一种具有抗炎功效的积雪草提取方法及应用

技术领域

本发明涉及化妆品的技术领域，特别涉及一种具有抗炎功效的积雪草提取方法及应用。

背景技术

皮肤是保护人体免受外界伤害与刺激的重要的保护层。当外来的刺激给人体造成损伤时，皮肤的免疫系统会启动信号，释放出各种各样的炎症因子以及组胺，引起血流加快、细胞的通透性增加，导致皮肤出现的感官的感觉如面部紧绷感、刺痛感、灼烧感、麻刺感、疼痛以及持续性痒感；症状表现为红斑、皮肤潮红、水肿等不适感。过敏信号会告知皮肤对外界的损伤已经超出的皮肤自身的承受能力，告诫皮肤要远离刺激等伤害，给皮肤一个缓冲缓解的机会，避免造成更大的伤害。

导致肌肤敏感与过敏的主要原因是皮肤的炎症因子与组胺的释放。其中皮肤炎症因子的激发会导致一系列的皮肤过敏反应，红斑、水肿、灼烧、疼痛、瘙痒等，给人极其不舒服与极差的观感，同时由于为了减少瘙痒，不断的抓挠会导致恶性循环以及深入到真皮层，会引起表达色素沉积和瘢痕。炎症因子还会加速肌肤的老化，即所谓的炎症老化。

积雪草是伞形科植物积雪草(Centellaasialica)的干燥全草，为多年生匍匐草本植物，常卷缩成团状，其茎细长，结节生根。始载于《神农本草经》，表明其在我国已经有悠久的药用历史。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明的目的是提供一种具有抗炎功效的积雪草提取方法及应用。为了实现根据本发明的上述目的和其他优点，提供了积雪草中提取出的积雪草提取物在制备抗炎功效的护理品中的应用，所述积雪草提取物包含积雪草总苷。

优选的，一种具有抗炎功效的积雪草提取方法，包括：

S1、将积雪草全草粉碎至细粉状态，投入提取罐中；

S2、通过在提取罐中加入沸水进行搅拌提取；

S3、将步骤S2通过压滤后，滤液上树脂柱吸附，用乙醇将有效成分从树脂柱洗脱出来；

S4、再将滤液上脱色树脂柱，对滤液进行脱色，脱色液经刮板浓缩器浓缩至稠膏；

S5、转至D级洁净区的微波干燥箱进行烘干，烘干后再经粉碎、过筛、总混，即得积雪草提取物粉末产品。

优选的，所述步骤S1中将积雪草全草粉碎至60目细粉，且将每个提取罐中投入900kg细粉。

优选的，步骤S2中在提取罐中加入4.5吨沸水进行搅拌提取2小时。

优选的，步骤S3中乙醇的用量为60％-75％。

优选的，步骤S4中经刮板浓缩器中的温度为55～75℃，真空＞0.06Mpa，稠膏的相对密度为1.05～1.15，温度为75℃。

优选的，步骤S5中微波干燥箱的温度为30～65℃，真空＞0.06Mpa，选择过筛粉末为100目。

优选的，提取的积雪草总苷的质量分数为1％-99％。

优选的，提取的积雪草总苷的质量分数为1％-30％。

优选的，提取的积雪草总苷的质量分数为15％-30％

本发明与现有技术相比，其有益效果是：通过本发明的工艺提取出的积雪草提取物，包含了积雪草总苷，其总苷中的羟基积雪草苷与积雪草苷的比例可以任意比例做提取组合，来获得不同抗炎功效体现的积雪草提取物，作为皮肤调理剂，添加在针对于敏感性肌肤或易发生炎症性肌肤的护理产品中，形成具有不同抗炎功效强度的产品，特别是有预防皮肤炎症的功效。同时，通过本发明的提取工艺制备出的积雪草提取物具有比较高的纯度，安全无刺激性，特别是可以应用在儿童护理产品中，对儿童的脆弱敏感肌肤具有很好的抗炎效果。

附图说明

图1为根据本发明的一种具有抗炎功效的积雪草提取方法及应用提取的积雪草总苷80％样品的急性毒测试结果代表性图；

图2为根据本发明的具有抗炎功效的积雪草提取方法及应用的工艺流程图；

图3为根据本发明的一种具有抗炎功效的积雪草提取方法制备的积雪草总苷80％促进修复效果的斑马鱼筛查结果代表性图片，分别为促进修复效果不显著(0％修复促进率)对比图、促进修复效果显著(15％修复促进率)、以及促进修复效果显著(28％修复促进率)图；

图4为根据本发明的一种具有抗炎功效的积雪草提取方法及应用提取的积雪草总苷80％样品的修复数据图的测试结束时斑马鱼胚胎拍照图；

图5为根据本发明的一种具有抗炎功效的积雪草提取方法及应用的积雪草总苷80％的样品的色谱图；

图6为根据本发明的一种具有抗炎功效的积雪草提取方法及应用的斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制测试流程图；

图7为根据本发明的一种具有抗炎功效的积雪草提取方法及应用的斑马鱼胚胎尾部中性粒细胞代表性图；

图8为根据本发明的一种具有抗炎功效的积雪草提取方法及应用的积雪草总苷10％与80％的色谱图；

图9为根据本发明的一种具有抗炎功效的积雪草提取方法及应用的实验数据柱状图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

积雪草中提取出的积雪草提取物在制备抗炎功效的护理品中的应用，所述积雪草提取物包含积雪草总苷。

通过一种具有抗炎功效的积雪草的提取工艺提取出的积雪草提取物-积雪草总苷80％分别进行以下安全性和抗炎功效性的测试：

一、鸡胚绒毛尿囊膜试验(SN/T 2329-2009)

1、测试项目

化妆品眼刺激性/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验

2、试验依据

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2329--2009《化妆品眼刺激性/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊试验》

3、试验材料

3.1鸡胚

9日龄白莱杭鸡SPF级受精鸡胚，购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，合格

证号 110321210100743813。

孵化条件：室温：21.5℃，相对湿度：48％，孵化温度：37.5℃，相对湿度：60％。

3.2仪器与材料

主要试剂：NaCl：20201207

SDS：0606C276

主要仪器：孵化箱：2015SW0004

体式显微镜：2015SW0055

混匀仪：2015SW0035

3.3测试样品

采用反应时间法进行检测。

实验另设置阴性对照：0.9％氯化钠溶液，阳性对照：1％SDS，采用反应时间法进行检测。

4试验方法

CAM制备：9日龄鸡胚进行照蛋检查，用牙科锯齿弯镊剥去气室部分的蛋壳，暴露白色蛋膜，小心操作不破坏蛋膜完整性。用吸管滴一滴0.9％氯化钠(NaCl)溶液使蛋膜湿润，小心用镊子去除内膜，保证血管膜不受损。此时再次观察血管系统的结构，并对其完整性和是否适宜用于试验做出判断。

实验前测试：取2只鸡胚进行，检查此批鸡胚的反应性，作用时间限定5min内。

预试验：用3只鸡胚，取0.3mL的受试物，确保至少50％的CAM表面被受试物覆盖。受试物作用后立即观察CAM反应情况至5min止，记录观察结果。确定受试物是否适合用本方法试验，及确定正式试验采用反应时间法或终点评价法进行试验。

终点评价法：取0.3mL或0.3g受试物作用于CAM，确保至少50％的CAM表面被受试物覆盖。作用3min后，用生理盐水轻轻冲洗CAM的受试物，冲洗后约30s后观察每种毒性效应变化的程度。

反应评价法：取0.3ml受试物作用于CAM，确保至少50％的CAM表面被受试物覆盖。观察CAM反应情况，并记录作用5min内每种毒性效应出现的时间。每个样品设置6只鸡胚，并设置阴性对照和阳性对照各1只鸡胚。

结果评价：终点评分法(end point score，ES)，采用终点评价法进行的试验，根据毒性效应变化程度评分，应用式(1)计算终点评分(ES)：

ES＝6只鸡胚观察到的出血、凝血和血管融解程度得分的总和..............(1)

根据计算的ES数值按表5.1对受试物眼刺激性进行分类。

表4.1终点评分法结果评价

刺激评分法(irritation score，IS)，采用反应时间法进行的试验，应用式(2)计算刺激评分(IS)，

结果保留小数点后两位：

IS＝[(301-secH)×5]/300+[(301-secL)×7]/300+[(301-secC)×9]/300.....................(2)

式中：

sec H(出血时间hemorrhage time)---CAM膜上观察到开始发生出血的平均时间，单位为秒(s)；

sec L(血管融解时间vessel lysis time)---CAM膜上观察到开始发生血管融解的平均时间，单位为秒(s)；

sec C(凝血时间coagulation time)---CAM膜上观察到开始出现凝血的平均时间，单位为秒(s)。

根据计算的IS数值按表4.2对受试物眼刺激性进行分类。

表4.2刺激评分法结果评价

5试验结果

5.1试验条件接受标准

5.2结果评价

二、体外抗炎评价

测试方法：小鼠巨噬细胞抗炎测试

1、实验材料

1.1细胞系：RAW 264.7细胞

1.2培养基：含10％FBS的DMEM培养基，2-8℃保存2周

1.3测试条件：温度37±0.5℃，湿度＞90％，5％CO2浓度

1.4溶液及对照：待测物质(TA)：用培养液稀释至测试浓度

MTT溶液：5mg/mL

LPS(Sigma):用超纯水稀释至1mg/mL，-20℃保存

1.5试剂盒：

IL-6(Lot:No.13215961112)；

TNF-α(Lot:No.24115991112)；

ELISA试剂盒：IL-1α(Lot:2019/08)。

2、实验步骤

2.1细胞毒性筛查

2.1.1将培养的细胞接种于96孔板中，0.8-1.0×104个/100μL/孔，然后，置于培养箱18-24h。

2.1.2去除原培养液，每孔加入100μL不同浓度样品稀释液培养箱中暴露24±0.5h。

2.1.3各孔中加入20μLMTT溶液，在37℃下孵育3h。然后去除MTT溶液，各孔中加入100μLDMSO，避光振荡10-15min后在570nm波长下测定吸光度值。

2.1.4数据分析：以对照组为100％，计算各组相对细胞活性，选取适宜浓度用作后续测试。

2.2抗炎测试

2.2.1常规培养细胞，将细胞以密度为2.0-3.0×105个/mL孔接种于12孔板，返回培养箱培养18-24h。

2.2.2取出培养板，弃去孔中原培养板，样品组每孔加入1mL含不同浓度的测试样品和LPS(10μg/mL)的培养液，模型组加入以LPS(10μg/mL)作为刺激物的培养液，对照组加入培养液，培养24±1h。

2.2.3去除原培养液，加入1mL新鲜培养液，继续培养24±1h。

2.2.4收集上清液，-80℃保存，细胞因子采用ELISA试剂盒进行测定。

2.2.5数据分析：数据以均值±标准差表示，数据采用SPSS进行分析，如果P＜0.05考虑差异具有统计学意义。

3、试验结果

3.1细胞毒性结果

3.2不同组别IL-6差异比较

表2.不同组别IL-6差异比较

*：与模型组相比，差异具有统计学意义。

3.3不同组别TNF-α差异比较

表3.不同组别TNF-α差异比较

*：与模型组相比，差异具有统计学意义。

3.4不同组别IL-1α差异比较

表4.不同组别IL-1α差异比较

*：与模型组相比，差异具有统计学意义。

在3.2测试条件下，模型组与对照组相比，IL-6含量升高(p＜0.05)；0.02mg/mL、0.1mg/mL的“积雪草提取物”样品组与模型组相比，IL-6含量降低(p＜0.05)，而0.004mg/mL样品组与模型组相比，IL-6无明显差异(p＞0.05)。

在3.3测试条件下，模型组与对照组相比，TNF-α含量升高(p＜0.05)；0.02mg/mL、0.1mg/mL的“积雪草提取物”样品组与模型组相比，TNF-α含量升高(p＜0.05)，而0.004mg/mL样品组与模型组相比，TNF-α无明显差异(p＞0.05)。

在3.4测试条件下，模型组与对照组相比，IL-1α含量升高(p＜0.05)；0.1mg/mL的“积雪草提取物”样品组与模型组相比，IL-1α含量降低(p＜0.05)，而0.004mg/mL、0.02mg/mL样品组与模型组相比，IL-1α无明显差异(p＞0.05)。

参照图1-9，一种具有抗炎功效的积雪草提取方法，包括：

S1、将积雪草全草粉碎至细粉状态，投入提取罐中；

S2、通过在提取罐中加入沸水进行搅拌提取；

S3、将步骤S2通过压滤后，滤液上树脂柱吸附，用乙醇将有效成分从树脂柱洗脱出来；

S4、再将滤液上脱色树脂柱，对滤液进行脱色，脱色液经刮板浓缩器浓缩至稠膏；

S5、转至D级洁净区的微波干燥箱进行烘干，烘干后再经粉碎、过筛、总混，即得积雪草提取物粉末产品。

进一步的，所述步骤S1中将积雪草全草粉碎至60目细粉，且将每个提取罐中投入900kg细粉。

进一步的，步骤S2中在提取罐中加入4.5吨沸水进行搅拌提取2小时。

进一步的，步骤S3中乙醇的用量为60％-75％。

进一步的，步骤S4中经刮板浓缩器中的温度为55～75℃，真空＞0.06Mpa，稠膏的相对密度为1.05～1.15，温度为75℃。

进一步的，步骤S5中微波干燥箱的温度为30～65℃，真空＞0.06Mpa，选择过筛粉末为100目。

通过以上工艺可以制得从5％-95％任意比例范围的积雪草提取物中的总苷溶液或粉末。

实施例1

将上述实施例制得的积雪草总苷80％进行以下测试：

一、高纯度的积雪草提取物的色谱图谱。

由图可分析出，积雪草总苷80％由大约60％左右的羟基积雪草苷、20％左右的积雪草苷组成以及大约20％提取物其他组分组成。

二、急性毒测试--急性毒物质筛查

如附图1，为急性毒测试结果代表性图片。由测试结果显示，正常斑马鱼胚胎急性毒最低同类型样品：测试浓度为6.7克/升。

2、测试结果

注释：

急性毒测试：

1.LC

2.LC

3.急性毒测试驻留产品时，安全风险所对应的浓度是样本的150倍稀释浓度，因此建议可添加量为(LC

三、透明质酸酶抑制率测试

1、检验原理

透明质酸是皮肤细胞外基质的重要组成成分，在维持细胞外基质体积及皮肤正常生理功能方面有重要作用。透明质酸酶是一种能水解透明质酸的酶，与大多数由IgE介导的I型和T细胞介导的IV型过敏反应有关，此外，透明质酸的水解产物对皮肤炎症反应起促进作用。抑制透明质酸酶活性可保证皮肤透明质酸含量和功能正常。

本试验方法为体外法，主要通过评估待测样品对透明质酸酶活性的抑制率来表征舒缓功效，适用于评估通过抑制透明质酸酶活性而达到舒缓效果的化妆品。

2、检验方法

(1)检验流程

在反应管中加入酶和CaCl

(2)结果计算

透明质酸酶抑制率(％)＝[1-(A-B)/(C-D)]×100％

式中：A为实验组吸光度

B为实验空白组吸光度

C为对照组吸光度

D为空白组吸光度

(3)检验结果

备注：p＜0.05说明与阴性对照组相比有统计学差异，p＞0.05说明与阴性对照组相比无统计学差异。

(4)实验结论

根据检验结果：

①阳性对照组的浓度为5mg/mL时，其对透明质酸酶活性的抑制率≥90％，说明反应体系有效；

②待测样品组浓度为25％(v/v)时，其对透明质酸酶活性的抑制率约为56.12％，与阴性对照组相比具有统计学差异(p＜0.05)，表明该样品具有一定程度的舒缓效果。

四、促进修复效果筛查——斑马鱼胚胎尾鳍修复促进测试

1、实验原理

哺乳动物的伤口愈合涉及多个步骤，包括血液凝固，发炎，表皮形成，血管新生及肉芽组织形成和成熟。斑马鱼的伤口愈合的主要步骤(除纤维蛋白凝块形成外)和原理，跟哺乳动物一样。斑马鱼尾鳍损伤后，骨骼和尾鳍均会再生。皮肤细胞产生Sonic hedgehog和FGF来促进细胞增殖，从而调节再生过程。斑马鱼胚胎在伤口愈合方面，跟成年斑马鱼具有相似的细胞和分子调控机制。因此选用个体小的斑马鱼胚胎，方便于显微镜下拍照，及测量斑马鱼胚胎尾鳍修复水平，通过测试比较样品处理组和模型对照组的斑马鱼胚胎尾鳍修复水平变化，计算促进修复率以评价原料或产品的促进修复效果。

2、实验方法

(1)受试生物

应用来源可靠(如中国国家斑马鱼资源中心)的野生型AB品系斑马鱼(Daniorerio)产卵测试。亲鱼应具有较好的繁殖能力–鱼龄以6～12月最佳。传代尽量使用侧交以保持遗传多样性，纯品系亲鱼繁殖5代后需更换新一批亲鱼。亲鱼不应该有明显可见的感染和疾病特征，且在2个月内没有经历过药物治疗。在繁殖产卵测试前，亲鱼应在引入实验室后驯养14天以上。

(2)养殖要求

A.养殖水温宜控制在26～28.5℃，室内温度建议控制在20～25℃。

B.养殖密度宜控制在每升水1～2条鱼，以及每日固定的12～16h光照，且需保持良好的过滤系统。

C.每天至少喂食2次，包括至少1次丰年虾(Artemia salina)幼虫，喂食间隔在3小时以上，避免过量喂食影响水质和清洁度。

(3)产卵要求

A.如用产卵缸收集鱼卵，将雄鱼和雌鱼以2：1的比率为宜在产卵前一天关灯前1～2h放进产卵缸中。由于斑马鱼偶尔不产卵，建议同时准备多个产卵缸备用。

B.为避免基因偏差，将最少3个产卵缸中收集的鱼卵混合再进行挑选备用。若用养殖鱼缸收集鱼卵，收卵盒在产卵前一天关灯前或产卵当天开灯前放进要收集鱼卵的养殖鱼缸中。

C.为避免鱼卵被成鱼所食，收卵盒用惰性网覆盖。

D.交配、产卵和受精在开灯后大约30min内完成，届时可把收卵盒移出鱼缸。

E.鱼卵从收卵盒取出后，建议用鱼胚胎培养液清洁鱼胚胎。

F.挑选健康的斑马鱼胚胎，并以200μL鱼胚胎培养液中不超过1粒鱼胚胎的密度于28℃培养至受精后3天。

3、仪器和设备

(1)斑马鱼养殖设备

设备需配有温控装置，水循环和过滤装置，养殖容器用玻璃或常见食品级PC材质制成。可采用通用斑马鱼养殖设备或按实验室需求配备鱼缸(如长宽高45cm×45cm×30cm)。

(2)产卵盒/缸

由玻璃、不锈钢或其它惰性材料制成，配备网筛(网格大小为2mm×2mm，由不锈钢或多项材料组成用来保护鱼卵)。

(3)水质监测设备

pH计、溶解氧测定仪、盐度计(电导率测定仪)。

(4)分析天平

精度0.1mg。

(5)显微镜

配带照相系统，最大放大倍数应大于80倍的体式显微镜。

(6)测试容器

测试容器：玻璃或聚苯乙烯测试容器(如96孔板，培养皿)。如测试物可能吸附于聚苯乙烯容器时(如非极性化学品)，应选用惰性材料(如玻璃)来减少吸附。

(7)恒温箱

精度±1℃。

(8)丰年虾孵化器

设备需配有孵化桶，气管，气量调节阀，气泵截止开关和止逆阀装置。

(9)其他常规测试仪器和设备

移液管、离心管、玻璃容器(如烧杯、容量瓶等)、旋涡混合仪、超声水浴锅、离心机、低温冰箱、可调节移液器和吸头、四号镊子。

4、主要试剂与耗材

(1)水

符合GB/T 6682规定。

(2)甲醇、二甲基亚砜、乙醇等助溶剂，分析纯级别。

(3)亲鱼养殖用水

称取4g海盐溶于10L水配制而成，盐度为0.25～0.50‰，电导率为500～800μS/cm，溶解氧80％饱和度，pH值6.5～8.5，硬度30～300mg/L(以碳酸钙计)。

(4)丰年虾(Artemia salina)卵

丰年虾休眠卵需干燥避光冷藏。称取约15g海盐溶于1L水配制丰年虾卵孵化水，密度以不超过4g/L丰年虾卵为宜。

(5)鱼胚胎培养液

称取2940mg无水氯化钙，1233mg七水硫酸镁，630mg碳酸氢钠，55mg氯化钾溶于10L水配制而成。pH值6.5～8.5。化学品均为分析纯级别。

(6)三卡因溶液

称取200mg三卡因溶于48.95mL水。4℃储存。30日内有效。

(7)熟地黄提取物溶液

称取0.5g熟地黄提取物溶于5mL蒸馏水配制成阳性对照溶液储存液。4℃储存。1个月内有效。

工作液为用鱼胚胎培养液将阳性对照溶液储存液稀释100倍，使用前新鲜配制。

5、受试物准备

1)水溶性测试品：可用鱼胚胎培养液直接将受试物溶解配制成测试溶液。

6、测试步骤

如附图2所示，以下测试步骤是96-孔板测试指引。如应用更大的测试容器(如培养皿)，测试指引需做相应调整。挑选健康的受精后3天大的斑马鱼胚胎。

(1)测试分组

测试需设定模型对照组(鱼胚胎培养液)、阳性对照组(熟地黄提取物溶液)和受试物组(受试物)。

(2)模型对照组设置

随机挑选24粒切除尾鳍的鱼胚胎，转移至96-孔板中，每孔含一粒鱼胚胎和0.2mL鱼胚胎培养液。

(3)阳性对照组设置

随机挑选24粒切除尾鳍的鱼胚胎，转移至96-孔板中，每孔含一粒鱼胚胎和0.2mL熟地黄提取物溶液(配制方法见4-(7))。

(4)受试物处理

随机挑选24粒切除尾鳍的鱼胚胎，转移至96-孔板中，每孔含一粒鱼胚胎和0.2mL受试物溶液。放置于28±1℃恒温箱中48±1h。

(5)样本的显微分析

于立体显微镜下对鱼胚胎按统一的拍照参数进行拍照。

(6)数据和结果计算

用分析软件如Image J打开照片，量度每粒鱼胚胎的再生尾鳍(见实验结果图)

7、结果计算

计算修复促进率：

修复促进率＝(C-T)/C×100％------------(1)

(1)式中：

T—受试物处理组鱼胚胎尾鳍修复水平；

C—模型对照组鱼胚胎尾鳍修复水平；

对受试物处理组鱼胚胎尾鳍修复水平和模型对照组鱼胚胎尾鳍修复水平进行双尾T检验，取得p值。

8、测试有效性验证

(1)测试判定

各测试组暴露完成后死亡率低于10％(LC

(2)测试要求

每批次测试须设置阳性对照组，要求每批次测试阳性对照组的尾鳍修复水平显著(p<0.05)高于模型对照组。

9、结果报告

(1)修复促进率

受试物在对应测试浓度下对斑马鱼胚胎尾鳍修复促进率。

(2)评价

评价受试物促进修复的能力，分析受试物处理组与模型对照组的检测值是否具有统计学差异(p<0.05)。

对于受试物修复促进率的表示，应包含受试浓度。

10、结果相关性解读

在修复促进率为正数且具有统计学差异(p<0.05)情况下，测试结果可作为受试物具有促进修复效果的支持证据，但不替代人体功效测试。

11、测试结果

注释：

1.损伤模型：尾鳍被切除的斑马鱼胚胎用作损伤模型。

2.斑马鱼胚胎尾鳍修复促进率＝[(样品处理组斑马鱼胚胎尾鳍修复水平–模型对照组斑马鱼胚胎尾鳍修复水平)100/模型对照组斑马鱼胚胎尾鳍修复水平]％。

3.p值为样品处理组斑马鱼胚胎尾鳍修复水平和模型对照组斑马鱼胚胎尾鳍修复水平进行T-Test分析所得，一般定为p<0.05具有统计学显著差异。

4.根据样品对斑马鱼胚胎尾鳍修复促进率和促进率的统计学差异，对测试样本修复效果进行评价，分为显著(促进率为正数及p<0.05)和不显著(促进率为负数或p＝0.05)。

5、促进修复效果筛查结果代表性图片如附图3

五、舒缓功效：斑马鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制测试

1、实验原理

斑马鱼胚胎的中性粒细胞和人体中性粒细胞在形态、生化和生理功能上高度相似。中性粒细胞是在损伤或病菌入侵部位第一批出现的白细胞，作用于清除感染或有害物质。应用硫酸铜诱导斑马鱼胚胎侧线区域神经丘细胞损伤而引起中性粒细胞聚集的模型进行测试，比较受试物处理组和模型对照组的鱼胚胎侧线区域的中性粒细胞的数量变化，计算中性粒细胞抑制率以评价原料、配方或产品的舒缓功效。

2、仪器和设备

2.1斑马鱼养殖设备

设备需配有温控装置，水循环和过滤装置，养殖容器用玻璃或常见食品级PC材质制成。可采用通用斑马鱼养殖设备或按实验室需求配备鱼缸(如长宽高45cm×45cm×30cm)。

2.2产卵盒/缸

由玻璃、不锈钢或其它惰性材料制成，配备网筛(网格大小为2mm×2mm，由不锈钢或多项材料组成用来保护鱼卵)。

2.3水质监测设备

pH计、溶解氧测定仪、盐度计(电导率测定仪)。

2.4分析天平

精度0.1mg。

2.5显微镜

配带照相系统，最大放大倍数应大于80倍的体式显微镜。

2.6测试容器

测试容器：玻璃或聚苯乙烯测试容器(如6孔板，培养皿)。如测试物可能吸附于聚苯乙烯容器时(如非极性化学品)，应选用惰性材料(如玻璃)来减少吸附。

2.7恒温箱

精度±1℃。

2.8丰年虾孵化器

设备需配有孵化桶，气管，气量调节阀，气泵截止开关和止逆阀装置。

2.9其他常规测试仪器和设备

移液管、离心管、玻璃容器(如烧杯、容量瓶等)、旋涡混合仪、超声水浴锅、离心机、低温冰箱、可调节移液器和吸头。

3、主要试剂与耗材

3.1水

符合GB/T 6682规定。

3.2甲醇、二甲基亚砜、乙醇等助溶剂

分析纯级别。

3.3亲鱼养殖用水

称取4g海盐溶于10L水配制而成，盐度为0.25～0.50‰，电导率为500～800μS/cm，溶解氧80％饱和度，pH值6.5～8.5，硬度30～300mg/L(以碳酸钙计)。

3.4丰年虾(Artemia salina)卵

丰年虾休眠卵需干燥避光冷藏。称取约15g海盐溶于1L水配制丰年虾卵孵化水，密度以不超过4g/L丰年虾卵为宜。

3.5鱼胚胎培养液

称取2940mg无水氯化钙，1233mg七水硫酸镁，630mg碳酸氢钠，55mg氯化钾溶于10L水配制而成。pH值6.5～8.5。化学品均为分析纯级别。

3.6硫酸铜溶液

用水配制160mg/L五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)储存液。室温储存。

工作液浓度为0.16mg/L，用鱼胚胎培养液稀释，使用前新鲜配制。

3.7吲哚美辛溶液

用二甲基亚砜配制36mg/L吲哚美辛储存液。冷藏。

工作液浓度为0.0036mg/L吲哚美辛，用鱼胚胎培养液稀释，使用前新鲜配制。

3.8多聚甲醛

用磷酸缓冲盐溶液(PBS)配制含有4％多聚甲醛和0.8％氢氧化钠(NAOH)，pH为7.2～7.4的溶液。冷藏。

3.9 50％和70％酒精溶液

用水配制50％和70％酒精溶液。

3.10苏丹黑染色液

苏丹黑储存液：用70％酒精配制0.4％苏丹黑储存液。冷藏。

苯酚溶液：将8g苯酚溶于15mL乙醇溶液，将0.3g Na2HPO4·12H2O溶解于50mL水中，然后将二种溶液混合配制成苯酚溶液。室温储存，半年内有效。

苏丹黑染色液是将900μL 70％酒精溶液，100μL苏丹黑儲存液和1μL苯酚溶液混合而成。用前新鲜配制。

3.11PBST

配制0.04％ Triton X-100于PBS溶液中。室温储存。

3.12漂白溶液

用水配制含有3％ H2O2和1％ KOH的溶液。使用前新鲜配制。

3.13清透液1

用水配制含有20％甘油和0.25％KOH的溶液。室温保存。

3.14清透液2

用水配制含有50％甘油和0.25％KOH的溶液。室温保存。

4、实验方法

4.1受试生物

应用来源可靠(如中国国家斑马鱼资源中心)的野生型AB品系斑马鱼(Daniorerio)产卵测试。亲鱼应具有较好的繁殖能力–鱼龄以6～12月最佳。传代尽量使用侧交以保持遗传多样性，纯品系亲鱼繁殖5代后需更换新一批亲鱼。亲鱼不应该有明显可见的感染和疾病特征，且在2个月内没有经历过药物治疗。在繁殖产卵测试前，亲鱼应在引入实验室后驯养14天以上。

4.2养殖要求

4.2.1养殖水温宜控制在26～28.5℃，室内温度建议控制在20～25℃。

4.2.2养殖密度宜控制在每升水1～2条鱼，以及每日固定的12～16h光照，且需保持良好的过滤系统。

4.2.3每天至少喂食2次，包括至少1次丰年虾(Artemia salina)幼虫，喂食间隔在3小时以上，避免过量喂食影响水质和清洁度。

4.3产卵要求

4.3.1如用产卵缸收集鱼卵，将雄鱼和雌鱼以2：1的比率为宜在产卵前一天关灯前1～2h放进产卵缸中。由于斑马鱼偶尔不产卵，建议同时准备多个产卵缸备用。

4.3.2为避免基因偏差，将最少3个产卵缸中收集的鱼卵混合再进行挑选备用。若用养殖鱼缸收集鱼卵，收卵盒在产卵前一天关灯前或产卵当天开灯前放进要收集鱼卵的养殖鱼缸中。

4.3.3为避免鱼卵被成鱼所食，收卵盒用惰性网覆盖。

4.3.4交配、产卵和受精在开灯后大约30min内完成，届时可把收卵盒移出鱼缸。

4.3.5鱼卵从收卵盒取出后，建议用鱼胚胎培养液清洁鱼胚胎。

4.3.6挑选健康的斑马鱼胚胎，并以200μL鱼胚胎培养液中不超过1尾鱼胚胎的密度于28±1℃培养至受精后3天。

5、受试物准备

5.1化妆品原料

5.1.1水溶性原料：可用鱼胚胎培养液直接将受试物溶解配制成测试溶液。

5.1.2非水溶性原料：可选常用溶剂如甲醇、二甲基亚砜、乙醇等助溶。如将受试物和有机溶剂按1：1(重量g：体积mL)混匀，超声处理10min，然后加入鱼胚胎培养液配制成所需浓度，震荡30s后于6500×g离心10min。取上清液进行测试。

5.2化妆品产品

5.2.1水溶性产品：可用鱼胚胎培养液直接将受试物溶解配制成测试溶液。

5.2.2非水溶性产品：可选常用溶剂如甲醇、二甲基亚砜、乙醇等助溶。如将受试物和有机溶剂按1：1(重量g：体积mL)混匀，超声处理10min，然后加入鱼胚胎培养液配制成所需浓度，震荡30s后于6500×g离心10min。取上清液进行测试。

5.3注意事项

受试物测试溶液浓度需保证对斑马鱼胚胎的死亡率10％(没有心跳特征的胚胎界定为死亡)。测试时可根据需要设置多个浓度组。

6、测试步骤

以下测试步骤是3cm培养皿测试指引。测试流程可参考附录A图A。

挑选健康的受精后3天大的斑马鱼胚胎。

6.1测试分组

测试需设定模型对照组(硫酸铜工作液)、阳性对照组(硫酸铜工作液+吲哚美辛工作液)和受试物组(硫酸铜工作液+受试物)。

6.1.1模型对照组设置

随机挑选24尾鱼胚胎，转移至3cm培养皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸铜的鱼胚胎培养液(配制方法见3.6)。

6.1.2阳性对照组设置

随机挑选24尾鱼胚胎，转移至3cm培养皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸铜和0.0036mg/L吲哚美辛的鱼胚胎培养液(配制方法见3.6-3.7)。

6.1.3受试物处理

随机挑选24尾鱼胚胎，转移至3cm培养皿中，加入5mL含0.16mg/L五水硫酸铜和受试物的鱼胚胎培养液(配制方法见3.6和5.1-5.3)。

放置于28±1℃恒温箱中培养40～45min。

6.2鱼胚胎固定染色

将每测试组鱼胚胎于多聚甲醛中固定至少1h后，用PBST(配制方法见6.11)处理鱼胚胎3次，每次5min，然后用50％乙醇(配制方法见3.9)处理3min。

用苏丹黑染色溶液(配制方法见3.10)对鱼胚胎进行室温染色1h后，用70％乙醇(配制方法见3.9)浸洗4次，每次5min，然后用PBST处理2次，每次5min。用漂白溶液处理鱼胚胎10min，如在试管里处理，则需保持盖子打开。然后用70％乙醇溶液处理5min，PBST处理1min，用清澈液1(配制方法见3.13)处理15min，清澈液2(配制方法见3.14)处理10min，再用PBST处理3min。

6.3样本的显微分析

将鱼胚胎侧身摆放。然后放到体式显微镜下对鱼胚胎尾部进行拍照。

6.4数据和结果计算

计数每尾鱼胚胎从肛门起四分之三尾部侧线区域(见附录B图B)的中性粒细胞数目。

7、结果计算

计算中性粒细胞聚集抑制率：

抑制率＝(C-T)/C×100％------------(1)

(1)式中：

T—受试物处理组鱼胚胎中性粒细胞数目的平均值；

C—模型对照组鱼胚胎中性粒细胞数目的平均值；

对受试物处理组鱼胚胎中性粒细胞数目和模型对照组中性粒细胞数目进行双尾T检验，取得p值。

8、测试有效性验证

8.1测试判定

各测试组暴露完成后至少90％鱼胚胎存活，否则对应测试组结果无效。

8.2测试要求

每批次测试须设置阳性对照组，要求每批次测试阳性对照组鱼胚胎中性粒细胞聚集抑制率为正数且p<0.05。

9、结果报告

9.1中性粒细胞聚集抑制率

受试物在对应测试浓度下对中性粒细胞的聚集抑制率。

9.2评价

评价受试物抑制中性粒细胞聚集的能力，分析受试物处理组与模型对照组的检测值是否具有统计学差异(p<0.05)。

10、结果相关性解读

在中性粒细胞聚集抑制率为正数且具有统计学差异(p<0.05)情况下，测试结果可作为受试物具有舒缓功效的支持证据。

如附图6-7，我们对积雪草总苷5％溶液、15％粉末、30％粉末对于不同添加比例同时做了以上斑马鱼中性粒细胞抑制的对比测试，以下为测试数据：

由数据可见，以一种具有抗炎功效的积雪草提取方法提取的积雪草提取物，在超过最小修复浓度以上时具有显著的舒缓修护的功效作用。

参照图8，本申请的提取方法提取出的积雪草提取物纯度高，无刺激性，而且积雪草提取物具有比较高的纯度。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的，对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。