检测茶叶样品中多种类真菌毒素的方法及其应用

技术领域

本发明涉及痕量化学物质色谱分析技术领域；更具体地，本发明涉及一种检测茶叶样品中多种类真菌毒素的方法及其应用。

背景技术

真菌毒素污染各种食品饮品以及粮食作物，约1/4产量的粮食会不同程度受到真菌毒素的污染。所有的农作物在生长、采后贮藏以及加工时期，都有被污染产毒真菌进而含有生物毒素的概率。真菌毒素不仅污染食物，造成食物中毒，大多真菌毒素还具有致癌、致畸、致突变作用，对人类的生存和健康造成巨大威胁。虽然可以控制食物在生长和贮存的条件以减少污染的发生，以及食物加工过程中可以去除部分真菌毒素，但不能完全去除，因此检测食物生产工程中的真菌毒素含量非常有必要的。

茶叶的种类繁多，目前出名的茶叶就有上千种，根据不同加工工艺及发酵程度所形成的色泽与滋味差异，主要分为绿茶、白茶、黄茶、青茶/乌龙茶、红茶和黑茶六大基本茶类。其因独特的风味以及健康功能，是世界上除水以外，消费量最大的饮料。然而，真菌毒素是茶树种植、茶叶生产、储存和消费过程中潜在化学污染物之一。尤其是后发酵茶中独特的渥堆发酵工艺涉及多种微生物，包括：黑曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉等曲霉属、根霉、青霉、木霉、酵母以及嗜热菌等；一方面微生物有利于茶叶形成独特的香气和品质，另一方面，由于加工环境潮湿以及工业环境复杂性，可能导致有害产毒真菌的污染，增加了真菌毒素产生和积累的风险。

目前国内外对茶叶的质量和安全问题越来越重视。研究大多集中在检测重金属以及农药残留等方面，对茶叶中功能性活性成分的研究也较多。随着国内外对茶叶中真菌毒素污染情况调查研究的深入，发现此类产品中可能存在的真菌毒素的污染情况多种多样，多种真菌毒素都有可能在种植、加工及储存过程对茶叶造成污染。LC-MS/MS广泛应用于食品中真菌毒素的测定，由于茶叶基质的复杂性，本领域对如何降低茶叶基质效应仍然缺乏有效的手段，尤其针对同时检测多种真菌毒素的LC-MS/MS法。目前缺乏对发酵茶中多种真菌毒素同时检测的研究，同时也缺乏不同类型发酵茶中真菌毒素风险评价的研究数据。尤其是针对α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇等此类真菌毒素，仍然缺少相关的污染数据，在茶叶基质中尚没有找到合适的、通过一次性操作实现与其他多种毒素同时检测的手段。

综上所述，目前国内外对茶叶中多种真菌毒素的检测方法，操作繁琐，效率低，且很少能实现多种真菌毒素的高通量检测。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种检测茶叶样品中真菌毒素的超高效液相色谱串联质谱方法，所述方法基于优化提取步骤、改良QuEChERS净化技术结合超高效液相色谱-串联质谱法进行建立。

在本发明的第一方面，提供一种检测茶叶样品中多种类(包括两种或多种)真菌毒素的方法，所述方法包括：

(1)从茶叶样品中提取含有(或潜在含有)真菌毒素的提取物，其中以极性有机溶液进行提取，且所述极性有机溶剂中添加甲酸；

(2)利用QuEChERS净化方法对(1)的提取物进行净化，获得经净化的提取物；

(3)高效液相色谱-串联质谱法检测前述(2)的经净化的提取物，测定真菌毒素含量；

其中，所述真菌毒素包括选自下组的两种或多种：α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL)，β-玉米赤霉烯醇(β-ZEL)，α-玉米赤霉醇(α-ZAL)，β-玉米赤霉醇(β-ZAL)，玉米赤霉烯酮(ZEN)，黄曲霉毒素B

在一个优选例中，所述真菌毒素包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的极性有机溶剂包括选自：乙腈，甲醇，乙酸乙酯。

在另一优选例中，步骤(1)中，甲酸在极性有机溶液的浓度为0.1％～1.4％；较佳地为0.2％～1.2％；更佳地为0.5％～1.1％(如0.6％，0.8％，0.9％，1％)。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述极性有机溶剂浓度为95～100％；更佳地为98～100％(如99％)。

在另一优选例中，步骤(1)中，用于添加的甲酸(加样前)为95～100％；更佳地，所述甲酸为98～100％(如99％)。

在另一优选例中，步骤(1)中，对茶叶样品进行提取时，每克茶叶样品使用5～16ml含有甲酸的极性有机溶剂；较佳地，每克茶叶样品使用8～12ml含有甲酸的极性有机溶剂；更佳地，每克茶叶样品使用9～11ml含有甲酸的极性有机溶剂；如，每克茶叶样品使用10ml甲酸乙腈。

在另一优选例中，步骤(3)中，利用高效液相色谱-串联质谱法检测；较佳地，以含有乙酸铵的水溶液为流动A相、以甲醇作为流动B相。

在另一优选例中，步骤(3)中，所述高效液相色谱-串联质谱法为超高效液相色谱-串联质谱法。

在另一优选例中，以Agilent Extend-C

在另一优选例中，以梯度洗脱程序的时间为20±5分钟(较佳地20±3分钟；更佳地20±2分钟或20±1分钟)。

在另一优选例中，步骤(3)中，以质谱优化参数(表1)条件进行检测分析。

在另一优选例中，步骤(3)中，所述测定真菌毒素含量包括定量测定或定性测定。

在另一优选例中，步骤(3)高效液相色谱-串联质谱法检测时，采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪检测。

在另一优选例中，步骤(3)高效液相色谱-串联质谱法检测时，质谱条件设置为：

测量AFB

测量AFB

测量AFG

测量AFG

测量ZEN时，以m/z值为175.030的产物离子作为定量离子；

测量α-ZEL时，以m/z值为275.200的产物离子作为定量离子；

测量β-ZEL时，以m/z值为275.200的产物离子作为定量离子；

测量α-ZAL时，以m/z值为277.200的产物离子作为定量离子；

测量β-ZAL时，以m/z值为277.200的产物离子作为定量离子；

测量DON时，以m/z值为265.000的产物离子作为定量离子；

测量15-Ac DON时，以m/z值为137.000的产物离子作为定量离子；

测量3-Ac DON时，以m/z值为307.160的产物离子作为定量离子；

测量OTA时，以m/z值为239.100的产物离子作为定量离子；

测量NEO时，以m/z值为185.100的产物离子作为定量离子；

测量T-2时，以m/z值为215.000的产物离子作为定量离子；

测量CIT时，以m/z值为249.000的产物离子作为定量离子；

所述定量离子利用碰撞能生成合适的产物离子。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述QuEChERS净化方法中，所用净化管包括以下的填料：羧基化多壁碳纳米管(Carboxyl Multi-walled Carbon Nanotubes，MWCNTs-COOH)，苯乙烯二乙烯基苯共聚合物(Hydrophilic-Lipophilic Balance，HLB)，硅胶(Silica Gel，SG)；较佳地，按照重量比，羧基化多壁碳纳米管:苯乙烯二乙烯基苯共聚合物:硅胶为1:(1～10):(1～10)；较佳地为1:(6～9):(5～10)。

在另一优选例中，步骤(2)中，按照质量比，羧基化多壁碳纳米管:苯乙烯二乙烯基苯共聚合物:硅胶为1:(7～8):(7～8)。

在另一优选例中，步骤(2)中，按照质量比，羧基化多壁碳纳米管:苯乙烯二乙烯基苯共聚合物:硅胶为1:7.5:7.5。

在另一优选例中，步骤(1)之前还包括：粉碎茶叶样品的步骤。

在另一优选例中，步骤(1)之后，还包括：离心获取上清的步骤。

在另一优选例中，所述方法中还包括：利用标准曲线法来进行定性和/或定量分析；较佳地，在步骤(3)检测前，配制基质加标溶液：取不含毒素的空白待测样品溶液，然后加入素标准溶液，配制成不同浓度的基质加标样品(标准品)溶液；较佳地，在步骤(3)检测后，采用步骤(3)的检测条件测定所述不同浓度的基质加标样品溶液，得到基质加标曲线，利用基质外标法实现定性和/或定量分析。

在另一优选例中，所述的标准曲线为基质加标曲线。较佳地，采用步骤(3)的测定方法，测定不同浓度的基质加标样品溶液，得到基质加标曲线，利用基质外标法同时实现定性定量分析。

在另一优选例中，所述配制基质加标溶液包括：取不含毒素的空白待测样品溶液，然后加入毒素标准溶液，配制成不同浓度的基质加标溶液。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的方法的应用，用于检测茶叶样品中多种类(包括两种或多种)真菌毒素；较佳地，所述的检测包括定量检测或定性检测；较佳地，所述真菌毒素包括选自下组的两种或多种：α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL)，β-玉米赤霉烯醇(β-ZEL)，α-玉米赤霉醇(α-ZAL)，β-玉米赤霉醇(β-ZAL)，玉米赤霉烯酮(ZEN)，黄曲霉毒素B

在本发明的另一方面，提供一种用于检测茶叶样品中多种类(包括两种或多种)真菌毒素含量的试剂盒，包括：

(a)用于从茶叶样品中提取含有(或潜在含有)真菌毒素的提取物的极性有机溶剂，其中所述极性有机溶剂中添加甲酸；

(b)适用于QuEChERS净化方法的净化管，所述净化管中包括以下的填料：羧基化多壁碳纳米管，苯乙烯二乙烯基苯共聚合物，硅胶；

(c)用于高效液相色谱-串联质谱法检测的试剂，包括：含有乙酸铵的水溶液(作为流动A相)、甲醇(作为流动B相)。

在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：所述多种类(包括两种或多种)真菌毒素的标准品。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：所述多种类(包括两种或多种)真菌毒素的对照品。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：洗脱试剂。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：说明检测茶叶样品中真菌毒素含量的方法的使用说明书。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、不同甲酸比例乙腈对茶基质中真菌毒素提取回收率(百分比，％)。

图2、不同甲酸比例乙腈对茶基质中伏马毒素的质谱响应图；

a、0％甲酸乙腈提取FB

b、0.1％甲酸乙腈提取FB

c、1％甲酸乙腈提取FB

d、0％甲酸乙腈提取FB

e、0.1％甲酸乙腈提取FB

f、1％甲酸乙腈提取FB

图3、不同多功能净化柱对茶基质中真菌毒素的净化回收率(百分比，％)；

横坐标a表示Cleanert MC(Code#LC-MYT10-B)净化柱；

横坐标b表示含有混合填料MWCNTs-COOH:HLB:SG为1:7.5:7.5的净化管(中国专利申请CN 202011052151.3)；

横坐标c表示CNW 301MFC(Code#SBEQ-CD301S)净化柱；

横坐标d表示MFC 260(Code#M2600-25T)净化柱；

横坐标e表示Romerlab MycoSpin 400(Code#COCMY2400)净化柱。

图4、16种真菌毒素在优化的LC-MS/MS条件下的总离子流图。

具体实施方式

基于本领域中缺乏高通量进行真菌毒素检测的技术难题，本发明提供了解决方案。本发明揭示了一种检测茶叶样品中真菌毒素的超高效液相色谱串联质谱方法，所述方法基于优化提取步骤、改良QuEChERS净化技术结合超高效液相色谱-串联质谱法进行建立。本发明的技术方案可以实现一次性检测多种真菌毒素，所述真菌毒素的种类至少为16种。

基于高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析方法中，对于待测样品具有较高的要求，消除或降低基质效应，是决定该测定方法的关键性因素之一。样品前处理步骤主要包括提取和净化，常见的样品前处理方法包括：固相萃取法(SPE)、磁性固相萃取法(MSPE)、分散液-液微萃取法(DLLME)、QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged andSafe)、免疫亲和柱(IAC)浓缩、多功能净化柱(MFC)净化等。同时，基于纳米材料、生物材料和合成材料的样品预处理和分析技术也被认为是检测真菌毒素的重要方法。而本发明中，则优化了检测方法，提供了一种不同于现有技术的，可实现高通量检测多种真菌毒素的技术方案。

术语

如本发明所用，所述的“茶叶样品”包括天然茶叶样品、人工加工后的茶叶样品、或茶制品。

如本发明所用，所述的“高通量”是指在一批次检测中，同时检测不同类茶叶(包括绿茶、乌龙茶、红茶、黑茶等)中多种真菌毒素，检测的真菌毒素的种类可至少达到16种。

如本发明所用，所述的“真菌毒素”是一些真菌在适宜温度、适宜湿度条件下产生的二级代谢产物。优选地，本发明中所述的“真菌毒素”包括但可能不限于选自下组的两种或多种：α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL)，β-玉米赤霉烯醇(β-ZEL)，α-玉米赤霉醇(α-ZAL)，β-玉米赤霉醇(β-ZAL)，玉米赤霉烯酮(ZEN)，黄曲霉毒素B

如本发明所用，“基质”指的是样品中除目标物分析物以外的组分，由于基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性，这些影响和干扰被称为基质效应。

如本发明所用，“目标分析物”也称为“目标物”；除非另外说明，所述“目标分析物”指“真菌毒素”。

茶叶样品中多种真菌毒素的提取方法优化

针对多种真菌毒素，要实现良好的检测，前提条件就是要从茶叶样品中提取尽可能含有全部种类毒素以及尽可能含有全部量，从而为后续的准确检测提供支持。

本领域技术人员了解，每种真菌毒素的化学结构不尽相同，使得它们的共同提取，一次提取以获得有利于后续步骤检测的、达到检测标准的多种真菌毒素是本领域的难题。尤其是针对α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇等此类真菌毒素，在茶叶基质中尚没有找到合适的、通过一次性操作实现与其他多种毒素同时检测的手段。而本发明通过提取方法的有效优化，通过简单易行的手段，实现了茶叶样品中多种真菌毒素的一次性有效提取。

本发明中，运用极性有机溶剂来进行真菌毒素的提取，一些极性有机溶剂可被应用于本发明中，包括但不限于：甲醇，乙醇，乙腈。

作为本发明的优选方式，利用乙腈作为极性有机溶剂对茶叶样品进行提取，获得含有多种真菌毒素的提取物。本发明人观测到，乙腈提取液的基质干扰小。较佳地，以95～100％乙腈作为这一过程中的提取剂；更佳地，所述乙腈为98～100％乙腈，如99～100％乙腈。

然而，本发明人也发现，当需要进行多种真菌毒素的同时提取时，单一乙腈作为提取剂时对极性范围敏感的真菌毒素的提取效果不理想，本发明人在深入分析后找到了有效解决/减少这一问题的方案。因此，作为本发明的更为优选的方式，在以极性有机溶液进行提取时，在所述极性有机溶剂中添加甲酸。

鉴于所需测定的真菌毒素是多种的，如何满足尽可能多地实现有效提取，本发明人细致地分析了合适的添加甲酸的量。作为本发明的优选方式，甲酸在极性有机溶液中的浓度为0.1％～1.4％；较佳地为0.2％～1.2％；更佳地为0.5％～1.1％(如0.6％，0.8％，0.9％，1％)。在这样的甲酸添加量下，本发明人发现，真菌毒素的提取效果大大提高，可以同时实现16种真菌毒素的提取，且可以有效避免/减少基质效应造成的干扰。

预处理步骤的前期，还包括粉碎茶叶样品的步骤，这一步骤可以将茶叶样品粉碎到适当的粉度，本领域技术人员可以应用多种方法进行这一步骤。较佳地，可通过机械处理的方式来进行这一步骤。

作为本发明的优选方式，利用乙腈对茶叶样品进行提取，获得提取液后，还包括进行离心，获取上清的步骤。其他方式的从提取液有获取所需物质的方法也可被包含在本发明中。

作为本发明的优选方式，利用乙腈对茶叶样品进行提取时，每克茶叶样品使用5～15mL乙腈；更佳地，每克茶叶样品使用8～12mL乙腈。在具体实施例中，本发明人优化了提取剂与样品的用量；以约10倍(mL:g)体积的提取剂来提取样品，回收率是相对高的。

在本发明的具体实施例中，所述的预处理步骤具体包括：取研磨成粉末的茶叶样品于聚四氟乙烯离心管，加入包含甲酸的极性有机溶剂，超声辅助提取30±10min，4000±1000r/min离心10±5min(较佳地，超声辅助提取30±5min，4000±500r/min离心10±3min；更佳地，超声辅助提取30±3min，4000±300r/min离心10±2min)，取上清备用。

提取产物的净化方法优化

在检测前的预处理步骤中，获得含有多种真菌毒素的提取物后，还包括进行净化的步骤，以获得经净化的、可以用于后续检测的提取物，进而为后续的准确检测提供支持。

为了获得良好的净化效果，本发明人自制了用于QuEChERS净化的净化管中的填料种类，包括使用填料羧基化的碳纳米管、HLB和硅胶作为主要的填料。进一步地，本发明人也优化了所述填料的用量配比，按照重量比，MWCNTs-COOH:HLB:SG为1:(1～10):(1～10)；较佳地为1:(6～9):(5～10)；更佳地为1:(7～8):(7～8)。

本发明的混合填料净化回收率显著高于商品化净化柱，效果优异。

HLB(Code#SBEQ-CA3100)是亲水-亲脂平衡的吸附剂，本发明人发现，其对于本发明的目标物有很好的回收率。硅胶(Code#236799)化学性质稳定，作为吸附填料用于本发明时，效果非常理想。MWCNTs-COOH(Code#190710134732)能有效去除茶多酚，叶绿素，叶黄素。

在本发明的具体实施例中，所述净化管的制作包括：按照重量比，MWCNTs-COOH:HLB:SG(1:7.5:7.5)称量混合填料于2ml离心管中涡旋30s混匀填料，备用。

在本发明的具体实施例中，利用所述净化管的净化过程包括：取1ml备用茶叶基质上清，加入净化管中，震荡1min，12000r/min离心5min，再次取上清过0.22μm有机过滤膜，装于棕色进样瓶中，待LC-MS/MS测定。

基于本发明的新改进，本发明还提供了所述净化管的应用，用于作为基于QuEChERS净化方法的净化管，对不同类型茶叶提取物进行净化。在本发明中，其与一些商品化的净化管相比，该自制的净化管更适用于高通量同时净化含有多种(至少16种)真菌毒素的体系。

高通量检测茶叶样品中多种真菌毒素含量

经过净化步骤获得的经净化的提取物，可以利用高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)定性和/或定量检测目标物。优选地，所述高效液相色谱-串联质谱法为超高效液相色谱-串联质谱法。

作为本发明的优选方式，在进行检测时，以Agilent Extend-C

本发明人的研究工作中显示，[M+Na]

其它方面，在确定了测定条件后，可以运用公知的定性/定量的计算方法来进行目标物的定性/定量。作为本发明的优选方式，利用标准曲线法来进行定性和/或定量分析。较佳地，可通过测定不同浓度的基质加标样品溶液，得到基质加标曲线，利用基质外标法同时实现定性定量分析。

作为本发明的优选方式，利用标准曲线法来进行定性和/或定量分析；较佳地，可通过配制基质加标溶液：取不含多种真菌毒素的空白待测样品溶液，然后加入多种真菌毒素标准溶液，配制成不同浓度的基质加标样品(标准品)溶液；较佳地，利用所述高效液相色谱-串联质谱法检测的检测条件测定所述不同浓度的基质加标样品溶液，得到基质加标曲线，利用基质外标法实现定性和/或定量分析。

应用及试剂盒

目前，本领域中缺乏对发酵茶中多种真菌毒素同时检测的方法，尤其是针对α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇等此类真菌毒素，本领域中尚没有找到合适的、通过一次性操作实现检测的手段。有效的真菌毒素提取方法以及茶叶基质净化方式对茶叶中多种真菌毒素的LC-MS/MS检测具有重要意义。本发明的技术方案中，结合本发明人此前优化的QuEChERs预处理技术，建立了一种简单高效的测定茶叶中多种真菌毒素LC-MS/MS方法。可被应用于各种茶叶或茶叶制品的测定。

在本发明的一种具体实施例中，提供了一种具体操作步骤，包括如下：

A、磨样：选择不同发酵茶，并将发酵茶试样进行粉碎；

B、称样：称取适量粉碎的不同发酵茶试样；

C、提取：加入适当体积一定添加甲酸的极性溶剂，振荡混匀，超声辅助提取，得到提取液a；

D、离心：将步骤C所得提取液a进行离心，得到上清液b；

E、净化：取适当体积上清液b于已制备净化管，经振荡混匀后，离心得上清液c；

F、过滤:将上清液c置于有机滤膜中过滤，得到目标检测液d装于棕色进样瓶中；

G、分析：将目标检测液d置于Ultimate 3000/TSQ Vantage

步骤B所述称量适量茶叶为1g；

步骤C所述一定酸度极性溶剂为1％甲酸乙腈；

步骤C所述适当体积为10mL；

步骤C所述超声辅助提取条件为55℃，30min；

步骤D所述离心条件为4000r/min，10min

步骤E所述适当体积为1mL

步骤E所述制备净化管：按照重量比，120mg MWCNTs-COOH:HLB:SG(1:7.5:7.5)称量混合填料，置于2mL离心管中涡旋30s混匀填料，备用。

步骤E所述离心条件为12000r/min，5min

步骤F所述有机滤膜的孔径为0.22μm；

所述G步骤采用流动相为(5mmol/L乙酸铵-水)-甲醇，且流动相A为5mmol/L乙酸铵-水溶液，流动相B为甲醇，采用逐步提高流动相B的浓度的梯度洗脱方式进行分离，且所述梯度洗脱程序：0-1min，15％B，1-3min，15-25％B，3.0-6.5min，25-50％B，6.5-12min，50-100％B，12-15min，100％B，15-17min，100-15％B，17-20min，15％B；

所述G步骤中采用色谱柱为Agilent Extend-C

所述G步骤中离子源为电喷雾离子源(ESI)，扫描方式为正负离子扫描模式；电喷雾电压为：3000V(ESI

本发明的方法对茶叶基质的净化效果好、分析速度快、灵敏度高、重现性好，为评价茶叶中多种真菌毒素的同时检测提供了有效途径。本发明的方法具有快速、简单、廉价、有效、稳定和安全等特点。

基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种用于检测茶叶样品中多种真菌毒素含量的试剂盒，包括：用于从茶叶样品中提取含有(或潜在含有)真菌毒素的提取物的极性有机溶剂，其中所述极性有机溶剂中添加甲酸；适用于QuEChERS净化方法的净化管，所述净化管中包括以下的填料：羧基化多壁碳纳米管，苯乙烯二乙烯基苯共聚合物，硅胶；用于高效液相色谱-串联质谱法检测的试剂，包括：含有乙酸铵的水溶液(作为流动A相)、甲醇(作为流动B相)。

作为本发明的优选方式，所述试剂盒中还包括：多种真菌毒素的标准品；对照品；洗脱试剂；和/或说明检测茶叶样品中多种真菌毒素含量的方法的使用说明书。

本发明的方法以及试剂盒具有成本低、操作简单、基质净化程度高且方法灵敏度高、定量定性准确的优点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。基于本发明中的示例，本领域其它技术人员在没有做出创造性成果的前提下，基于本发明所得的其它实例，均属于本发明保护范围。本文所使用的所有的技术和科学术语属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

具体实施方式

1.实验材料与方法

(1)仪器、试剂与材料

Ultimate 3000/TSQ Vantage

多功能不锈钢研磨机(FSJ-A05N6)。

实验所用的甲醇、乙酸铵、甲酸、乙腈均为色谱级别。

材料主要包括分析级羧基化多壁碳纳米管(Carboxyl Multi-walled CarbonNanotubes，MWCNTs-COOH)、苯乙烯二乙烯基苯共聚合物(Hydrophilic-LipophilicBalance，HLB)和硅胶(Silica Gel，SG)填料；以及Cleanert MC、MFC260、RomerlabMycoSpin 400、CNW 301MFC净化柱。

毒素标准品：

黄曲霉毒素混合标准品(AFB

玉米赤霉烯酮(ZEN，Z 2125)；

α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL，Z 0166)；

β-玉米赤霉烯醇(β-ZEL，Z 2000)；

α-玉米赤霉醇(α-ZAL，Z 0292)；

β-玉米赤霉醇(β-ZAL，Z 0417)；

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON，D 0156)；

15-乙酰基化脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-Ac DON，A 1556)；

3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-Ac DON，A 6166)；

赭曲霉毒素A(OTA，O 1877)；

新茄镰孢菌醇(NEO，BRM S 92001)；

T-2毒素(T-2，T 4887)；

桔青霉素(CIT，C 1017)。

茶叶样品主要包括在超市或茶叶店购买的绿茶(碧螺春)、青茶(大红袍)、红茶(武夷红茶)、黑茶(普洱茶)等。

(2)色谱条件

色谱柱：Agilent Extend-C

(3)质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，扫描方式正负离子扫描模式，电喷雾电压为：3000V(ESI

(4)标准储备液及工作液的配置

标准品用纯乙腈稀释后制成标准母液，-40℃冰箱保存。在确定了测定条件后，可以运用公知的定性/定量的计算方法来进行目标物的定性/定量。利用标准曲线法来进行定性和/或定量分析。较佳地，可通过测定不同浓度的基质加标样品溶液，得到基质加标曲线，利用基质外标法同时实现定性定量分析。后续实施例中，将证实不含霉菌毒素的茶叶样品用于基质效应评价、方法的前处理优化中。

配制基质加标曲线：取不含真菌毒素的空白茶样，按已建立的前处理方法进行提取、净化后得到茶基质溶液，利用其稀释目标真菌毒素的标准原液，制备基质匹配的标准溶液。

配制不同浓度的基质加标样品：称取不含真菌毒素的空白茶样1g于50mL离心管中，根据真菌毒素相关限量标准加入已知浓度或低、中、高浓度真菌毒素标准原液，混匀30S后置于室温黑暗处30min，待有机溶剂挥发后更好地模拟真实茶样状态，得到的基质加标样现配现用。

(5)样品预处理方法

样品前处理步骤主要包括提取和净化，常见的样品前处理方法包括：固相萃取法(SPE)、磁性固相萃取法(MSPE)、分散液-液微萃取法(DLLME)、QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effect)。本发明提供了一种检测茶叶样品中多种真菌毒素的超高效液相色谱串联质谱方法，所述方法基于优化提取步骤、改良QuEChERS净化技术结合超高效液相色谱-串联质谱法进行建立。

预处理步骤的前期，还包括粉碎茶叶样品的步骤：利用甲酸(如1％)乙腈对茶叶样品进行提取，获得提取液后，还包括进行离心，获取上清的步骤。

后续具体实施例中，所述的预处理步骤具体包括：取研磨成粉末的茶叶样品1g于50mL聚四氟乙烯离心管，加入10mL，1％甲酸乙腈，55℃超声辅助提取30min，4000r/min离心10min；取1mL备用茶叶基质上清，加入净化管中，震荡1min，12000r/min离心5min，再次取上清过0.22μm有机过滤膜，装于棕色进样瓶中，待UPLC-MS/MS测定。

在本发明的具体实施例中，自制净化管(中国专利申请CN 202011052151.3)的制作包括：按照重量比，120mg MWCNTs-COOH:HLB:SG(1:7.5:7.5)称量混合填料于2mL离心管中涡旋30s混匀填料，备用。

实施例1、质谱条件的建立

本实施例中，进行质谱参数的确定和优化。本发明人在研究前期发现，[M+Na]

在发现了这一现象后，本发明人进一步的研究工作中，试图尽量避免其产生。本发明人分析了多种多样的添加物以期改变这状况，结果发现，水相中加入乙酸铵可抑制某些真菌毒素(黄曲霉毒素类和单端孢霉烯族类)形成[M+Na]

在流动相为(5mmol/L乙酸铵-水)-甲醇时，每种待测物分别在正负离子模式下，选择m/z范围50-1000的全扫描模式下监测真菌毒素，以获得合适的前体离子。AFB

表1、真菌毒素分析的保留时间(Retention time)和质谱参数(MS parameters)条件

t

CE：碰撞能量(Collision Energy)。

实施例2、茶叶样品中真菌毒素提取剂的优化

本实施例中，首先根据上述方法配制已知浓度(C

根据实验情况，本发明人发现，随着乙腈浓度的提高，目标分析物的提取回收率也逐步提高，并且纯乙腈提取物在后续分析过程中基质干扰小。然而，本发明人却发现，单一乙腈作为提取剂时对极性范围敏感的真菌毒素的提取效果不理想。因此需要找到解决这一问题的方案。

经过反复筛选、调试测试条件和改变方案，本发明人初步确定通过在乙腈中添加辅助试剂以期增强提取的效果、扩展可检测的毒素的种类。

针对多种多样的实验试剂，本发明人进行了大量的分析及试验工作，很多试剂对于提高提取效果无利、有的甚至降低提取效果或导致测定结果偏差或无法有效测定。经过多方面研究筛选，本发明人发现甲酸有利于从总体上增强提取效果。

本发明人在提取剂中加入不同比例的甲酸，比较了不同用量下的效果。设置甲酸分别为0％、0.1％、1％、2％、5％、10％、15％时提取剂对不同真菌毒素的提取回收率。回收率计算根据下方方程(1)所示，其中C

回收率(％)＝(C

毒素的回收率结果如表2及图1所示。

表2

图1中，上下图是不同的毒素的提取回收率，根据不同的毒素有差异。一般规定方法验证中，加标回收率需要满足的范围为60-120％，并认为回收率越接近100％，方法回收效果越为理想，正如表2所总结的，为了各毒素包括伏马均有较好回收率，选择约1％甲酸是相对最为优选的。

伏马毒素类毒素对于检测的响应情况如表3及图2所示。

表3

根据表3和图2可见，对于含有伏马毒素类，随着提取剂中甲酸的添加其响应也增强。

综上，本发明人经过研究筛选以及优化分析，认为添加甲酸于乙腈中有利于提高毒素的提取回收率。更为重要的是，本发明人找到了一种特别的优化模式，可以同时检测多种真菌毒素，添加甲酸的乙腈中，甲酸的浓度为0.1～5％为宜。然而，本发明人也发现2％或5％甲酸浓度时，CIT的回收率超过120％，说明该回收体系中，存在其它杂质也发生了响应，导致假阳性的发生，也即发生了基质效应。由此，2％以下的甲酸浓度(如0.1％～1.4％)是适宜的。

后续试验中，本发明人选择添加1％甲酸的乙腈作为本发明提取剂，以满足上述真菌毒素的回收率以及响应。

实施例3、茶叶样品中真菌毒素前处理净化方式的比较

本发明已有工作中制备了自制净化管(中国专利申请CN 202011052151.3)，并验证了该净化管能有效检测茶叶基质中黄曲霉毒素。本实施例中，本发明人分析了自制净化管以及其它多种多样的商用净化装置，力图探寻高效进行真菌毒素净化的方法。

按上述步骤称量5组茶叶，每组3份重复，其中加标及提取步骤参照上述条件保持不变，将得到的提取液分别加入不同的净化装置。对于自制净化管(中国专利申请CN202011052151.3)，取1ml上清于2ml净化管(MWCNTs-COOH:HLB:SG为1:7.5:7.5)，经1min震荡混匀后，12000r/min离心5min，取上清过0.22μm有机过滤膜，装于棕色进样瓶中待LC-MS/MS检测。其它多功能净化柱(Cleanert MC，MFC 260，Romerlab MycoSpin 400，CNW 301MFC)的净化过程参照已有文献和产品相关说明书操作净化后，同样通过0.22μm有机过滤膜，装于棕色进样瓶中待LC-MS/MS检测。最后比较5组检测结果。

结果如图3所示，不同多功能净化柱在真菌毒素净化中具有不同优势：

Cleanert MC净化柱对3-Ac DON、15-Ac DON、AFs、T-2、NEO、ZEN类净化回收率较好(61.24～119.58％)；

CNW 301MFC净化柱对3-Ac DON、AFs、ZEN净化回收率较好(63.38～110.53％)；

MFC 260净化柱对T-2类净化回收率较好(85.13％)；

Romerlab MycoSpin 400净化柱对DON、3-Ac DON、AFBs、CIT、T-2、NEO、OTA、ZEN类净化回收率较好(64.95～116.93％)；

总体而言，自制净化管对上述提到的真菌毒素回收率较好(74.26～119.98％)；该混合填料净化回收率比较理想，其具有替代商用多功能净化柱的潜力。

本发明人的分析也显示，所述的各个净化管对伏马毒素的净化效果不够理想，因此，伏马毒素的净化应通过免疫亲和柱、强阴离子交换柱及特异性吸附伏马毒素填料的单一毒素净化方法。

本发明以16种真菌毒素的中等浓度(表4设定的各类毒素的中等浓度)在适合的色质谱条件以及前处理方式下检测效果如图4所示。

实施例4、本发明的茶叶中多种真菌毒素LC-MS/MS检测方法的验证

本实施例中，对本发明的方法进行相关参数验证，并对方法的精密度、准确度进行验证。

(1)根据上述配制标准曲线及基质加标曲线的方法，分别用不同比例的甲酸乙腈提取的茶叶基质前处理液配制相同线性范围的标准曲线，通过比较校准曲线的斜率来评价基质效应(ka、kb分别代表不同比例的甲酸乙腈提取的茶基质匹配曲线和乙腈匹配曲线的斜率)，其计算方法如下式(2)所示。

ME(％)＝(K

(2)本发明中建立方法的LODs和LOQs用最低浓度下加标量，其响应分别为色谱基线噪声平均值的3倍和10倍来确定。采用日间精密度与日内精密度分析方法并检验所建立方法的准确性和精密度。在16种真菌毒素LC-MS/MS方法验证中，添加的低、中、高浓度以及基质标准曲线配制范围、检测限、定量限等相关信息如下表4。

表4、多种真菌毒素的加标浓度、线性范围、检测及定量限等相关信息表

根据上述低、中、高浓度真菌毒素加标茶样制备步骤准备四类加标样(绿茶、乌龙茶、红茶、黑茶)，按照建立的方法对其进行前处理，最后进行分析测定该方法的回收率和重复性，每个浓度下六个重复。

验证结果如表5所示：真菌毒素检测限和定量限范围分别为0.015～15.00μg.kg

表5、LC-MS/MS方法在不同茶叶基质中准确度和精密度

因此，本发明人通过优化检测手段，实现了一次操作同时检测多达16种真菌毒素，真菌毒素检测限低，结果稳定、准确。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。