和chSY15-96与猴TIGIT-CHO细胞的结合能力较差。

表4候选抗体与cynoTIGIT-CHO结合的EC50值

综合以上抗体对人/猴TIGIT-CHO细胞的亲和效果可见，SY15-84，SY15-P2-001、SY15-P5-001、SY15-61、SY15-47、SY15-P2-003、SY15-20结合人/猴TIGIT-CHO都很好，其中SY15-84，SY15-P2-001最优，其他次之。

实施例7候选抗体阻断效应检测

在本实施例中，利用检测抗体在人TIGIT-CHO细胞上阻断CD155蛋白结合TIGIT抗原的方法体系对候选抗体的阻断效应进行了相应检测，基本原理为通过FACS检测在有无候选抗体存在的情况下配体受体的结合，通过检测配体信号从而间接反映出候选抗体对CD155-TIGIT结合的阻断活性。

具体检测方法如下：收集指数生长期的人TIGIT-CHO细胞，300g离心去上清，将细胞用配制好的FACS缓冲液重悬，计数并将细胞悬液密度调整为2×10

在本实施例中，结果显示在表5、图8、图9中，结果表明，多数候选抗体的阻断效果优于阳性对照抗体Tiragolumab，其中chSY15-84和chSY15-P2-001的阻断效果显著优于阳性对照抗体Tiragolumab，其次为chSY15-20、chSY15-P2-003、chSY15-47和chSY15-61。

表5候选抗体阻断TIGIT与CD155的结合IC50值

实施例8抗体人源化改造

为了降低分子在体内的免疫原性，并根据结合/阻断实验数据以及抗体序列综合分析，选择SY15-P2-001和SY15-84两个抗体分子进行人源化改造。使用Discovery Studio，采用同源建模方法建模，选取5-10个最优结构解，Loop区域一般使用同源建模方法建模，如CDR氨基酸序列比对结果显示低于50％同一性，则使用从头建模方法搭建CDR3结构模型。使用PDB BLAST调取序列最接近的10个抗体晶体结构模型(结构分辨率高于2.5埃)，对比自动建模模型，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VH和VL的构象有重要影响的残基进行回复突变，选取最优的结构模型。人源化改造的候选抗体包括克隆SY15-P2-001和SY15-84号克隆，分别对抗体的轻重链可变区进行人源化，设计3条人源化序列(人源化程度依次增加)，其中人源化后的重链可变区分别为huVH1/huVH2/huVH3，人源化后的轻链可变区分别为huVL1/huVL2/huVL3，并以此命名得到的抗体，如SY15-84经人源化后得到重链可变区huVH1与轻链可变区huVL1，那么抗体SY15-84可变区经此人源化重组得到的抗体可命名为SY15-84-huVH1+huVL1，其他以此类推。抗体人源化后可变区氨基酸序列见表6中SEQID NO:54-SEQ ID NO:66，组合后采用expi-CHO瞬转体系进行表达，瞬转表达具体方法详见实施例5。

表6人源化抗体轻重链可变区氨基酸序列

SY15-P2-001人源化后得到三种重链可变区，根据Kabat编码，其HCDRs氨基酸序列如下两组所示：

(1)人源化分子SY15-P2-001-huVH1和SY15-P2-001-huVH2：

SEQ ID NO：7 HCDR1: SYVMS

SEQ ID NO：17 HCDR2: QGTTAPYYFDY

SEQ ID NO：18 HCDR3: QGTTAPYYFDY

(2)人源化分子SY15-P2-001-huVH3：

SEQ ID NO：7 HCDR1: SYVMS

SEQ ID NO：81 HCDR2: SIISDNYGYYPDSVKG

SEQ ID NO：18 HCDR3: QGTTAPYYFDY

SY15-P2-001人源化后得到三种轻链可变区，根据Kabat编码，其LCDRs氨基酸序列如下两组所示：

(1)人源化分子SY15-P2-001-huVL1：

SEQ ID NO：82 LCDR1: RASSSVSYMH

SEQ ID NO：23 LCDR2: DTSKLAS

SEQ ID NO：28 LCDR3: QQWSSNPFT

(2)人源化分子SY15-P2-001-huVL2和SY15-P2-001-huVL3：

SEQ ID NO：82 LCDR1: RASSSVSYMH

SEQ ID NO：83 LCDR2: DTSKLAT

SEQ ID NO：28 LCDR3: QQWSSNPFTSY15-84人源化后得到三种重链可变区，根据Kabat编码，其HCDRs氨基酸序列相同，如下所示：

(1)人源化分子SY15-84-huVH1、SY15-84-huVH2和SY15-84-huVH3：

SEQ ID NO：4 HCDR1: SDYAWN

SEQ ID NO：14 HCDR2: YISYRGSTRYNPSLKS

SEQ ID NO：6 HCDR3: GHYGNYGGAMDY

SY15-84人源化后得到三种轻链可变区，根据Kabat编码，其LCDRs氨基酸序列如下两组所示：

(1)人源化分子SY15-84-huVL1和SY15-84-huVL2：

SEQ ID NO：85 LCDR1: RASQDVSTAVA

SEQ ID NO：26 LCDR2: SASYRYT

SEQ ID NO：30 LCDR3: QQHYSTPFT

(2)人源化分子SY15-84-huVL3：

SEQ ID NO：85 LCDR1: RASQDVSTAVA

SEQ ID NO：86 LCDR2: SASYRYS

SEQ ID NO：30 LCDR3: QQHYSTPFT

实施例9人源化抗体功能验证

9.1基于FACS检测候选抗体对人TIGIT-CHO细胞的结合效果

具体操作参见实施例6，实验结果见图10、图11、图12、图13、图14、表7，结果表明，候选抗体人源化改造后与人TIGIT-CHO细胞结合效果均优于Tiragolumab，其中SY15-84-huVH2+huVL3和SY15-P2-001-huVH3+huVL3与人TIGIT-CHO细胞结合效果最佳，显著优于阳性对照抗体Tiragolumab，其他次之。

表7人源化抗体与huTIGIT-CHO结合的EC50值

9.2基于FACS检测候选抗体对猴TIGIT-CHO细胞的亲和效果

具体操作参见实施例6，结果见图15、图16、表8，结果表明，人源化后抗体SY15-84-huVH1+huVL1、SY15-84-huVH2+huVL2和SY15-84-huVH3+huVL3与猴TIGIT-CHO细胞结合能力弱于chSY15-84；SY15-84-huVH2+huVL3和SY15-84-huVH3+huVL2好于对照，SY15-84-huVH2+huVL3结合效果最佳。

SY15-P2-001人源化改造后的三种抗体与猴TIGIT-CHO细胞结合效果均好于chSY15-P2-001，且均优于阳性对照抗体tiragolumab。

综合与人/猴TIGIT-CHO细胞结合结果，可以看出人源化后的SY15-84-huVH2+huVL3和SY15-P2-001-huVH3+huVL3与人/猴TIGIT-CHO细胞结合效果最佳。

表8 SY15-84人源化后抗体与cynoTIGIT-CHO结合的EC50值

9.3基于FACS检测候选抗体对CD155结合TIGIT的阻断效果

具体操作参见实施例7，结果见表9、表10、图17、图18和图19。如表9和图17所示，SY15-84-huVH2+huVL2、SY15-84-huVH2+huVL3、SY15-84-huVH3+huVL3阻断效果均优于chSY15-84和tiragolumab，其中SY15-84-huVH2+huVL3阻断TIGIT与CD155结合的效果最佳，其他次之。

表9人源化抗体阻断TIGIT结合CD155的IC50值

由表10、图18和图19可知SY15-P2-001人源化抗体的阻断效果均优于chSY15-P2-001和tiragolumab，其中SY15-P2-001-huVH3+huVL3阻断TIGIT与CD155结合的能力最强，其他次之。

表10人源化抗体阻断TIGIT结合CD155的IC50值

实施例10候选抗体亲和力成熟

根据人源化程度和功能实验结果，选择SY15-84-huVH2+huVL3(命名为SY15-84-23)和SY15-P2-001-huVH3+huVL3(命名为SY15-P2-001-33)作为最终分子，同时进行点突变后构建噬菌体抗体库，分别以人-TIGIT和猴-TIGIT抗原进行亲和力成熟筛选。

首先，我们采用生物信息学的方法对SY15-84-23抗体的6个CDR区和SY15-P2-001-33的6个CDR区按Kabat数据库进行定义，参照相同类别下已知抗体的序列设计饱和突变，将序列多样性直接针对那些最可能与抗原接触的残基，鉴定出保守性弱的残基，这些残基即为优选的突变位点。这样就保证了突变设计的合理性，避免随机突变导致的抗体结合抗原表位的变化，维持了抗体的稳定性，提高亲和力成熟抗体库的有效库容的同时，大大减少了冗余序列。软件分析发现，SY15-84-23和SY15-P2-001-33的重链CDR与抗原接触位点相对较保守，亲和力成熟设计中保持VH区不变；轻链的CDR含有保守性较弱的残基，下表11中加粗斜体部分是优选的轻链CDR区氨基酸突变位点。

表11 SY15-84-23和SY15-P2-001-33优选的氨基酸突变位点

将设计好的SY15-84-23轻链可变区的突变序列引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。进一步，以SY15-84-23为模板，使用TransStart KD Plus PCR SuperMix聚合酶反应体系，通过重叠拼接PCR的方法分别扩增突变部分，用实施例4.1中构建噬菌体抗体库的方法，快速有效地构建了突变CDR区组合的亲和力成熟抗体文库，此ScFV亲和力成熟噬菌体抗体库为一级库。

以本领域熟知的方法，对突变CDR区的组合文库使用不同浓度梯度的huTIGIT-His-bio抗原，进行了多轮液相筛选，淘筛到的克隆用原核表达的可溶性抗体ELISA判定相对亲和力。对亲和力高于SY15-84-23的优选克隆进行序列分析，从而获得每个CDR区对亲和力提高或者维持有意义的突变序列信息，并以上述筛选到的克隆作为模板，分别扩增相应的CDR-L1+CDR-L2，CDR-L3，与SY15-84-23的VH，进行体外重组，获得轻链CDR突变体与VH组成的二级抗体库。针对二级库使用更低浓度的抗原进行了多轮液相筛选和富集，淘筛到的克隆用原核表达的可溶性抗体ELISA判定相对亲和力，得到若干亲和力提高的多CDR突变的ScFV抗体。获得了3个可能优于SY15-84-23的克隆，抗体重链可变区和轻链可变区分别与重链和轻链恒定区连接后构建全长抗体，分别命名为SY15-84-231、SY15-84-232和SY15-84-233，转入真核表达系统，质粒构建以及抗体表达与纯化方法参见实施例5。

利用同样方法对SY15-P2-001-33进行亲和力成熟改造筛选，获得了4个可能优于母本的克隆，分别命名为P2-2

所有构建均进行测序鉴定，SY15-84-231、SY15-84-232和SY15-84-233的重链可变区同SY15-84-23的重链可变区序列，如SEQ ID NO：55所示，轻链可变区分别如SEQ ID NO：66-SEQ ID NO：68所示；P2-2

表12亲和力成熟抗体轻链可变区氨基酸序列

根据Kabat编码，SY15-P2-001-huVH3+huVL3(SY15-P2-001-33)经亲和力成熟筛选后具有如下所示氨基酸序列：

SY15-P2-001-33经亲和力成熟筛选后得到的四种重链可变区的HCDRs氨基酸序列相同，具体如下所示：

SEQ ID NO：7 HCDR1: SYVMS

SEQ ID NO：81 HCDR2: SIISDNYGYYPDSVKG

SEQ ID NO：18 HCDR3: QGTTAPYYFDY

SY15-P2-001-33经亲和力成熟筛选后得到的四种轻链可变区的LCDRs氨基酸序列具体如下所示：

亲和力成熟分子P2-2

SEQ ID NO：82 LCDR1: RASSSVSYMH

SEQ ID NO：83 LCDR2: DTSKLAT

SEQ ID NO：84 LCDR3: QQWSGNPFT

亲和力成熟分子P2-2

SEQ ID NO：82 LCDR1: RASSSVSYMH

SEQ ID NO：83 LCDR2: DTSKLAT

SEQ ID NO：88 LCDR3: GQWSSNPFT

亲和力成熟分子P2-2

SEQ ID NO：89 LCDR1: RASASVSYMH

SEQ ID NO：83 LCDR2: DTSKLAT

SEQ ID NO：90 LCDR3: QQWTGNPFT

亲和力成熟分子P2-2

SEQ ID NO：82 LCDR1: RASSSVSYMH

SEQ ID NO：83 LCDR2: DTSKLAT

SEQ ID NO：91 LCDR3: QEWSSNPFT

根据Kabat编码，SY15-84-huVH2+huVL3(SY15-84-23)经亲和力成熟筛选后具有如下所示氨基酸序列：

SY15-84-23经亲和力成熟筛选后得到的三种重链可变区的HCDRs氨基酸序列相同，具体如下所示：

SEQ ID NO：4 HCDR1: SDYAWN

SEQ ID NO：14 HCDR2: YISYRGSTRYNPSLKS

SEQ ID NO：6 HCDR3: GHYGNYGGAMDY

SY15-84-23经亲和力成熟筛选后得到的三种轻链可变区的LCDRs氨基酸序列具体如下所示：亲和力成熟分子84-23-VL

SEQ ID NO：85 LCDR1: RASQDVSTAVA

SEQ ID NO：86 LCDR2: SASYRYS

SEQ ID NO：87 LCDR2: QQHYSTYWT

亲和力成熟分子84-24-VL

SEQ ID NO：85 LCDR1: RASQDVSTAVA

SEQ ID NO：86 LCDR2: SASYRYS

SEQ ID NO：92 LCDR3: QQHYSTVWT

亲和力成熟分子84-25-VL

SEQ ID NO：85 LCDR1: RASQDVSTAVA

SEQ ID NO：86 LCDR2: SASYRYS

SEQ ID NO：93 LCDR3: QQHYSTNWT

利用FACS实验对上述获得的真核表达的单抗进行与表达人或猴TIGIT的CHO细胞结合活性和阻断效果检测，具体参照实施例6和7进行。SY15-84-231、SY15-84-232和SY15-84-233与hu/cynoTIGIT-CHO的结合活性分别如表13、图20和图21所示；由结果可见SY15-84-23分子进行亲和力成熟后与cynoTIGIT-CHO的结合活性显著提高，结合强度远高于亲和力成熟之前，其中SY15-84-231与人/猴-TIGIT的结合效果与SY15-84-23相比显著提高。

P2-2

表14、图24、图25、图26、图27显示了亲和力成熟后抗体SY15-84-231、SY15-84-232、SY15-84-233、P2-2

表13亲和力成熟后抗体与人/猴-TIGIT结合的EC50值

表14亲和力成熟后抗体阻断TIGIT结合CD155的IC50值

实施例11亲和力成熟后候选抗体功能活性检测

在本实施例中，检测了SY15-84-231(见SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:53，即重链氨基酸序列为SEQ ID NO:73，轻链序列为SEQ ID NO:74所示；重轻链核苷酸序列分别如SEQ ID NO:77、78)和P2-2

通过萤光素酶信号的强度来评价Jurkat/NFAT报告基因/TIGIT/CD226细胞的激活。在两种细胞之间CD155对TIGIT的结合抑制了Jurkat/NFAT报告基因/TIGIT/CD226细胞激活。抗人TIGIT单克隆抗体阻断了CD155与TIGIT之间的相互作用，然后中和了CD155对TIGIT的抑制。添加的抗体越多，激活的Jurkat/NFAT报告基因/TIGIT/CD226细胞越多，萤光素酶信号越多。通过PRISMTM(GraphPad软件，San Diego,CA)使用非线性回归来分析数据，并且对归一化的萤光素酶信号计算EC50值。

结果见表15、图28、图29，结果显示亲和力成熟后的人源化后抗体SY15-84-231和P2-2

表15亲和力成熟抗体活性检测

SY15-84-231重链氨基酸序列(SEQ ID NO：73)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWMGYISYRGSTRYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVGGHYGNYGGAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SY15-84-231轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：74)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSVQPEDFATYYCQQHYSTYWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

P2-2nd-001重链氨基酸(SEQ ID NO：75)

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNSYVMSWVRQAPGKGLEWVASIISDNYGYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQINSLRAEDTAVYYCARQGTTAPYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

P2-2nd-001轻链氨基酸(SEQ ID NO：76)

EIVLTQSPATLSLSPGERATMSCRASSSVSYMHWYQQKPGQAPRRLIYDTSKLATGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSGNPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

实施例12 P2-2

选取7～8周龄的雌性BALB/c-hPD1/hTIGIT小鼠，收集对数生长期的CT26.WT细胞，接种于小鼠右后肢，接种量为5×10

P2-2

序列表

<110> 山东新时代药业有限公司

<120> 抗TIGIT抗体

<130> 2021

<160> 97

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Phe Val Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Ile Thr Ser Asp Gly Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Gly Pro Thr Ala Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ser Asp Tyr Ala Trp Asn

1 5

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly His Tyr Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ser Tyr Val Met Ser

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ser Ile Thr Ser Gly Asp Asn Asn Thr Tyr Leu Pro Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gln Gly Ser Thr Ala Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ser Ile Ile Ser Asp Asn Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Gln Gly

1 5 10 15

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Pro Gly Phe Thr Ala Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Tyr Ile Ser Tyr Arg Gly Ser Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 15

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ser Asp Tyr Gly Trp Asn

1 5

<210> 16

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Tyr Ile Ser Tyr Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Ser Ile Ile Ser Asp Asn Tyr Gly Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Gln Gly Thr Thr Ala Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Glu Tyr Thr Met Tyr

1 5

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Gly Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Gly Ser Tyr Arg His Phe Ser Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Tyr Thr

1 5

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

1 5

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Gln Gln His Tyr Gly Thr Pro Trp Thr

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr

1 5

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro His Thr

1 5

<210> 33

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Thr Ser Asp Gly Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gln Gly Pro Thr Ala Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Gly Gly His Tyr Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 35

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Thr Ser Gly Asp Asn Asn Thr Tyr Leu Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gln Gly Ser Thr Ala Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly His

100 105 110

Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 36

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Gly Gly His Tyr Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 37

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ile Ser Asp Asn Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Gln

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gln Gly Ser Thr Ala Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 38

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Gly Phe Thr Ala Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 39

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Arg Gly Ser Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Gly Gly His Tyr Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 40

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Asn Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Gly Trp Asn Trp Ile Arg Gln Tyr Thr Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Arg Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Gly Gly His Tyr Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 41

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ile Ser Asp Asn Tyr Gly Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

His Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gln Gly Thr Thr Ala Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

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Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

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Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val

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Ala Ser Ile Ile Ser Asp Asn Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Gln

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gln Gly Ser Thr Ala Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

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Thr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

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Gly Gly Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Tyr Arg His Phe Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

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His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

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Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

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Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

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Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe

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50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

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65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro His

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65 70 75 80

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Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

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100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro

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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 63

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Met Ser Ala Ser Pro Gly

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Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

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Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 64

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

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Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 65

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

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Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

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Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 66

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Tyr Trp

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 67

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

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<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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20 25 30

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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 71

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ala Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Gly Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 72

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 73

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Arg Gly Ser Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Gly Gly His Tyr Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 74

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Tyr Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 75

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ile Ser Asp Asn Tyr Gly Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gln Gly Thr Thr Ala Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 76

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Arg Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 77

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

caggtgcagc tgcaggagtc tggcccaggc ctggtgaagc cctctcagac cctgtccctg 60

acctgcacag tgtctggcta ctccatcaca agcgactatg cttggaactg gatcaggcag 120

ccacctggca agggcctgga gtggatgggc tacatcagct ataggggctc tacccggtac 180

aacccatctc tgaagtccag aatcaccatc tcccgcgaca caagcaagaa tcagttctcc 240

ctgaagctgt ccagcgtgac cgccgctgat acagccgtgt actattgcgt gggcggccac 300

tacggcaatt atggaggagc tatggactac tggggacagg gaaccacagt gaccgtgtct 360

tccgcctcta caaagggccc ctccgtgttt cctctggctc caagctctaa gagcacctct 420

ggaggaacag ccgctctggg atgtctggtg aaggattatt tccctgagcc agtgaccgtg 480

agctggaact ctggcgccct gacctccgga gtgcatacat ttcccgctgt gctgcagtcc 540

agcggcctgt acagcctgtc ttccgtggtg accgtgccta gctcttccct gggcacccag 600

acatatatct gcaacgtgaa tcacaagccc tccaatacaa aggtggacaa gaaggtggag 660

cctaagagct gtgataagac ccatacatgc ccaccatgtc cagctcctga gctgctggga 720

ggaccttccg tgttcctgtt tcctccaaag ccaaaggaca ccctgatgat ctctaggacc 780

cctgaggtga catgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg atccagaggt gaagtttaac 840

tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat gctaagacca agcctaggga ggagcagtac 900

aacagcacct atcgggtggt gtctgtgctg acagtgctgc accaggattg gctgaacggc 960

aaggagtata agtgcaaggt gagcaataag gccctgccag ctcccatcga gaagaccatc 1020

tctaaggcca agggccagcc cagagagcct caggtgtaca cactgccccc tagccgcgag 1080

gagatgacca agaaccaggt gtctctgaca tgtctggtga agggcttcta tccatctgac 1140

atcgctgtgg agtgggagtc caatggccag cccgagaaca attacaagac cacaccaccc 1200

gtgctggact ccgatggcag cttctttctg tattccaagc tgaccgtgga taagagcagg 1260

tggcagcagg gcaacgtgtt ttcctgtagc gtgatgcatg aggctctgca caatcattac 1320

acacagaagt ctctgtccct gagcccaggc aag 1353

<210> 78

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

gatatccaga tgacacagtc cccttccagc ctgtctgcct ccgtgggcga cagggtgacc 60

atcacatgtc gggcttccca ggatgtgagc acagccgtgg cttggtacca gcagaagcca 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctattcc gcctcttaca gatattctgg agtgccttcc 180

cgcttctccg gaagcggatc tggaaccgac ttcaccttta caatctcttc cgtgcagcca 240

gaggatttcg ccacatacta ttgccagcag cactactcca cctattggac atttggccag 300

ggcaccaagc tggagatcaa gaggacagtg gccgctccat ccgtgttcat ctttccccct 360

agcgacgagc agctgaagag cggcaccgct tctgtggtgt gcctgctgaa caatttctac 420

ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgctc tgcagtccgg caatagccag 480

gagtctgtga ccgagcagga ctccaaggat agcacatatt ctctgagctc taccctgaca 540

ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtatgctt gcgaggtgac ccatcagggc 600

ctgtccagcc ccgtgacaaa gtcttttaac cgcggcgagt gt 642

<210> 79

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

gaggtgcagc tggtggagtc tggaggagga ctggtgaagc ctggaggctc cctgaggctg 60

agctgcgccg cttctggctt cacctttaac tcctacgtga tgagctgggt gcggcaggct 120

cctggcaagg gcctggagtg ggtggcttcc atcatcagcg acaattacgg ctactatcca 180

gattccgtga agggcaggtt taccatctcc cgggacaacg ccaagaatag cctgtatctg 240

cagatcaact ctctgagggc cgaggataca gccgtgtact attgcgctag gcagggaacc 300

acagctccat actatttcga ctactggggc cagggcacca cagtgaccgt gtccagcgcc 360

tctacaaagg gcccttccgt gtttccactg gctccctctt ccaagtctac ctccggagga 420

acagccgctc tgggatgtct ggtgaaggat tatttcccag agcccgtgac cgtgtcttgg 480

aactccggcg ccctgacctc cggagtgcat acatttccag ctgtgctgca gagctctggc 540

ctgtacagcc tgtccagcgt ggtgaccgtg ccctcttcca gcctgggcac ccagacatat 600

atctgcaacg tgaatcacaa gccatccaat acaaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 660

agctgtgata agacccatac atgcccccct tgtcctgctc cagagctgct gggaggacca 720

agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaag gacaccctga tgatctccag gacccccgag 780

gtgacatgcg tggtggtgga cgtgtcccac gaggatcctg aggtgaagtt caactggtac 840

gtggatggcg tggaggtgca taatgctaag accaagccaa gagaggagca gtacaatagc 900

acctatcgcg tggtgtctgt gctgacagtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960

tataagtgca aggtgagcaa taaggccctg cccgctccta tcgagaagac catctctaag 1020

gccaagggcc agcctagaga gccacaggtg tacacactgc ctccaagccg cgaggagatg 1080

accaagaacc aggtgtctct gacatgtctg gtgaagggct tctatccttc tgacatcgct 1140

gtggagtggg agtccaatgg ccagccagag aacaattaca agaccacacc ccctgtgctg 1200

gacagcgatg gctctttctt tctgtattcc aagctgaccg tggataagag ccgctggcag 1260

cagggcaacg tgtttagctg ttctgtgatg catgaggctc tgcacaatca ttacacacag 1320

aagtccctga gcctgtctcc cggcaag 1347

<210> 80

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

gagatcgtgc tgacccagtc ccctgctaca ctgtccctga gcccaggcga gagagccacc 60

atgtcctgtc gcgcttccag ctctgtgagc tacatgcact ggtatcagca gaagccagga 120

caggctccaa ggcggctgat ctacgatacc tccaagctgg ccacaggcat cccagctcgc 180

ttctctggat ccggaagcgg aaccgactat accctgacaa tctccagcct ggagcccgag 240

gattttgccg tgtactattg ccagcagtgg agcggcaacc ctttcacctt tggccagggc 300

acaaagctgg agatcaagag gaccgtggcc gctccaagcg tgttcatctt tcccccttct 360

gacgagcagc tgaagtctgg cacagcctcc gtggtgtgcc tgctgaacaa tttctacccc 420

cgggaggcca aggtgcagtg gaaggtggat aacgctctgc agtctggcaa ttcccaggag 480

agcgtgaccg agcaggactc taaggattcc acatatagcc tgtcttccac cctgacactg 540

agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tatgcttgcg aggtgaccca tcagggcctg 600

agctctcccg tgacaaagtc ttttaatagg ggcgagtgt 639

<210> 81

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

Ser Ile Ile Ser Asp Asn Tyr Gly Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 82

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 83

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Thr

1 5

<210> 84

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Phe Thr

1 5

<210> 85

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 86

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser

1 5

<210> 87

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

Gln Gln His Tyr Ser Thr Tyr Trp Thr

1 5

<210> 88

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

Gly Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

1 5

<210> 89

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

Arg Ala Ser Ala Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 90

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

Gln Gln Trp Thr Gly Asn Pro Phe Thr

1 5

<210> 91

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

Gln Glu Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

1 5

<210> 92

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

Gln Gln His Tyr Ser Thr Val Trp Thr

1 5

<210> 93

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

Gln Gln His Tyr Ser Thr Asn Trp Thr

1 5

<210> 94

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Lys Thr Tyr Tyr Arg Phe Lys Trp Tyr Ser Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Phe Tyr Cys Thr Arg Glu Ser Thr Thr Tyr Asp Leu Leu Ala Gly Pro

100 105 110

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

325 330 335

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

340 345 350

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

355 360 365

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

370 375 380

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 95

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Thr Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Asn Lys Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 96

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala

1 5 10 15

Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn

20 25 30

Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser

35 40 45

Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln

50 55 60

Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser

65 70 75 80

Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln

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Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr

100 105 110

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Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly

130 135 140

Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val

145 150 155 160

Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu

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Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala

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210 215 220

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

Met Ala Phe Leu Val Ala Pro Pro Met Gln Phe Val Tyr Leu Leu Lys

1 5 10 15

Thr Leu Cys Val Phe Asn Met Val Phe Ala Lys Pro Gly Phe Ser Glu

20 25 30

Thr Val Phe Ser His Arg Leu Ser Phe Thr Val Leu Ser Ala Val Gly

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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130 135 140

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165 170 175

Thr Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Arg Gly Arg Ile Phe Leu

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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305 310