一种褶牡蛎致敏蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种褶牡蛎致敏蛋白及其应用。

背景技术

原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)广泛存在于甲壳类、贝类等水产品中，是贝类和甲壳类动物的主要过敏原，同时也是一些其他无脊椎动物的次要过敏原。然而目前涉及贝类致敏蛋白TM的研究较为欠缺，因此对贝类中的致敏蛋白的全面认识对食物过敏患者的诊断及治疗显得尤为重要。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明的第一个目的在于提供一种编码褶牡蛎致敏蛋白的基因。

本发明的第二个目的是提出一种重组载体。

本发明的第三个目的是提出一种制备褶牡蛎致敏蛋白的方法。

本发明的第四个目的是提出一种褶牡蛎致敏蛋白的应用。

在本发明的第一个方面中，提供了一种编码褶牡蛎致敏蛋白的基因，所述褶牡蛎致敏蛋白包括TM-α、TM-β，TM-α的开放阅读框如SEQ ID NO：1所示，TM-β的开放阅读框如SEQID NO：2所示。

可选地，所述褶牡蛎致敏蛋白TM-α的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述褶牡蛎致敏蛋白TM-β的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

在本发明的第二个方面中，提供了一种重组载体，其包含编码上述的基因。

在本发明的第三个方面中，根据本发明实施例，提供了一种制备褶牡蛎致敏蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)以褶牡蛎cDNA为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列为引物进行PCR扩增，获得TM第一扩增产物；以褶牡蛎cDNA为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示序列为引物进行PCR扩增，获得TM第二扩增产物；

(2)以褶牡蛎cDNA为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示序列为引物进行PCR扩增，获得TM-α扩增产物；以褶牡蛎cDNA为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示序列为引物进行PCR扩增，获得TM-β扩增产物；

(3)以TM第一扩增产物、TM第二扩增产物和TM-α扩增产物为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8所示序列为引物进行PCR扩增，获得TM-α的全长基因；以TM第一扩增产物、TM第二扩增产物和TM-β扩增产物为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：8所示序列为引物进行PCR扩增，获得TM-β的全长基因；

(4)将所述TM-α和TM-β的全长基因分别克隆入原核表达载体中，构建重组质粒；

(5)将所述重组质粒转入宿主菌，诱导其表达并纯化蛋白，以获得褶牡蛎致敏蛋白TM-α和褶牡蛎致敏蛋白TM-β。

在本发明的第四方面中，根据本发明的实施例，褶牡蛎致敏蛋白TM-α和TM-β用于牡蛎过敏患者血清IgE的检测、嗜碱性粒细胞激活，使得其可制作牡蛎过敏患者的致敏蛋白组分筛查的试剂盒。

本发明还提出了上述褶牡蛎致敏蛋白TM-α或TM-β在制备牡蛎过敏患者的致敏蛋白组分筛查的试剂盒中的应用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为褶牡蛎天然TM纯化的SDS-PAGE分析；

图2为褶牡蛎TM-α的质谱鉴定(A)及褶牡蛎TM-β的质谱鉴定(B)；

图3为褶牡蛎TM-α和TM-β分子克隆的琼脂糖凝胶电泳分析，其中M为核酸Marker，图(A)为TM-α(泳道1)和TM-β(泳道2)的基因克隆，图(B)为TM-α(泳道1～10)和TM-β(泳道11～20)的菌落PCR验证，图(C)为pEASY-T1-TM-α(泳道2)和pEASY-T1-TM-β(泳道4)的双酶切琼脂糖凝胶电泳分析；

图4为褶牡蛎TM-α的SDS-PAGE分析(A)、TM-β的SDS-PAGE分析(B)和TM-α和TM-β的Western blot分析(C)，其中M为蛋白质Marker，CTM为太平洋牡蛎TM，BSA为牛血清白蛋白；

图5为褶牡蛎致敏蛋白TM-α和TM-β与牡蛎过敏患者血清的IgE结合活性分析，其中No.1～11为牡蛎过敏患者血清，BSA为牛血清白蛋白，NC1和NC2为健康人血清；

图6为褶牡蛎致敏蛋白TM-α和TM-β对牡蛎过敏患者嗜碱性粒细胞激活试验，(A)为TM-α刺激嗜碱性粒细胞的激活情况分析，(B)为TM-β刺激嗜碱性粒细胞的激活情况分析，其中白色峰表示PBS刺激的细胞群，灰色峰表示TM-α或TM-β刺激的细胞群，No.1～2为健康人，No.3～10为牡蛎过敏患者；

图7为褶牡蛎致敏蛋白TM-α和TM-β激活的CD63与CD203c的刺激指数分析，NC-α表示用TM-α刺激的健康人细胞群，NC-β表示用TM-β刺激的健康人细胞群，SI表示刺激指数，水平线表示刺激指数中位值，*p<0.05，***p<0.001。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。

下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。

实施例1褶牡蛎致敏蛋白天然TM两种亚型的纯化与鉴定

褶牡蛎致敏蛋白天然TM的纯化

新鲜褶牡蛎取闭壳肌肌肉10g与100mL缓冲液A(31mmol/L Na

褶牡蛎致敏蛋白天然TM两种亚型的质谱鉴定

分别切取图1中分子量约为40kDa的两个目的条带的胶条，送至微纳菲生物技术有限公司进行质谱鉴定；鉴定结果如图2所示，两个条带的质谱结果分别以93.31％和91.20％的序列相似度匹配上太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)TM的氨基酸序列，且两个条带的序列存在差异，根据序列相似度由高到低分别命名为TM-α和TM-β。

实施例2褶牡蛎致敏蛋白TM-α和TM-β的重组表达、纯化及鉴定

褶牡蛎致敏蛋白TM-α和TM-β的分子克隆：

褶牡蛎现杀取闭壳肌肌肉0.1g，用总RNA提取试剂盒提取总RNA。将提取的总RNA用DNA逆转录试剂盒逆转录为cDNA，冻存于-80℃备用。根据前期褶牡蛎TM质谱结果，运用Primer Primer 5.0设计引物，如表1所示，委托厦门铂瑞公司合成引物。

表1褶牡蛎TM-α和TM-β全长基因扩增引物

注：下划线部分表示酶切位点

以褶牡蛎cDNA为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列为引物进行PCR扩增，获得TM第一扩增产物；以褶牡蛎cDNA为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示序列为引物进行PCR扩增，获得TM第二扩增产物。

以褶牡蛎cDNA为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示序列为引物进行PCR扩增，获得TM-α扩增产物；以褶牡蛎cDNA为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示序列为引物进行PCR扩增，获得TM-β扩增产物。

以TM第一扩增产物、TM第二扩增产物和TM-α扩增产物为模板，核苷酸序列如SEQID NO：5和SEQ ID NO：8所示序列为引物进行PCR扩增，获得TM-α的全长基因；以TM第一扩增产物、TM第二扩增产物和TM-β扩增产物为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8所示序列为引物进行PCR扩增，获得TM-β的全长基因。

上述PCR扩增的体系如表2所示：

表2 PCR扩增体系

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3A所示，其中M为DNAMarker，1和2分别为TM-α和TM-β的全长基因；验证具有正确的目的条带后，进行大量扩增，切下含目的条带的凝胶，用DNA凝胶回收试剂盒回收。

4μL回收产物与1μL克隆载体pEASY-T1连接，25℃连接30min。将连接产物转化入50μL Trans-T1感受态细胞，冰浴30min，42℃热激30s，静置冰浴2min，加250μL LB培养基，37℃，200rpm，培养1h；将培养物均匀涂布于含Amp抗性的LB固体培养基中，37℃倒置培养10～16h。挑取平板上阳性菌株，于6mL的LB中培养10～12h，取10μL进行菌落PCR验证。根据菌落PCR结果，送含有目的基因单一条带的阳性菌株至厦门铂瑞公司测序，并将测序结果正确的阳性菌株保种，冻存于-20℃备用。

褶牡蛎致敏蛋白TM-α和TM-β重组质粒的构建：

将测序正确的阳性菌株接种于含有Amp抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm，培养至OD

将两种重组质粒和pET-22b质粒分别进行双酶切，酶切体系见表3，37℃，酶切1h，酶切结束后利用通用型DNA纯化回收试剂盒回收载体和目的基因片段。其中质粒的用量为1μg，根据其浓度换算成xμL。

表3双酶切反应体系

将酶切产物进行连接，体系为pET-22b酶切片段1μL、目的基因5μL、Solution A4μL置于16℃连接16h。连接产物转化E.coli BL21(DE3)，挑取平板上单菌落进行菌落PCR验证，如图3C所示，并测序。

褶牡蛎致敏蛋白TM-α和TM-β的表达纯化：

将测序正确的阳性菌株接种于20mL含Amp抗性的LB中，37℃培养至OD

根据小量诱导表达条件，对TM-α和TM-β进行大量诱导表达，将阳性菌株接种于500mL含Amp抗性的LB中，37℃培养至OD

褶牡蛎致敏蛋白TM-α和TM-β的抗体验证：

将纯化得到的褶牡蛎致敏蛋白TM-α和TM-β进行SDS-PAGE并以兔抗太平洋牡蛎TM多克隆抗体(稀释度1:2×10

兔抗太平洋牡蛎TM多克隆抗体制备的具体步骤如下：将纯化的褶牡蛎TM浓缩至1mg/mL免疫新西兰大白兔(体重约2kg)。初次免疫时，TM与等体积的弗氏完全佐剂充分混合后进行皮下注射；间隔两周后将TM与等体积弗氏不完全佐剂充分混合并对兔加强免疫。加强免疫三次后，取少量兔耳动脉血清检测其效价；若效价未达到要求，冲击免疫1次，5天后颈动脉采血。取得的血液在4℃静置至少16h后，收集血清，分装并冻存于80℃备用。免疫过程委托厦门大学药学院实验动物中心完成。

褶牡蛎TM-α和TM-β经大量表达，平衡液流洗去杂蛋白后，于含100mM咪唑洗脱液处洗脱，得到纯化后的单一条带，TM-α如图4A所示，TM-β如图4B所示。Western blot结果如图4C所示，纯化得到的蛋白组分与兔抗太平洋牡蛎TM多克隆抗体均有特异性条带，进一步表明纯化的蛋白为褶牡蛎TM。图4C中M为标准蛋白，泳道1为TM-β，泳道2为TM-α，泳道3为太平洋牡蛎TM，作为阳性对照，泳道4为BSA，作为阴性对照。

实施例3用于牡蛎过敏患者的致敏组分筛查的试剂盒

褶牡蛎致敏蛋白TM-α和TM-β与牡蛎过敏患者血清Dot blot分析

分别取2μg的BSA、TM-α和TM-β，点至硝酸纤维素膜上(每格0.7×0.7cm)，并静置晾干。将晾干后的硝酸纤维素膜浸泡于5％的脱脂奶中，置于摇床上室温孵育1.5h。封闭后硝酸纤维素膜用TBST(17g NaCl，20mL 1M Tris-HCl，pH 8.0，1mL Tween-20，溶于2L蒸馏水中)洗3次，每次5min。将硝酸纤维素膜分别置于用TBST以1:1稀释的11位牡蛎过敏患者血清及2位健康人血清中孵育过夜。次日，将硝酸纤维素膜取出，于TBST中洗5遍，每次5min，再用TBST以1:2×10

褶牡蛎致敏蛋白TM-α和TM-β激活牡蛎过敏患者嗜碱性粒细胞试验

牡蛎过敏患者全血或健康人全血与RPMI培养液混匀，分别加入PBS(2.9gNa

TM-α和TM-β刺激嗜碱性粒细胞的流式结果分别如图6(A-B)所示，TM-α和TM-β激活的CD63与CD203c的刺激指数分析如图7所示。与健康人全血相比，TM-α和TM-β均能显著上调8名牡蛎过敏患者的CD63及CD203c分子的表达水平，表明TM-α和TM-β能显著激活牡蛎过敏患者的嗜碱性粒细胞，从效应细胞层面证实了TM-α和TM-β致敏潜力。

综上所述，本申请利用分子克隆技术获得了褶牡蛎致敏蛋白TM两种亚型TM-α和TM-β的开放阅读框，致敏蛋白TM-α和TM-β可与牡蛎过敏患者血清IgE特异性结合，能够激活牡蛎过敏患者的嗜碱性粒细胞。获得的TM-α和TM-β可用于制备牡蛎过敏患者的致敏蛋白组分筛查的试剂盒。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。