6-甲氧基当归素及其结构类似物的用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种6-甲氧基当归素及其结构类似物在制备用于预防和/或治疗原发性或继发性骨质疏松和/或骨丢失相关疾病产品中的应用。

背景技术

骨质疏松是以随着年龄增长及女性绝经后雌激素水平降低而出现的骨量减少导致骨骼脆性增加，易于发生骨折的一种退行性骨骼疾病。其中骨矿物量(BMC)和骨密度(BMD)下降与骨强度降低具有相关性，使患者易于发生骨折，因此可以通过骨密度测定判断骨质疏松的程度。该病女性多于男性，对于女性，从绝经期开始5～10年内，骨质吸收明显，促使骨质流失而出现骨质疏松症状，患者主要表现腰背酸痛，负荷增加时疼痛加重及活动受限，严重者可出现脊柱变形及脆性骨折。此外，如长期卧床或太空飞行等导致骨骼承受的应力减少，骨量降低，由于机械负重减少或消失引起的力学废用性骨质疏松症也引起了越来越多的关注，主要原因是由于骨骼缺乏负重、肌肉活动等刺激，使骨质吸收增加。患者多因运动固定而至椎骨密度降低，骨小梁结构破坏等症状，严重者会出现骨组织结构退化及颈腰瘫痪。骨质疏松本身可降低患者生活质量、脊柱变形、骨折致残，使患者活动受限，患者死亡率增加，也给家庭社会带来经济负担。随着我国老年人口的增加，骨质疏松发病率处于上升趋势，成为一个受到密切关注的健康问题。

目前，无论是绝经后女性骨质疏松还是力学废用性骨质疏松，其发生机制都比较复杂，其中成骨细胞与破骨细胞分化平衡是维持正常骨量的关键之一。成骨细胞分化促进骨形成与破骨细胞所致的骨吸收这一动态过程介导骨质形成及骨质流失。其根本机制在于机体骨重建的平衡，即破骨细胞去除旧骨(骨吸收)和成骨细胞形成新骨(骨形成)的失衡。

现有部分药物在控制骨质疏松症方面已有广泛应用，其中包括骨健康补充剂(钙剂和维生素D)及药物干预(骨形成类药物和抗骨吸收药物)等，这些药物主要通过抑制骨吸收或促进骨形成发挥抗骨质疏松作用，但大都治疗靶点单一，其中钙补充剂仅作为基本的辅助药物不能作为治疗骨质疏松的治疗药物，而其他西药治疗周期较长，副作用高，价格高昂。而天然小分子化合物相比传统的治疗骨质疏松药物(如双膦酸盐和激素替代治疗)具有安全性高、治疗靶向性强、价格低廉、治疗效果突出等优势。6-甲氧基当归素是一种天然小分子化合物，具有抗炎和解热镇痛的功效，6-甲氧基当归素及其结构类似物在治疗缓解原发性或继发性骨质疏松疾病中的作用目前未见报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供6-甲氧基当归素或其结构类似物或其药学上可接受的衍生物在制备用于治疗、预防、缓解原发性或继发性骨质疏松和/或骨丢失相关疾病的药物或药物组合物中的新用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明的第一个目的是提供6-甲氧基当归素及其结构类似物或其药学上可接受的衍生物在制备用于治疗、预防、缓解原发性或继发性骨质疏松和/或骨丢失相关疾病的药物或药物组合物中的新用途。

所述6-甲氧基当归素单体的化学结构式如下所示：

所述6-甲氧基当归素结构类似物的结构通式如式(I)或式(II)所示：

式(I)中，R

式(II)中，R

优选地，所述6-甲氧基当归素结构类似物的结构通式如式(II)所示：且R

所述药学上可接受的衍生物为其药学上可接受的盐、酯、醚、立体异构体或其前药分子中的任意一种。这些物质能够促进成骨细胞分化及抑制破骨细胞的骨吸收，促进成骨细胞标志基因Alp，Ocn的表达，达到预防、治疗、缓解原发性或继发性骨质疏松和/或骨丢失相关疾病的目的。

优选的，所述药物是以6-甲氧基当归素或其结构类似物或其药学上可接受的衍生物为主要成分的单一物质来使用，或由其为主要成分所构成的药物组合物。

优选地，当所述药物是以6-甲氧基当归素或其结构类似物或其药学上可接受的衍生物为有效成分的组合物时，该组合物包括6-甲氧基当归素或其结构类似物或其药学上可接受的衍生物和医学上可接受的辅料。

所制备得到的药物剂型包括注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂或溶液剂。

本发明的第二个目的是还提供了上述6-甲氧基当归素及其结构类似物或其药学上可接受的衍生物在制备用于缓解原发性或继发性骨质疏松和/或骨丢失相关疾病的保健品中的用途。

本发明的第三个目的是还提供了上述6-甲氧基当归素及其结构类似物或其药学上可接受的衍生物在制备用于缓解原发性或继发性骨质疏松和/或骨丢失相关疾病的功能食品中的用途。

本发明的第四个目的是还提供了上述6-甲氧基当归素及其结构类似物或其药学上可接受的衍生物在制备成骨细胞分化和/或成骨细胞骨形成激动剂中的用途。

优选地，所述成骨细胞的相关基因选自ALP、OCN中的至少一种。

本发明的第五个目的是还提供了上述6-甲氧基当归素及其结构类似物或其药学上可接受的衍生物在制备破骨细胞分化和/或破骨细胞骨吸收抑制剂中的用途。

本发明的第六个目的是还提供了一种用于治疗、预防、缓解原发性或继发性骨质疏松和/或骨丢失相关疾病的产品，该产品包含6-甲氧基当归素或其结构类似物或其药学上可接受的衍生物。

优选地，所述产品可以是激动剂、抑制剂、药物、保健品或功能食品等产品。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过大量试验研究发现6-甲氧基当归素及其结构类似物和衍生物不仅能够显著促进成骨细胞分化，上调成骨细胞标志基因Alp及Ocn的表达，还能抑制破骨细胞分化，从而显著增加骨质疏松模型小鼠的骨密度，恢复骨微结构，增加骨量，是一种疗效显著、成本低廉、毒副作用小的治疗骨质疏松的天然小分子化合物。因此，可以开发出一系列产品，诸如包括6-甲氧基当归素的试剂、药物、保健品或食品，可以有效治疗和预防原发性或继发性骨质疏松和/或骨丢失相关疾病。

附图说明

图1为采用本发明实施例1的6-甲氧基当归素处理MC3T3-E1细胞后，碱性磷酸酶和茜素红染色结果示意图；

图2为采用本发明实施例1的6-甲氧基当归素处理MC3T3-E1细胞后，使用qPCR检测方法对成骨分化标志基因ALP及OCN进行检测的结果示意图；

图3为采用本发明提供的6-甲氧基当归素各结构类似物处理MC3T3-E1细胞后，碱性磷酸酶染色结果示意图；

图4为采用本发明提供的6-甲氧基当归素各结构类似物处理MC3T3-E1细胞后，碱性磷酸酶定量测定结果示意图(附注：1:牛防风素；2:异佛手柑内酯；3:水合氧化前胡素；4:佛手柑内酯；5:异欧前胡素；6:氧化前胡素；7:别欧前胡素；8:异珊瑚菜素；9:空白组；10:佛手柑素；11:羌活醇；12:花椒毒素；13:紫花前胡醇；14:异茴芹内酯；15:茴芹内酯；16:花椒毒酚；17:香柑醇)；

图5为采用本发明提供的6-甲氧基当归素各结构类似物处理MC3T3-E1细胞后，茜素红染色结果示意图；

图6为采用本发明实施例1的6-甲氧基当归素处理原代骨髓单核巨噬细胞，诱导后破骨细胞TRAP染色结果示意图；

图7为去卵巢骨质疏松模型小鼠灌服6-甲氧基当归素或异欧前胡素后股骨骨密度(图7a)和microCT扫描分析(图7b)定量结果示意图；

图8为后肢去负荷骨质疏松模型小鼠灌服6-甲氧基当归素或异欧前胡素后股骨骨密度(图8a)和microCT扫描分析(图8b)定量结果示意图；

图9为6-甲氧基当归素或异欧前胡素灌服后胫骨三点弯曲力学性能检测结果示意图；

图10为6-甲氧基当归素或异欧前胡素灌服后骨质疏松模型动物肝肾功能指标检测结果示意图。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步介绍本发明的实施及所具有的有益效果，目的在于帮助更好的理解本发明的实质和精神，不能构成对本发明实施范围的限定。

本发明的6-甲氧基当归素(又名牛防风素)为6-甲氧基当归素单体，其化学结构式如下：

Sphondin CAS:483-66-9

本发明的发明人通过大量实验研究发现了6-甲氧基当归素的新用途，该物质不仅能够显著促进成骨细胞分化，上调成骨细胞标志基因Alp及Ocn的表达，还能抑制破骨细胞的骨吸收，显著增加骨质疏松模型小鼠的骨密度，恢复骨微结构，增加骨量。通过更深入的分析发现，含有和6-甲氧基当归素具有相同或近似母核结构的小分子结构类似物亦具有上述作用，通过试验筛选出下面式I或式II所表示的结构类似物对成骨细胞分化具有非常积极的作用。此外，以6-甲氧基当归素或式I或式II所表示的结构类似物为基础，其药学上可接受的衍生物为其药学上可接受的盐或酯或醚或其立体异构体或其前药分子亦具备同样的功能。这些小分子物质能够有效治疗和预防骨质疏松疾病，以及预防卵巢切除或雌激素不足等引起的骨丢失相关疾病。

上述6-甲氧基当归素结构类似物的结构通式如式(I)或式(II)所示：

式(I)中，R

式(II)中，R

代表性6-甲氧基当归素结构类似物如图3所示：具体包括异佛手柑内酯(CAS:482-48-4)；水合氧化前胡素(CAS:2643-85-8)；佛手柑内酯(CAS:484-20-8)；异欧前胡素(CAS:482-45-1)；氧化前胡素(CAS:737-52-0)；别欧前胡素(CAS:642-05-7)；异珊瑚菜素(CAS:14348-22-2)；佛手柑素(CAS:7380-40-7)；羌活醇(CAS:88206-46-6)；花椒毒素(CAS:298-81-7)；紫花前胡醇(CAS:23458-02-8；异茴芹内酯(CAS:482-27-9)；茴芹内酯(CAS:131-12-4)；花椒毒酚(CAS:2009-24-7)；香柑醇(CAS:486-60-2)；欧前胡素(CAS:482-44-0)。

实施例1 6-甲氧基当归素对成骨细胞分化的影响

1.小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞的培养

MC3T3-E1前成骨细胞由完全培养基培养，细胞放置于37℃，5％CO

该完全培养基由以下成分组成：

每mLα-MEM液体培养基中添加：10％胎牛血清(体积百分比)、10μmol L-谷氨酰胺、100μg青霉素、100μg硫酸链霉素。

2.MC3T3-E1细胞的成骨分化诱导

MC3T3-E1前成骨细胞在培养至细胞密度为80％后，对MC3T3-E1前成骨细胞进行成骨分化诱导培养，实验分为对照组和实验组。

对照组采用成骨分化培养基进行成骨分化诱导培养，实验组采用添加了6-甲氧基当归素的成骨分化培养基进行成骨分化诱导培养，实验组中成骨分化培养基中所含6-甲氧基当归素的终浓度为20μM，诱导培养过程中每两天换一次液，成骨分化培养基需现用现配。

该成骨分化培养基由以下成分组成：

每升α-MEM液体培养基中含有：10％胎牛血清(体积百分比)、10mML-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL硫酸链霉素、0.005％维生素C(质量体积百分比)、10mMβ-甘油磷酸钠、20μM 6-甲氧基当归素。

下面结合碱性磷酸酶(ALP)染色检测方法、茜素红染色检测方法、以及成骨分化相关基因RT-PCR检测方法，对实施例1的实验组和对比例1的对照组进行成骨细胞的分化分析，具体如下：

(1)碱性磷酸酶(ALP)染色检测方法

当实施例1的实验组和对比例1的对照组均达到MC3T3-E1前细胞成骨分化诱导培养2天后，采用碱性磷酸酶染色检测细胞成骨分化水平，具体操作如下：

倒掉培养基，使用PBS洗3次，每次5min；加入0.5mL 4％多聚甲醛溶液，室温固定20min，之后继续使用PBS洗3次，每次5min；使用BCIP/NBT碱性磷酸酶染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)对细胞进行染色，37℃孵育30min；使用去离子水洗2次，每次5min；常温晾干，使用扫描仪扫描保存。检测结果具体参照图1，染色的深度代表了成骨细胞的分化水平。经过添加了6-甲氧基当归素的成骨分化培养基处理后，ALP染色明显加深，说明上述6-甲氧基当归素可增强ALP活性，促进成骨细胞分化。

(2)茜素红染色检测方法

当实施例1的实验组和对比例1的对照组均达到MC3T3-E1细胞成骨分化诱导培养14天后，采用茜素红染色检测细胞成骨分化水平，具体操作如下：

倒掉培养基，使用PBS洗3次，每次5min；加入0.5mL 4％多聚甲醛溶液，室温固定20min，之后继续PBS洗3次，每次5min；使用0.5％的茜素红溶液(pH＝4.2)对细胞进行染色，室温孵育2h；使用蒸馏水洗5次，每次10min；常温晾干，使用扫描仪扫描并保存。

检测结果具体参照图1，茜素红染色检测的是成骨细胞分化过程中，被细胞分泌的细胞外基质沉积的培养基中的钙化结节，使用茜素红对细胞进行染色，则钙化结节可以被茜素红染成红色，而没有钙化结节的细胞外基质在清洗后则不会被着色。因而染色结果上红色结节的多少就可以反映成骨细胞分化过程中沉积的钙的多少，沉积的钙越多，成骨细胞分化程度就越高。经添加了6-甲氧基当归素的成骨分化培养基处理后，红色钙化结节数量明显增多，说明上述6-甲氧基当归素可促进成骨细胞分化。

(3)成骨分化相关基因RT-PCR检测方法

当实施例1的实验组和对比例1的对照组均达到MC3T3-E1前成骨细胞经成骨分化诱导培养两天后，使用Trizol法提取二者总RNA，使用微量紫外分光光度计进行浓度检测。使用One step PrimeScript RT reagent Kit进行反转录，并使用Thermal Cycler C-1000荧光定量PCR仪进行RT-PCR检测，每一组的样品实验设置三个复孔，所有的加样过程均在冰上进行。

检测结果具体参照图2，与对照组比较，经6-甲氧基当归素给药后的实验组，分子生物学检测结果与成骨分化相关的基因表达水平显著上调。说明上述6-甲氧基当归素可促进成骨细胞的分化有效改善骨质疏松症状。

实施例2 6-甲氧基当归素结构类似物对成骨细胞分化的影响

本实施例采用系列6-甲氧基当归素结构类似物进行成骨细胞分化试验，试验过程中，关于小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞的培养、成骨分化诱导及碱性磷酸酶(ALP)染色检测方法的实施步骤与实施例1的具体过程相同，区别仅在于，各试验组在成骨分化诱导过程中所用的成骨分化培养基不同。

本实施例的实验组中加入的分化成分是系列6-甲氧基当归素结构类似物，包括异佛手柑内酯；水合氧化前胡素；佛手柑内酯；异欧前胡素；氧化前胡素；别欧前胡素；异珊瑚菜素；佛手柑素；羌活醇；花椒毒素；紫花前胡醇；异茴芹内酯；茴芹内酯；花椒毒酚；香柑醇；欧前胡素。实验组中成骨分化培养基中所含的上述各物质的终浓度仍然为20μM，对照组依旧采用成骨分化培养基进行成骨分化诱导培养。MC3T3-E1前成骨细胞在培养至细胞密度为80％后，对MC3T3-E1前成骨细胞进行成骨分化诱导培养，诱导培养过程中每两天换一次液，成骨分化培养基需现用现配。

上述实验组和对照组均达到MC3T3-E1前细胞成骨分化诱导培养2天后，采用碱性磷酸酶染色检测细胞成骨分化水平，具体操作同实施例1中的过程。检测结果具体参照图3，染色的深度代表了成骨细胞的分化水平。经过添加了代表性的6-甲氧基当归素结构类似物的成骨分化培养基处理后，ALP染色有不同程度的改变，说明上述系列结构类似物均在不同程度改变了ALP的活性，从而促进或抑制成骨细胞分化。其中，6-甲氧基当归素、异佛手柑内酯、水合氧化前胡素、佛手柑内酯、异欧前胡素、氧化前胡素、别欧前胡素、异珊瑚菜素、佛手柑素、羌活醇、异茴芹内酯和茴芹内酯可使ALP染色加深，说明它们具有促进成骨细胞分化的作用。

接着，我们对小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞的ALP活性进行定量测定，具体方法如下：

(1)样本前处理

将分化诱导培养2天后的贴壁细胞吸去上清，通过细胞刮将细胞刮下转入EP管，然后1000转/分钟，离心10分钟弃去上清留下细胞沉淀，再加入1mL PBS轻轻吹打，再次重复以上离心，留细胞沉淀备用。

在EP管中加入一定量裂解液，裂解30～40分钟，观察裂解情况，再用微量移液器吸出待测。操作表如下表所示：

(2)定量计算

培养细胞中ALP活力(金氏单位/gprot)的定义：每克组织蛋白在37℃与基质作用15分钟产生1mg酚为一个金氏单位。公式如下：

图4是6-甲氧基当归素各结构类似物处理MC3T3-E1细胞后，碱性磷酸酶定量测定结果示意图，与对照组(空白溶剂对照)比较，其中添加了1～8号化合物的细胞中ALP活性强于空白溶剂对照组。[1～8号化合物分别为：1:牛防风素(即6-甲氧基当归素)；2:异佛手柑内酯；3:水合氧化前胡素；4:佛手柑内酯；5:异欧前胡素；6:氧化前胡素；7:别欧前胡素；8:异珊瑚菜素]。

进一步的，通过参照图4我们还可以看出，其中1:牛防风素(6-甲氧基当归素)和2:异佛手柑内酯的ALP活性最强，对于小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞的分化具有非常显著的作用，培养细胞中ALP活力值均大于39金氏单位/gprot。

我们通过“构-效”关系分析化合物结构对培养细胞中ALP活力值的影响，具有角型香豆素结构的化合物其整体活性较强，且其中6位单甲氧基取代的活性最强。15：茴芹内酯属于角型香豆素结构的化合物，但由于其含有两个取代基，化合物活性反而较低，说明角型香豆素结构上取代基数量增多并不利于化合物活性。

而对于呋喃香豆素，其4位取代基较有利于化合物活性，取代基的大小及脂溶性对活性影响大，碳链长度适中，脂溶性适中活性较好。8位取代基则不利于化合物活性，其中较大的取代基或者羟基取代基对于活性的抑制作用更加明显。4位取代基对于活性的影响更大，碳链长度适中，脂溶性适中的4位取代基，可部分逆转8位取代基的不利影响。结果进一步表明，对于吡喃香豆素的活性则弱于呋喃香豆素。

接着，对小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1的分化进一步通过茜素红染色检测方法进行检测，小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞的培养及茜素红染色检测方法的实施步骤与实施例1相同。

检测结果具体参照图5，与对照组(空白)比较，经添加了牛防风素(6-甲氧基当归素)、异佛手柑内酯、水合氧化前胡素、佛手柑内酯、异欧前胡素、氧化前胡素、别欧前胡素、异珊瑚菜素的成骨分化培养基处理后，红色钙化结节数量明显增多，说明上述各牛防风素的结构类似物均可促进成骨细胞分化。

实施例3 6-甲氧基当归素对破骨细胞分化的影响

a.骨髓单核巨噬细胞体外诱导破骨分化

使用破骨诱导培养基(添加了10ng/mL M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)和10ng/mLRANKL(核因子κB受体性活化因子配体)的完全培养基)对骨髓单核巨噬细胞(BMMs)进行体外诱导破骨分化。具体诱导方法如下：

将从小鼠骨髓中提取原代BMMs细胞以1×10

实验分为对照组和给药组，对照组为BMMs细胞中加入破骨诱导培养基后正常诱导，给药组为原代BMMs细胞中同时加入破骨诱导培养基以及20μM 6-甲氧基当归素。破骨诱导培养后4d左右即可观察到对照组出现成熟的多核破骨细胞，可进行收样及检测。

b.TRAP染色

对破骨诱导培养后的对照组和给药组进行破骨细胞TRAP染色，具体过程如下：

弃去样品中的培养基，用PBS缓冲液轻轻漂洗1～2次，每次3～5min；加入4％多聚甲醛溶液固定20min；弃掉固定液，PBS缓冲液漂洗2～3次，每次3～5min；弃去PBS缓冲液，加入适量TRAP染色液(48孔板每孔加入200μL即可)，置于37℃避光孵育1h；孵育结束后，弃去染色液，PBS缓冲液漂洗3次终止反应；使用光学显微镜观察细胞染色结果并拍照。

检测结果具体参照图6，经上述6-甲氧基当归素诱导处理后，抑制了RANKL诱导的TRAP酶活力，使其染色阳性细胞下降，成熟的多核破骨细胞数量减少，说明6-甲氧基当归素可抑制破骨细胞分化及骨吸收。

实施例4 6-甲氧基当归素和异欧前胡素对去卵巢骨质疏松小鼠的治疗效果

选择2月龄的C57BL/6小鼠建立去卵巢骨质疏松动物模型，检测6-甲氧基当归素(sphondin)和异欧前胡素(isoimperatorin)对骨质疏松模型动物的治疗效果。6-甲氧基当归素以灌胃的方式给予小鼠，每日一次，持续给药8周，剂量为10mg/kg和30mg/kg，异欧前胡素的给药方式同6-甲氧基当归素，剂量为10mg/kg、30mg/kg和50mg/kg。

1.小鼠骨密度检测

以戊巴比妥钠麻醉小鼠后，使用高分辨率双能X射线成像系统(MEDIKORS，InAlyzer，55KeV/80KeV)测量给药后小鼠的骨密度。

参照图7a，去卵巢小鼠股骨骨密度明显低于正常健康小鼠；而灌服不同剂量6-甲氧基当归素和异欧前胡素后，去卵巢骨质疏松小鼠相较于未给药组小鼠股骨骨密度均显著升高，且高剂量组较低剂量组的效果更好，说明上述6-甲氧基当归素和异欧前胡素可明显改善骨质疏松症状，其中6-甲氧基当归素效果优于异欧前胡素。

2.microCT检测

脱颈处死小鼠，剥离取出股骨，去除骨表面的软组织，用4％多聚甲醛固定后，采用micro CT扫描仪进行扫描，重构后用专用骨骼CT分析软件分析以下参数：骨密度(BMD)，骨体积分数(BV/TV％)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨小梁数量(Tb.N)，骨小梁分离度(Tb.Sp)等。

图7b为本实施例中小鼠灌服不同剂量6-甲氧基当归素和异欧前胡素后，股骨micro CT扫描图及股骨micro CT扫描后的软件定量分析结果。与对照组小鼠相比，灌服6-甲氧基当归素和异欧前胡素后，小鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量和骨小梁分离度均有显著的恢复，且高剂量组较低剂量组的效果更好。说明6-甲氧基当归素和异欧前胡素治疗均可以改善小鼠的股骨骨密度流失和骨微结构，其中6-甲氧基当归素效果优于异欧前胡素。

实施例5 6-甲氧基当归素和异欧前胡素对力学去负荷骨质疏松小鼠的治疗效果

选择6月龄的C57BL/6小鼠建立后肢尾悬吊力学去负荷骨质疏松动物模型，6月龄C57BL/6地面饲养组小鼠作为对照，检测6-甲氧基当归素和异欧前胡素对力学去负荷性骨质疏松的治疗效果。6-甲氧基当归素以灌胃的方式给予小鼠，每日一次，持续给药4周，剂量为30mg/kg；异欧前胡素的给药方式同6-甲氧基当归素，剂量亦为30mg/kg。

1.小鼠骨密度检测

检测方法同实施例4。参照图8a，力学去负荷骨质疏松小鼠股骨骨密度明显低于地面饲养对照组；而灌服6-甲氧基当归素和异欧前胡素后，力学去负荷骨质疏松小鼠股骨骨密度相较于未给药组显著升高，说明上述6-甲氧基当归素及异欧前胡素均可改善力学去负荷骨质疏松症状，其中6-甲氧基当归素效果优于异欧前胡素。

2.小鼠micro CT检测

检测方法同实施例4。图8b为本实施例中小鼠灌服6-甲氧基当归素或异欧前胡素不同时间后，股骨micro CT扫描图及股骨micro CT扫描后的软件定量分析结果。与力学去负荷小鼠相比，灌服4周6-甲氧基当归素或异欧前胡素后，小鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量和骨小梁分离度均有显著的恢复。说明6-甲氧基当归素和异欧前胡素治疗均可以增加力学去负荷性骨质流失小鼠的股骨骨密度并改善骨微结构，其中6-甲氧基当归素效果优于异欧前胡素。

实施例6 6-甲氧基当归素和异欧前胡素对骨质疏松模型动物骨组织力学性能的改善

去卵巢骨质疏松小鼠模型的建立方法，以及6-甲氧基当归素和异欧前胡素的给药方案同实施例4；后肢尾悬吊力学去负荷骨质疏松小鼠模型的建立方法，以及6-甲氧基当归素和异欧前胡素的给药方案同实施例5。

脱颈处死小鼠，剥离取出股骨，去除骨表面的软组织，用PBS溶液洗涤浸润，通过三点弯曲力学加载检测小鼠胫骨力学性能。

参照图9，与对照组比较，经6-甲氧基当归素或异欧前胡素治疗后，小鼠力学性能指标最大载荷、弹性模量、硬度系数均显著提高。说明连续较长时间(8周)灌胃给药，6-甲氧基当归素和异欧前胡素均能够有效恢复骨组织力学性能，其中6-甲氧基当归素效果优于异欧前胡素。

实施例7 6-甲氧基当归素和异欧前胡素对骨质疏松模型动物肝肾毒性的检测

去卵巢骨质疏松小鼠模型的建立方法，以及6-甲氧基当归素和异欧前胡素的给药方案同实施例4；后肢尾悬吊力学去负荷骨质疏松小鼠模型的建立方法，以及6-甲氧基当归素和异欧前胡素的给药方案同实施例5。

心脏穿刺抽取给药后小鼠血液，分离血清，检测血清中ALT、AST、r-GT和BUN水平。参照图10，与对照组比较，经6-甲氧基当归素或异欧前胡素治疗后，小鼠肝肾功能指标ALT、AST、r-GT和BUN水平均无明显变化。说明连续较长时间(8周)应用上述6-甲氧基当归素或异欧前胡素无显著肝肾毒性，其安全性较佳。

通过以上实验结果我们研究发现6-甲氧基当归素及其结构类似物能有效治疗和预防骨质疏松疾病，通过构建模拟女性绝经后更年期疾病症状小鼠模型以及废用性骨质疏松小鼠模型，运用6-甲氧基当归素能够有效缓解骨质疏松症状，促进骨形成抑制骨吸收，显著增加模型动物的骨密度，恢复骨微结构，且没有明显的毒副作用。其药学上可接受的衍生物，如其药学上可接受的盐、酯、醚、立体异构体或其前药分子，也因具有相同的作用基团，亦可以用作治疗、预防、缓解骨质疏松和/或骨丢失药物中的用途。

鉴于6-甲氧基当归素及其结构类似物在上述方面的突出作用，我们可以单独使用该物质，或以该物质为主要成分，加入其他医学上可接受的辅料，形成药物组合物来使用，来治疗、预防、缓解原发性或继发性骨质疏松和/或骨丢失等病症。这些药物的剂型包括注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂或溶液剂。鉴于其能够显著促进成骨细胞分化，上调成骨细胞标志基因Alp及Ocn的表达，在制备成骨细胞分化和/或成骨细胞骨形成激动剂、破骨细胞分化和/或破骨细胞骨吸收抑制剂中具有广泛用途，还可以应用到保健品或功能食品中，来制作成包括激动剂、抑制剂、药物、保健品、功能食品在内的各类产品。

综上所述，本发明的较佳实施例疗效显著、成本低廉、毒副作用小，是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内，可用于雌性动物绝经后雌激素缺乏导致疾病症状的治疗。